KHẢO SÁT THÀNH PHẦN DƯỠNG CHẤT, HOẠT TÍNH SINH HỌC ...

Trong y học dân gian, bồ công anh Việt Nam có vị ngọt, hơi đắng, tính hàn, có tác dụng thanh nhiệt giải độc, tiêu viêm tán kết và được sử dụng trong điều trị một số bệnh như: mụn nhọt, ă

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC THAM GIA XÉT GIẢI THƯƠNG HỘI NGHỊ “NGHIÊN CỨU KHOA HỌC TRẺ TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ”

NĂM 2018 DÀNH CHO SINH VIÊN

KHẢO SÁT THÀNH PHẦN DƯỠNG CHẤT, HOẠT TÍNH SINH HỌC

CỦA RỄ CÂY BỒ CÔNG ANH VIỆT NAM (Lactuca indica L.) VÀ ẢNH HƯỞNG

CỦA pH ĐẾN HOẠT TÍNH CỦA CAO

Thuộc nhóm ngành khoa học: Khoa học Tự nhiên (Hóa học)

a

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC THAM GIA XÉT GIẢI THƯƠNG HỘI NGHỊ “NGHIÊN CỨU KHOA HỌC TRẺ TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ”

NĂM 2018 DÀNH CHO SINH VIÊN

KHẢO SÁT THÀNH PHẦN DƯỠNG CHẤT, HOẠT TÍNH SINH HỌC

CỦA RỄ CÂY BỒ CÔNG ANH VIỆT NAM (Lactuca indica L.) VÀ ẢNH HƯỞNG

CỦA pH ĐẾN HOẠT TÍNH CỦA CAO

Thuộc nhóm ngành khoa học: Khoa học Tự nhiên (Hóa học)

Sinh viên thực hiện: Huỳnh Văn Lợi Giới tính: Nam

MỤC LỤC

MỤC LỤC i

DANH MỤC BẢNG BIỂU iv

DANH MỤC HÌNH v

DANH MỤC PHỤ LỤC vi

DANH MỤC VIẾT TẮT vii

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Lý do chọn đề tài 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1

1.3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 2

1.4 Thời gian và địa điểm 2

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Tổng quan về thực vật 3

2.1.1 Khái quát về cây bồ công anh 3

2.1.2 Giới thiệu về cây bồ công anh Việt Nam (Lactuca indica L.) 3

2.1.2.1 Danh pháp và phân loại 3

2.1.2.2 Đặc điểm thực vật 4

2.1.2.3 Sinh thái và phân bố 4

2.1.3 Tổng quan tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 5

2.1.3.1 Trong nước 5

2.1.3.2 Ngoài nước 5

2.2 Vài nét về các đối tượng gây bệnh 12

2.2.1 Các chủng khuẩn, nấm gây bệnh 12

2.2.1.1 Staphylococcus aureus 12

2.2.1.2 Bacillus subtilis 12

2.2.1.3 Lactobacillus fermentum 12

2.2.1.4 Salmonella enterica 12

2.2.1.5 Escherichia coli 12

2.2.1.6 Pseudomonas aeruginosa 13

2.2.1.7 Klebsiella pneumoniae 13

2.2.1.8 Candida albican 13

2.2.2 Các dòng tế bào ung thư 13

2.2.2.1 Tế bào ung thư cổ tử cung (HeLa) 13

2.2.2.2 Tế bào ung thư phổi (A549) 14

2.2.2.3 Tế bào ung thư tuyến tụy (PANC-1) 14

2.2.2.4 Tế bào ung thư gan (Hep-G2) 14

CHƯƠNG 3 CƠ SỞ LÝ THUYẾT MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM 15

3.1 Lựa chọn dung môi 15

3.2 Kỹ thuật chiết rắn-lỏng 16

3.2.1 Kỹ thuật chiết ngấm kiệt 16

3.2.2 Kỹ thuật chiết ngâm dầm 17

3.2.3 Kỹ thuật chiết bằng hệ thống chiết soxhlet 18

3.3 Kỹ thuật chiết lỏng-lỏng 19

3.4 Sắc ký lớp mỏng (Thin layer chromatography, TLC) 20

CHƯƠNG 4 PHƯƠNG PHÁP VÀ PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 22

4.1 Phương tiện 22

4.1.1 Dụng cụ 22

4.1.2 Hóa chất 22

4.2 Phương pháp nghiên cứu 24

4.2.1 Điều chế các cao phân đoạn 24

4.2.2 Khảo sát thành phần dưỡng chất 25

4.2.2.1 Xác định hàm lượng carotenoid 25

4.2.2.2 Xác định hàm lượng protein thô 26

4.2.2.3 Xác định hàm lượng xơ trung tính 27

4.2.2.4 Xác định hàm lượng xơ acid 28

4.2.2.5 Xác định hàm lượng khoáng tổng 29

4.2.2.6 Xác định hàm lượng phosphorus 29

4.2.3 Khảo sát hoạt tính sinh học 31

4.2.3.1 Khả năng kháng oxy hóa DPPH 31

4.2.3.2 Khả năng kháng khuẩn, nấm 32

4.2.3.3 Khả năng gây độc tế bào ung thư 33

4.2.4 Khảo sát ảnh hưởng của pH đến cao chiết 33

4.3 Xử lý số liệu 33

CHƯƠNG 5 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34

5.1 Kết quả 34

5.1.2.1 Khả năng kháng oxy hóa DPPH 37

5.1.2.2 Khả năng kháng khuẩn, nấm và gây độc tế bào ung thư 43

5.1.3 Khảo sát ảnh hưởng của pH đến các nhóm chất trong cao chiết 44

5.2 Thảo luận 45

CHƯƠNG 6 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 46

6.1 Kết luận 46

6.2 Kiến nghị 46

TÀI LIỆU THAM KHẢO 47

PHỤ LỤC 49

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 1 Tổng hợp các thành phần hóa học trong cây đã được phân lập 7

