Khảo Sát Chu Trình Nhiệt Khảo Sát Nồng độ Primer - Tài Liệu Text

1. Trang chủ >
2. Luận Văn - Báo Cáo >
3. Nông - Lâm - Ngư >

Khảo sát chu trình nhiệt Khảo sát nồng độ primer

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (692.01 KB, 44 trang )

4.2.2. Khảo sát chu trình nhiệt

Chúng tơi tiến hành khảo sát 4 chu trình nhiệt để tìm ra chu trình nhiệt thích hợp cho phản ứng PCR để khuếch đại đoạn rDNA-ITS của nấm R. solani với hai primerITS 4 và ITS 5 White và ctv. 1990.Bảng 4.1. Các chu trình nhiệt đƣợc khảo sát Chu trình 1Chu trình 2 Chu trình 3Chu trình 494oC: 3 phút 94oC: 30 giây 56oC: 1 phút 72oC: 1 phút 72oC: 7 phút 94oC: 3 phút 94oC: 1 phút 56oC: 45 giây 72oC: 1 phút 72oC: 7 phút 94oC: 3 phút 94oC: 30 giây 56oC: 45 giây 72oC: 1 phút 72oC: 7 phút 94oC: 3 phút 94oC: 1 phút 56oC: 30 giây 72oC: 1 phút 72oC: 7 phútChúng tôi đã nhận được kết quả thể hiện qua Hình 4.3.Hình 4.3. Ảnh điện di sản phẩm PCR với các chu trình nhiệt khác nhauA. Chu trình 1; B. Chu trình 2; C. Chu trình 3; D. Chu trình 4Kết quả điện di trên agarose cho thấy, cả 4 chu trình, chúng tơi đều khuếch đại được vùng rDNA-ITS của nấm R. solani. Sản phẩm có kích thước khoảng 700 bp.Tuy nhiên, ở chu trình 1, phần dư rất rõ bên dưới và có một băng mờ bên trên băng chính. Ở chu trình 4, mặc dù phần dư không thể hiện nhưng băng sản phẩm mờ hơnbăng sản phẩm của chu trình 2 và chu trình 3. Mặt khác, tỉ lệ thành công của phản ứng khi áp dụng chu trình 4 thấp tỉ lệ là 2 lần thành công trên 5 lần thực hiện. Giữa chu30 chukỳ 30chu kỳ30 chukỳ 30chu kỳ700bpA B C D700bpA B C Dtrình 2 và chu trình 3, chúng tơi quyết định chọn chu trình 2 vì chu trình 2 cho băng sản phẩm khuếch đại rõ nét hơn chu trình 3. Do đó, chúng tơi sử dụng chu trình nhiệtthứ 2 để tiến hành các thử nghiệm tiếp theo.

4.2.3. Khảo sát nồng độ primer

Những phần dư khơng mong muốn trong sản phẩm PCR Hình 4.3 được dự đốn có thể là do primer dư. Vì theo Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang 1999, nồng độprimer quá cao sẽ dẫn đến sự hình thành Primer – dimer và hiện tượng priming nhầm. Nên chúng tôi quyết định tiến hành khảo sát tìm nồng độ primer thích hợp cho phảnứng PCR khuếch đại đoạn rDNA-ITS của nấm R. solani. Chúng tôi khảo sát 3 nồng độ primer là 2 pmolµl, 1 pmolµl, và 0,4 pmolµl. Kết quả được thể hiện qua hình 4.4.A B CHình 4.4. Ảnh điện di sản phẩm PCR với các nồng độ primer khác nhauA. 2 pmolµl; B. 1 pmolµl; C. 0,4 pmolµlKết quả cho thấy, với primer có nồng độ 2 pmolµl, phần dư vẫn còn thể hiện rõ. Với primer có nồng độ 1 pmolµl, và 0,4 pmolµl, phần dư giảm hẳn xuống. Giữa hainồng độ primer 1 pmolµl, và 0,4 pmolµl, chúng tơi lựa chọn nồng độ 0,4 pmolµl để tiết kiệm primer.Như vậy, chúng tơi đã chọn được quy trình PCR để khuếch đại đoạn rDNA – ITS của nấm R. solani cho kết quả tốt nhất. Quy trình này được thể hiện qua Bảng 4.2 vàBảng 4.3.700bpBảng 4.2. Điều kiện cho phản ứng PCR Thành phần phản ứng Nồng độ đầu Nồng độ cuốiThể tíchPCR Buffer MgCl2dNTPs Primer ITS4Primer ITS5 Taq DNA polymeraseDNA khuôn mẫu Nước cất vô trùng10X 50 mM2 mM 10 pmolµl10 pmolµl 1UI100 ng 1X1,5 mM 0,2 mM0,4 pmolµl 0,4 pmolµl0,04 UI 2,5 µl0,75 µl 2 µl1 µl 1 µl1 µl 1 µlvừa đủ V 25 µlBảng 4.3. Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR Các bƣớc của phản ứngNhiệt độ Thời gianGiai đoạn khởi động Chạy chu kỳ 30 chu kỳTách DNA khuôn Ủ bắt cặpKéo dài Giai đoạn kết thúc94 C94 C56 C72 C72 C3 phút1 phút 45 giây1 phút 7 phút

4.2.4. Kết quả khuếch đại vùng rDNA-ITS của nấm R. solani

Xem Thêm

Tài liệu liên quan

• Sử dụng kỹ thuật rflp khảo sát sự đa dạng di truyền của nấm Rhizoctonia solani phân lập từ nhiều cây ký chủ khác nhau
  • 44
  • 882
  • 2

Tải bản đầy đủ (.pdf) (44 trang)

Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

(692.01 KB) - Sử dụng kỹ thuật rflp khảo sát sự đa dạng di truyền của nấm Rhizoctonia solani phân lập từ nhiều cây ký chủ khác nhau-44 (trang) Tải bản đầy đủ ngay ×