Bảng 2 Kết quả khảo sát hàm lượng carotenoid 34

Bảng 3 Kết quả khảo sát hàm lượng protein thô 35

Bảng 4 Kết quả khảo sát hàm lượng xơ trung tính 35

Bảng 5 Kết quả khảo sát hàm lượng xơ acid 35

Bảng 6 Kết quả khảo sát hàm lượng khoáng tổng 35

Bảng 7 Kết quả khảo sát hàm lượng phosphorus 36

Bảng 8 So sánh kết quả thành phần dưỡng chất các bộ phận của cây 36

Bảng 9 Quy trình thử nghiệm với đối chứng Vitamin C 38

Bảng 10 Kết quả đo mật độ quang OD của đối chứng Vitamin C 38

Bảng 11 Quy trình thử nghiệm với cao tổng 39

Bảng 12 Kết quả đo mật độ quang OD của cao tổng 39

Bảng 13 Quy trình thử nghiệm với cao n-Hex 40

Bảng 14 Kết quả đo mật độ quang OD của cao n-Hex 40

Bảng 15 Quy trình thử nghiệm với cao DC 41

Bảng 16 Kết quả đo mật độ quang OD của cao DC 41

Bảng 17 Quy trình thử nghiệm với cao Ea 42

Bảng 18 Kết quả đo mật độ quang OD của cao Ea 42

Bảng 19 Kết quả khảo sát khả năng kháng oxy hóa DPPH 43

Bảng 20 Kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn, nấm 43

Bảng 21 Kết quả khảo sát khả năng gây độc tế bào ung thư 44

DANH MỤC HÌNH

Hình 1 Thân, lá, hoa và quả bồ công anh Việt Nam 4

Hình 2 Kỹ thuật chiết ngấm kiệt (percolation) 16

Hình 3 Kỹ thuật chiết ngâm dầm (maceration) 17

Hình 4 Chiết bằng máy soxhlet 18

Hình 5 Phương pháp chiết lỏng-lỏng 19

Hình 6 Một số dung môi chính được sử dụng trong đề tài 22

Hình 7 Nguyên liệu rễ cây bồ công anh Việt Nam 24

Hình 8 Sơ đồ điều chế các cao phân đoạn 25

Hình 9 Dịch chiết petroleum ether chứa carotenoid 34

Hình 10 Vô cơ hóa mẫu rễ cây bồ công anh Việt Nam 34

Hình 11 Dung dịch đo mật độ quang OD dùng để định lượng phosphorus 36

Hình 12 Sự chuyển màu của dung dịch DPPH 37

Hình 13 Biểu đồ thể hiện khả năng kháng oxy hóa DPPH của Vitamin C 38

Hình 14 Biểu đồ thể hiện khả năng kháng oxy hóa DPPH của cao tổng 39

Hình 15 Biểu đồ thể hiện khả năng kháng oxy hóa DPPH của cao n-Hex 40

Hình 16 Biểu đồ thể hiện khả năng kháng oxy hóa DPPH của cao DC 41

Hình 17 Biểu đồ thể hiện khả năng kháng oxy hóa DPPH của cao Ea 42

Hình 18 Ảnh hưởng của pH đến cao chiết tại các thời điểm 44

DANH MỤC PHỤ LỤC Phụ lục 1 KẾT QUẢ THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG SINH 49 Phụ lục 2 KẾT QUẢ THỬ HOẠT TÍNH ĐỘC TẾ BÀO 50 Phụ lục 3 KẾT QUẢ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN, ĐỘC UNG THƯ 51 Phụ lục 4 BẢNG KẾT QUẢ THÀNH PHẦN DƯỠNG CHẤT TOÀN CÂY BỒ

CÔNG ANH VIỆT NAM 52

DANH MỤC VIẾT TẮT

ADF Acid Detergent Fibre

ADR Acid Detergent Reagent

A549 Human Lung cancer cells

HeLa Humen Cervix cancer cells

Hep-G2 Human Hepatocellular cancer cells

HL-60 Human Leukemia cancer cells

HPLC High performance liquid chromatography

IC50 The half maximal inhibitory concentration

MeOH (Me) Methanol

MIC Minimum Inhibitory Concentration

MTT Thiazolyl blue tetrazolium bromide (3-(4,5-dimethyl-2-

thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide)

NDF Neutral Detergent Fibre

NDR Neutral Detergent Reagent

PANC-1 Human Pancretic cancer cells

PBS Phosphate Buffered Saline

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU 1.1 Lý do chọn đề tài

Bồ công anh là tên thường gọi của ít nhất 3 loài cây đều có ở nước ta: bồ công anh

Việt Nam (Lactuca indica L., Dandelion), bồ công anh Trung Quốc (Taraxacum officinale Wigg., bồ công anh lùn) và cây Chỉ thiên (Elephantopus scaber L.) Theo GS

Đỗ Tất Lợi, cả ba loài cây trên đều có tên là cây bồ công anh, vừa là cây rau, cây thuốc

và được dùng làm trà Nhưng do tính dược khác nhau của mỗi loài cây, nhất là trong các toa thuốc nam trị bệnh có liên quan đến sức khỏe con người, người dùng nên cần phải phân biệt rõ ràng đặc điểm thực vật và tính năng dược liệu của ba loài cây này để tránh

sự ngộ nhận đáng tiếc xảy ra

Bồ công anh Việt Nam được biết đến là một loài rau ăn giàu giá trị dinh dưỡng, thu hái rất dễ dàng Nhân dân ta thường dùng lá, lá có thể dùng tươi hoặc phơi khô để sử dụng Một số người hái cả cây, cả rễ cắt nhỏ, phơi khô để dùng Trong y học dân gian,

bồ công anh Việt Nam có vị ngọt, hơi đắng, tính hàn, có tác dụng thanh nhiệt giải độc, tiêu viêm tán kết và được sử dụng trong điều trị một số bệnh như: mụn nhọt, ăn uống khó tiêu, đau dạ dày, viêm tuyến sữa ở phụ nữ,… [1-3]

Nhiều nghiên cứu về phần trên mặt đất của loài Lactuca indica L tại các quốc gia

trên thế giới đã công bố về khả năng ức chế tế bào ung thư gan Hep-G2 [4,5], tế bào ung thư máu HL-60 [6,7], khả năng ngăn cản tế bào ung thư bàng quang bởi lây nhiễm độc

tố từ Escherichia coli [6],…

Những năm gần đây, nhân dân truyền tai nhau nhiều thông tin về khả năng thần kỳ của dịch chiết từ rễ của bồ công anh Việt Nam có thể tiêu diệt các dòng tế bào ung thư, đặc biệt là tế bào ung thư gan Nhiều bệnh nhân ung thư gan, sau khi sử dụng dịch chiết

từ rễ của loài này cũng đã nhận định rằng: sức khỏe có tiến triển, cơ thể dần hồi phục,

ăn uống ngon miệng,… Trước đó, khả năng chữa bệnh ung thư của cây bồ công anh cũng được nhắc tới khi các nhà khoa học tại Đại học Windsor (Canada) nghiên cứu và phát hiện chiết xuất từ rễ loài bồ công anh khiến cho các tế bào ung thư gan bị suy yếu

và chết, nhưng loài bồ công anh được nhắc đến trong nghiên cứu trên là loài Taraxacum officinale Wigg thay vì là loài Lactuca indica L như trong nhân dân truyền tai nhau [8]

Mặt khác, trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt

tính sinh học của cây Lactuca indica L., nhưng ở nước ta, các công trình nghiên cứu về

thành phần hóa học và tiềm năng sinh học của cây bồ công anh Việt Nam được công bố vẫn còn hạn chế

Nghiên cứu này nhằm bước đầu đánh giá về giá trị dinh dưỡng, một vài đặc điểm sinh học của phần rễ cây bồ công anh Việt Nam được thu hái tại thành phố Đà Lạt, tỉnh Lâm Đồng, Việt Nam, cũng như đóng góp vào nghiên cứu trong nước và thế giới về loài này

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

1.3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu: cây bồ công anh Việt Nam (Lactuca indica L.) được thu hái

tại thành phố Đà Lạt, tỉnh Lâm Đồng, Việt Nam vào tháng 06/2017 Mẫu nghiên cứu

được TS Đặng Minh Quân giám định tên khoa học là Lactuca indica L., họ Cúc

(Asteraceae)

Phạm vi nghiên cứu: đề tài được thực hiện trên rễ cây và các dịch chiết từ rễ cây

bồ công anh Việt Nam Nghiên cứu về một vài chỉ tiêu thành phần dưỡng chất, hoạt tính sinh học (khả năng kháng oxy hóa DPPH, khả năng kháng khuẩn, nấm và khả năng gây độc tế bào ung thư) và ảnh hưởng của pH đến các nhóm chất trong cao chiết

1.4 Thời gian và địa điểm

Đề tài được thực hiện từ tháng 6/2017 đến 11/2017, tại phòng Hóa Hữu cơ, khoa Khoa học Tự nhiên, trường Đại học Cần Thơ

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan về thực vật

2.1.1 Khái quát về cây bồ công anh

Bồ công anh Việt Nam (Lactuca indica L., Dandelion), bồ công anh Trung Quốc (Taraxacum officinale Wigg., bồ công anh lùn) và cây Chỉ thiên (Elephantopus scaber

L.) đều là các loài cây có ở nước ta với tên thường gọi là bồ công anh

Bồ công anh Việt Nam (Lactuca indica L.) được sử dụng phổ biến, nhất là tại phía

Bắc và Bắc Trung Bộ Đặc điểm nhận biết là cây cao khoảng 0,6-2m, có thể cao hơn tùy điều kiện sống Thân mọc thẳng, nhẵn, không cành hoặc ít cành Lá có nhiều hình dạng,

lá phía dưới dài 13-25 cm, rộng 1,5-11 cm Bấm vào lá và thân đều thấy tiết ra nhũ dịch màu trắng đục như sữa, vị hơi đắng Cụm hoa màu vàng [2]

Bồ công anh Trung Quốc (Taraxacum officinale Wigg.) mọc hoang và được trồng

vài nơi ở nước ta, nhất là tại các miền núi cao như Tam Đảo, Sa Pa,… Đặc điểm là cây

có rễ trụ, lá mọc thành hoa thị ở gốc, phiến lá cắt thành thùy nhỏ như răng nhọn, từ giữa

lá mọc lên cuống cụm hoa màu vàng, khi già quả có lông trắng xếp thành hình cầu [2]

Cây Chỉ thiên (Elephantopus scaber L.) phân bố ở khắp nơi Cây này ở miền nam

thường được gọi là bồ công anh Đặc biệt ở miền nam Trung Quốc (tỉnh Quảng Tây) người ta dùng như cây bồ công anh Trung Quốc [2] Với các đặc điểm như lá mọc chụm

ở mặt đất, thân cao 30-40 cm, chẻ nhánh và mang ít lá nhỏ Hoa nhỏ gắn 3-4 hoa thành nhiều hoa trong một tổng bao ba lá, hoa cao 1,5 cm, bế quả 4-5 cm, có 5 sợi tơ [1]

2.1.2 Giới thiệu về cây bồ công anh Việt Nam (Lactuca indica L.)

2.1.2.1 Danh pháp và phân loại

Tên khoa học: Lactuca indica L

2.1.2.2 Đặc điểm thực vật [2]

Cây bồ công anh Việt Nam (Lactuca indica L.) là một loại thực vật thân thảo, mọc

đứng, sống một hoặc hai năm Mùa ra hoa và mùa quả vào khoảng tháng 6 đến tháng 9 hằng năm

Hình 1 Thân, lá, hoa và quả bồ công anh Việt Nam

Thân: không có lông, cao khoảng 0,6-2 m, thân thường mọc đơn hoặc chẻ nhánh

ở phần trên

Lá: mọc so le, gần như không có cuống Phiến lá thuôn dài hoặc dạng hình mũi

mác, kích thước phiến lá dài từ 13-25 cm, rộng từ 1,5-11 cm, đầu lá nhọn, đuôi lá hình nêm hoặc men cuống, cuống lá thường ngắn hoặc men cuống tới tận nách lá Mép lá nguyên hoặc xẻ thùy hoặc có răng cưa thô to Mặt trên phiến lá màu xanh lục, mặt dưới xanh xám Các lá mọc ở phía trên gần đỉnh ngọn sinh hoa thường nhỏ hơn và thẳng

Hoa: mọc ở đầu ngọn, đầu cành Hoa tự hình chùy, đầu cụm hoa có chiều rộng

khoảng 2 cm; cuống dài 10-25 mm, mọc thẳng Tổng bao hình trụ, kích thước chùm hoa thường cao 10-13 cm, rộng 5-6 mm, các lá bắc không lông, màu tía, các lá ngoài hình trứng, dài 2-3 mm, các lá trong hình trứng hay mũi mác, các lá bắc tận trong cùng hình mũi mác Mỗi cây thường có 21-27 hoa, hoa có nhiều cánh màu vàng nhạt, kích thước hoa 12-13 mm

Quả bế: quả bế hình elip, phẳng, màu đen, kích thước quả dài 4-4,5 mm, rộng 2,3

mm, mỏ quả dài 1-1,5 mm

Mào lông: màu trắng gắn liền quả dài 7-8 mm

Cây dễ nhầm lẫn: bồ công anh hoa tím (Cichorium intybus L.), chicory, wild endive

(Anh), chicorée (Pháp)

2.1.2.3 Sinh thái và phân bố [2]

Lactuca là một chi tương đối lớn, gồm những cây sống một năm, vài loài sống

nhiều năm, phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới và á nhiệt đới Bắc bán cầu

Ở Ấn Độ, có khoảng 25 loài Việt Nam cũng có hơn 10 loài Trong đó, bồ công anh Việt Nam là loài phân bố phổ biến nhất, ở hầu hết các tỉnh từ miền núi đến đồng

bằng Độ cao phân bố thường không quá 1500 m Cây cũng gặp ở nhiều nước khác như Trung Quốc, Lào, Ấn Độ, Nhật Bản,…

Bồ công anh là cây ưa ẩm và ưa sáng, thường mọc trên những nơi đất tương đối màu mỡ, nhất là các bãi bồi ven sông, vườn bỏ hoang hoặc nương rẫy Hàng năm, cây con mọc từ hạt thường xuất hiện vào cuối mùa xuân Cây sinh trưởng nhanh trong mùa

hè, ra hoa quả vào đầu mùa thu và sau đó tàn lụi Hạt giống có túm lông ở đỉnh, nhờ gió phát tán đi khắp nơi Vài năm trở lại đây, nhiều cơ sở chữa bệnh y học dân tộc đã trồng thêm cây thuốc này

Bồ công anh không kén đất, có khả năng thích nghi rộng nên được trồng phổ biến

ở các vườn thuốc của trạm xá, bệnh viện, trường học, viện nghiên cứu để hướng dẫn học tập và khai thác sử dụng Cả cây bồ công anh được thu hái vào tháng 5 đến tháng 7, lúc này cây chưa ra hoa Thường dùng tươi làm rau ăn và thuốc đắp hoặc phơi khô

2.1.3 Tổng quan tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

2.1.3.1 Trong nước

Tại Việt Nam, chưa có nghiên cứu nào được công bố về thành phần hóa học cũng

như hoạt tính sinh học của cây bồ công anh Việt Nam (Lactuca indica L.)

2.1.3.2 Ngoài nước

Nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học cũng như hoạt tính sinh học của cây bồ công anh Việt Nam đã được tiến hành ở một số nước như: Hàn Quốc, Trung Quốc, Hà Lan, với nhiều công trình đã được công bố

Năm 2003, Sheng-Yang Wang và cộng sự đã khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa và

tính chất của các chất được tách từ cây Lactuca indica L Kết quả cho thấy chiết xuất từ Lactuca indica L có khả năng thu giữ các gốc tự do hoạt động, giảm stress oxy hóa

trong bệnh bạch cầu promyelocytic HL-60 của tế bào người Hơn nữa, chiết xuất của

Lactuca indica L gần như ức chế hoàn toàn sản xuất nitric oxide và các biểu hiện mRNA

của chất cảm ứng enzym tổng hợp nitric oxide, với liều 100 μg/mL, trong các đại thực bào RAW264.7 Bên cạnh đó các nhà nghiên cứu đã phân lập được 6 hợp chất

protocatechulic acid, methyl p-hydroxybenzoate, caffeic acid, 3,5-dicaffeoylquinic acid, luteolin 7-O-α-glucopyranoside và quercetin 3-O-α-glucopyranoside [7]

Năm 2007, Ki Hyun Kim và cộng sự đã phân lập 7 dẫn xuất quinic acid như

3,4-di-O-caffeoylquinic acid, 3,5-di-O-caffeoyl-muco-quinic acid, 3,5-3,4-di-O-caffeoylquinic acid, 4,5-di-O-caffeoylquinic acid, 5-O-caffeoylquinic acid, 3-O-caffeoylquinic acid và 5-O-(E)-p-coumaroylquinic acid Và 5 dẫn xuất flavonoid như quercetin 3-O-α-L- rhamnopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranoside, quercetin 5-O-β-D-glucopyranoside, luteolin 7-O-β-D-glucuronide, 20-dihydroxy-7-O-β-D-glucuronylflavone, quercetin 3- O-β-D-glucopyranoside các hợp chất đã được thử hoạt tính bảo vệ gan ở qui mô ống nghiệm [4]

dụng gây độc tế bào mạnh mẽ, chống lại tế bào HL-60, giá trị IC50 là 313 μg/mL Dịch chiết này chứa 5% các hợp chất phenolic, như quercetin, caffeic acid, rutin, và chlorogenic acid Trong số 4 hợp chất phenolic hoạt động, quercetin đã được tìm thấy là hiệu quả nhất trong việc ức chế đối với khả năng tồn tại trong tế bào và biến đổi các chức năng của ty thể [9]

Năm 2008, Ki Hyun Kim và cộng sự đã cô lập được 7 terpene và 5 phenolic, bao

gồm: trans-phytol, 3-β-hydroxyglutin-5-ene, one, 11-β-13-dihydrolactucin, 2-phenylethyl-β-D-glucopyranoside, cichorioside B, 1- hydroxylinaloyl-6-O-β-D-glucopyranoside, (6S,9S)-roseoside, benzyl-β-D- glucopyranoside, 2-(3-O-β-D-glucopyranosyl 4-hydroxyphenyl)-ethanol, 3-(β-D-

5,6-epoxy-3-hydroxy-7-megastigmen-9-methoxydihydrobenzofuran, và (+)-taraxafolin-B [10]

glucopyranosyloxymethyl)-2-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-5-(3-hydroxypropyl)-7-Năm 2010, Ki Hyun Kim và cộng sự đã phân lập 1 hợp chất là

di-E-caffeoyl-meso-tartaric acid từ dịch chiết methanol của phần trên mặt đất của cây Lactuca indica L trong dòng tế bào gan HBV-transfected nhân Hep-G2.2.15, hợp chất

này có hiệu quả giảm nồng độ HBV DNA trong việc giải phóng các hạt HBV trưởng thành từ việc nuôi cấy Hep-G2.2.15 [5]

Năm 2011, Petra Lüthje và cộng sự đã nghiên cứu khả năng ngăn cản tế bào ung

thư bàng quang bởi Escherichia coli của dịch chiết Lactuca indica L Kết quả cho thấy rằng ngoài tác dụng lợi tiểu, Lactuca indica L còn có các tác dụng trực tiếp trên tế bào biểu mô có thể bảo vệ chống lại nhiễm trùng Escherichia coli [6]

Năm 2016, Chang Ik Choi và cộng sự đã cô lập được 8 hợp chất phenolic, gồm

apigenin, luteolin, isoquercitrin, chlorogenic acid, protocatechuic acid, hydroxymethyl benzoic acid, trans-cinnamic acid, và p-coumaric acid Trong đó các hợp chất luteolin, isoquercitrin, chlorogenic acid và p-hydroxymethyl benzoic acid là

p-chất kháng oxy hóa hoạt động với giá trị IC50 trong khoảng 35,5-52,5 μM Ngoài ra,

apigenin và luteolin ức chế hoạt động α-glucosidase với giá trị IC50 lần lượt có giá trị tại 96,4 và 100,7 μM [11]

Thông qua các tài liệu nghiên cứu cho thấy thành phần hóa học chính trong cây bồ

công anh Việt Nam (Lactuca indica L.) là các các dẫn xuất của quinic acid, flavonoid,

một số loại terpenoid, hợp chất có thành phần chứa phenolic và các hợp chất khác [4,5,7,10,11] Được thể hiện trong Bảng 1 như sau:

Bảng 1 Tổng hợp các thành phần hóa học trong cây đã được phân lập

Các dẫn xuất của quinic acid

33

Benzyl-β-D-glucopyranoside

2.2 Vài nét về các đối tượng gây bệnh

2.2.1 Các chủng khuẩn, nấm gây bệnh

2.2.1.1 Staphylococcus aureus [12]

- Hình thái: Staphylococcus aureas hay tụ cầu vàng là những cầu khuẩn, có đường

kính từ 0,8-1,0 μm và đứng thành chùm nho, bắt màu Gram (+), không nha bào, thường không có vỏ

- Nuôi cấy: tụ cầu vàng thuộc loại dễ nuôi cấy, phát triển được ở nhiệt độ 10-45 oC

và nồng độ muối cao tới 10% Thích hợp ở cả điều kiện hiếu và kỵ khí

- Khả năng gây bệnh: tụ cầu vàng thường ký sinh ở mũi họng và có thể cả ở da Vi khuẩn này gây bệnh cho người suy giảm đề kháng hoặc chúng có nhiều yếu tố độc lực

Có khả năng gây các bệnh như: mụn nhọt sinh mủ, các ổ áp xe (gan, phổi, não, tủy sống,…), viêm xương, viêm phổi,…

2.2.1.2 Bacillus subtilis [12]

- Hình thái: Bacillus subtilis hay trực khuẩn cỏ khô có dạng trực khuẩn nhỏ và

ngắn, hai đầu tròn, bắt màu Gram (+), kích thước chiều rộng 0,5-0,8 μm, chiều dài

1,5-3 μm, thường đứng đơn lẻ hoặc tạo thành chuỗi ngắn Vi khuẩn có khả năng di động, có

từ 8-12 chiên mao

- Nuôi cấy: nuôi cấy trong môi trường hiếu khí (nhưng có khả năng phát triển trong môi trường thiếu oxy), nhiệt độ tối ưu 37 oC, thích hợp tại pH từ 7-7,4

2.2.1.3 Lactobacillus fermentum [12]

- Lactobacillus fermentum là vi khuẩn Gram (+) có lợi cho sức khỏe con người và

động vật Là vi khuẩn ưa ẩm, có nhu cầu dinh dưỡng phức tạp

- Nuôi cấy: Vi khuẩn phát triển tốt trong môi trường acid pH từ 5,5-6,2, chúng tồn tại được ở cả pH dưới 5 Nhiệt độ phát triển tối ưu từ 30-40 oC, phù hợp với thân nhiệt

cơ thể người

2.2.1.4 Salmonella enterica [12]

- Hình thái: là trực khuẩn Gram (–), có nhiều chiên mao ở xung quanh thân

- Nuôi cấy: thích hợp ở cả hiếu và kỵ khí, phát triển được trên các môi trường nuôi cấy thông thường

2.2.1.5 Escherichia coli [12]

- Hình thái: Escherichia coli (E coli) là trực khuẩn Gram (–) Phát triển dễ dàng

trên các môi trường nuôi cấy thông thường, cả hiếu và kỵ khí Kích thước chiều dài

2-3 μm, rộng 0,5 μm, đôi khi trong môi trường nuôi cấy có thể dài đến 6-8 μm

- Nuôi cấy: phát triển được ở nhiệt độ 15-40 oC, tốt nhất là 37 oC, pH thích hợp vào khoảng 7-7,2

- Khả năng gây bệnh: trong đường tiêu hóa, E coli chiếm khoảng 80% các vi khuẩn hiếu khí Nhưng E coli cũng là vi khuẩn gây bệnh quan trọng, nó đứng đầu trong các vi

khuẩn gây bệnh đường tiêu hóa, viêm đường tiết niệu, viêm đường mật, đứng hàng đầu trong các căn nguyên gây nhiều bệnh khác như viêm phổi, viêm màng não, nhiễm khuẩn vết thương

2.2.1.6 Pseudomonas aeruginosa [12]

- Hình thái: Pseudomonas aeruginosa hay trực khuẩn mủ xanh là vi khuẩn Gram

(–), thẳng hoặc hơi cong nhưng không xoắn, hai đầu tròn Kích thước rộng 0,5-1,0 μm, dài 1,5-5,0 μm Có một chiên mao duy nhất ở một cực Các nhung mao (pili) của trực khuẩn mủ xanh dài khoảng 6 nm, là nơi tiếp nhận nhiều loại phage và giúp cho vi khuẩn gắn kết vào bề mặt của tế bào vật chủ Trực khuẩn mủ xanh không sinh nha bào

- Nuôi cấy: trực khuẩn mủ xanh dễ dàng phát triển trên các môi trường nuôi cấy thông thường (thạch thường, thạch máu, canh thang), hiếu khí tuyệt đối Nhiệt độ tối ưu

là 37oC, nhưng chúng cũng có thể phát triển được trong khoảng dao động rộng 5-42 oC,

pH thích hợp từ 7,2-7,5 (dao động 4,5-9,0)

- Khả năng gây bệnh: trực khuẩn mủ xanh từ môi trường bên ngoài xâm nhập vào

cơ thể qua các vết thương hở (nhất là bỏng) Tại chỗ xâm nhập, chúng gây viêm có mủ (mủ có màu xanh); nếu cơ thể suy giảm chức năng đề kháng, chúng có thể xâm nhập vào gây viêm các phủ tạng (xương, đường tiết niệu, tai giữa, phế quản, màng não) hoặc gây bệnh toàn thân (nhiễm khuẩn huyết, viêm nội tâm mạc) Về bệnh sinh học, có giả thuyết cho rằng, các sản phẩm ngoại tiết như sắc tố, độc tố tan máu, độc tố ruột, ngoại độc tố A (độc tố gây chết) có vai trò chính

2.2.1.8 Candida albican [13]

- Nấm men Candida albican là một loại nấm có hình tròn hoặc hình bầu dục với

kích thước khoảng 2-5 µm Loại nấm này thường sống hoại sinh trong đường tiêu hóa của người, động vật hoặc trong âm đạo của phụ nữ,…

- Sự phát triển và gây bệnh của chúng chịu sự kiềm chế của các vi khuẩn sống trong

vi hệ Chúng trở nên gây bệnh khi điều kiện thuận lợi, giảm sức đề kháng (do nhiều căn nguyên), mất cân bằng trong vi hệ và do một số yếu tố thuận lợi khác

2.2.2 Các dòng tế bào ung thư

Dòng tế bào này được phân lập từ tế bào ung thư cổ tử cung ngày 8 tháng 2 năm 1951

từ Henrietta Lacks, bệnh nhân đã qua đời vì ung thư vào ngày 4 tháng 10 năm 1951

Dòng tế bào HeLa rất ổn định và tăng sinh mạnh, điều này dẫn đến việc chúng dễ nhiễm

chéo vào nhiều dòng tế bào khác cũng được sử dụng trong nghiên cứu

2.2.2.2 Tế bào ung thư phổi (A549)

Dòng tế bào ung thư phổi A549 được phát hiện vào năm 1972 bởi D.J Giard Các

tế bào này có nguồn gốc từ việc nuôi cấy các mô biểu bì tế bào ung thư phổi của một

nam bệnh nhân người da trắng 58 tuổi Đặc điểm của tế bào ung thư A549 là kích thước

phát triển lớn hơn nhiều lần tế bào thường Tế bào ung thư A549 có kích thước đường

kính khoảng 20 m do đó thuận lợi cho việc quan sát cũng như kiểm tra Chu kỳ phát

triển nhân đôi của A549 là 24 giờ, tức cứ sau 24 giờ thì số lượng tế bào sẽ được nhân

lên gấp 2 lần

2.2.2.3 Tế bào ung thư tuyến tụy (PANC-1)

Tế bào PANC-1 được phát hiện và nuôi cấy từ một người đàn ông 56 tuổi mắc ung

thư biểu mô tuyến tụy xâm nhập vào thành tá tràng Di căn ở một hạch lympho bên ngoài

vùng bụng được phát hiện trong quá trình cắt đại tràng

2.2.2.4 Tế bào ung thư gan (Hep-G2)

Hep-G2 là một dòng tế bào xuất phát từ mô gan, tìm thấy ở một nam giới da trắng,

15 tuổi người Mỹ với một tế bào ung thư biểu mô rất khác biệt Các tế bào này là biểu

mô có một modal chromosome số 55, và không gây khối u ở những con chuột nude

(chuột thiếu hụt miễn dịch) Các tế bào tiết ra nhiều protein huyết tương chính như

albumin, transferrin, và các protein giai đoạn cấp tính như transferrin và plasminogen

CHƯƠNG 3 CƠ SỞ LÝ THUYẾT MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM 3.1 Lựa chọn dung môi [14]

Do cấu tạo hóa học của cây cỏ hoặc sinh khối (biomass) thường là những chất liệu đại phân tử tương đối trơ, không hòa tan trong các dung môi hữu cơ, vì thế việc khảo sát hợp chất tự nhiên nghĩa là chiết lấy và khảo sát các chất biến dưỡng thứ cấp có trọng lượng phân tử nhỏ

Thông thường người ta muốn nghiên cứu các hợp chất tự nhiên có tính ái dầu có mức phân cực khác nhau, tuy nhiên, đôi khi cũng nghiên cứu các hợp chất tự nhiên có tính ái nước Điều này được thực hiện bằng cách chiết những hợp chất có trong cây lần lượt bằng các dung môi có tính phân cực tăng dần hoặc chiết một lần lấy tất cả các loại hợp chất bằng cách sử dụng dung môi vạn năng methanol (có thể chiết hầu hết các loại hợp chất tự nhiên)

Dung môi được chọn phải là dung môi có tính trung tính, không độc, không quá dễ cháy, hòa tan được các nhóm hoạt chất cần khảo sát, có thể loại bỏ dễ dàng Cần tránh chọn các dung môi độc như benzen hoặc dễ cháy như diethyl ether, carbon tetrachlorua,… Trường hợp cần khảo sát đối với một số nhóm chất đặc biệt có thể sử dụng dung môi có điều chỉnh pH (trong trường hợp chiết alkaloid, flavonoid,…) hoặc

có thể sử dụng dung môi không bay hơi (như chiết các tinh dầu) Khi sử dụng các dung môi dễ cháy cần phải thực hiện ở một nơi có điều kiện phòng cháy chữa cháy tốt và cách

ly với các phòng thí nghiệm

Một số điều cần biết khi sử dụng dung môi để chiết tách:

- Các dung môi cần được chưng cất lại và tồn trữ trong những chai, lọ bằng thủy tinh do trong môi trường thường hay chứa một số tạp chất bẩn mà thường gặp nhất là chất làm dẻo hóa, chúng lẫn vào dung môi thường được chứa trong các thùng làm bằng nhựa dẻo

- Methanol và chloroform thường chứa tạp chất là di(2-ethylhexyl) phtalat và chất này thường bị nhiều tác giả nhầm lẫn rằng là hợp chất tự nhiên có chứa trong cây cỏ đang khảo sát, dù rằng hợp chất này có một số hoạt tính sinh học

- Chloroform, dichloromethane có thể tạo phản ứng với các loại alkaloid để tạo thành các alkaloid dạng muối tứ cấp và một vài hợp chất giả tạo khác Tương tự, các vết HCl có thể gây ra sự phân hủy, sự khử nước, sự đồng phân hóa cho vài hợp chất hữu cơ

- Acetone có thể tạo ra dẫn xuất acetonid nếu hợp chất chiết có chứa nhóm

cis-1,2-diol hiện diện trong môi trường acid

- Sau khi chiết, dung môi được thu hồi bằng máy cô quay chân không ở nhiệt độ 30-40 oC, chưng cất ở nhiệt độ cao hơn có thể làm hư một số hợp chất kém bền nhiệt

Người ta thường sử dụng các dung môi không hòa tan trong nước như n-hexane,

Các dung môi có chỉ số phân cực khác nhau có khả năng hòa tan các chất có độ

phân cực khác nhau Dung môi không phân cực như n-hexane, petroleum ether dùng để

hòa tan các chất không hoặc kém phân cực Dung môi phân cực trung bình như dichloromethane dùng để hòa tan các chất có độ phân cực trung bình Dung môi phân cực như ethyl acetate, methanol, ethanol dùng để hòa tan các chất phân cực

3.2 Kỹ thuật chiết rắn-lỏng [14]

3.2.1 Kỹ thuật chiết ngấm kiệt

Phương pháp này được sử dụng khá phổ biến vì không đòi hỏi thiết bị tốn kém, phức tạp

Dụng cụ: gồm một bình ngấm kiệt bằng thủy tinh, hình trụ đứng, dưới đáy bình là một van khóa để điều chỉnh vận tốc của dung dịch chảy ra, một bình chứa đặt bên dưới

để hứng dung dịch chiết Phía trên cao của bình ngấm kiệt là bình lóng để chứa dung môi tinh khiết

Cách tiến hành: bột cây được xay thô, lọt được qua lỗ rây 3 mm Mẫu không nên

to hơn vì sẽ chiết không kiệt, mẫu được xây quá mịn sẽ có tính nhầy nhựa hoặc có thể trương nở,… sẽ cản trở dòng chảy Đáy của bình ngấm kiệt được lót bằng bông thủy tinh và một tờ giấy lọc Bột cây được đặt vào bình, lên trên lớp bông thủy tinh, lên gần đầy bình Đậy bề mặt lớp bột bằng một tờ giấy lọc và chặn lên trên bằng những viên thủy tinh để cho dung môi không làm xáo trộn bề mặt lớp bột Từ từ rót dung môi cần chiết vào bình cho đến khi dung môi phủ xấp xấp phía trên lớp mặt Có thể sử dụng dung môi nóng hoặc nguội

Hình 2 Kỹ thuật chiết ngấm kiệt (percolation)

Để yên sau một thời gian, thường là 12 đến 24 giờ Mở van bình ngấm kiệt cho dung dịch chiết chảy ra từng giọt và đồng thời mở khóa bình lóng để dung môi tinh khiết chảy vào bình ngấm kiệt bằng với vận tốc dung dịch chiết chảy ra khỏi bình này

Hiệu quả của phương pháp: so sánh với phương pháp ngâm dầm, phương pháp này đòi hỏi thiết bị phức tạp hơn một chút nhưng hiệu quả lại cao hơn và ít mất công hơn vì đây là quá trình chiết liên tục, dung môi trong bình ngấm kiệt đã bão hòa mẫu chất sẽ được liên tục thay thế bằng dung môi tinh khiết

Kiểm tra việc chiết kiệt mẫu bột cây bằng sắc ký lớp mỏng hoặc nhỏ một giọt dung dịch chiết lên tấm kiếng sạch, để bốc hơi và xem có còn để lại vết gì hay không, nếu không còn vết là đã chiết sạch

3.2.2 Kỹ thuật chiết ngâm dầm

Kỹ thuật chiết ngâm dầm cũng tương tự như kỹ thuật chiết ngấm kiệt nhưng không đòi hỏi thiết bị phức tạp, vì thế có thể dễ dàng thao tác với một lượng lớn mẫu cây Ngâm bột cây trong một bình chứa bằng thủy tinh hoặc bằng thép không gỉ, bình

có nắp đậy Tránh sử dụng bình bằng nhựa vì dung môi hữu cơ có thể hòa tan một ít nhựa, gây nhầm lẫn là hợp chất có chứa trong cây

Rót dung môi tinh khiết vào bình cho đều xấp bề mặt của lớp bột cây Giữ yên ở nhiệt độ phòng một đêm hoặc một ngày, để cho dung môi xuyên thấm vào cấu trúc tế bào thực vật và hòa tan các hợp chất tự nhiên Sau đó, dung dịch chiết được lọc lại ngang qua một tờ giấy lọc, thu hồi dung môi sẽ có được cao chiết Tiếp theo, rót dung môi mới vào bình chứa bột cây và tiếp tục quá trình chiết thêm một số lần nữa cho đến khi chiết kiệt mẫu cây

Hình 3 Kỹ thuật chiết ngâm dầm (maceration)

Có thể gia tăng hiệu quả sự chiết bằng cách thỉnh thoảng đảo trộn, xóc đều lớp bột cây hoặc có thể gắn vào máy lắc để lắc nhẹ (chú ý nắp bình bị bung ra làm dung dịch chiết bị trào ra ngoài)

Mỗi lần ngâm chỉ cần 24 giờ là đủ vì với một lượng dung môi cố định trong bình,

Dung môi sau khi thu hồi được làm khan nước bằng các chất làm khan và được tiếp tục sử dụng để chiết các lần sau

3.2.3 Kỹ thuật chiết bằng hệ thống chiết soxhlet

Hệ thống có bán sẵn với nhiều cỡ lớn nhỏ khác nhau, từ bình cầu có thể tích

250 mL đến 15 L

Dụng cụ: hệ thống gồm ba bộ phận tháo ráp được lại các vị trí nút mài (1), (2) và (3) Gồm một bình cầu A đặt trong một bếp đun có thể điều chỉnh nhiệt độ Một bộ phận chứa mẫu bột cây, gồm ba ống: ống D có đường kính lớn, ở giữa, để chứa bột cây; ống

B có đường kính trung bình, để dẫn dung môi từ bình A bay lên, đi vào ống D chứa bột cây; ống E có đường kính nhỏ là ống thông nhau, để dẫn dung môi từ D trả ngược trở lại bình cầu A Trên cao nhất là ống C ngưng hơi

Hình 4 Chiết bằng máy soxhlet

Cách tiến hành: bột cây xay thô được đặt trực tiếp trong ống D hoặc tốt nhất là đặt trong một túi vải để lấy bột cây ra khỏi hệ thống Lưu ý đặt vài viên bi thủy tinh dưới đáy ống D để tránh làm nghẹt lối ra vào của ống thông E Không được để lượng bột cây trong ống D cao vượt hơn mức công của ống thông E

Rót dung môi đã lựa chọn vào bình cầu bằng cách tháo hệ thống ở chổ nút mài (2), như thế dung môi sẽ thấm ướt bột cây rồi mới chạy xuống bình cầu (thể tích dung môi trong bình cầu không được vượt quá 2/3 thể tích bình cầu)

Kiểm tra hệ thống kín Mở cho nước chảy hoàn lưu trong ống ngưng hơi Cấm bếp điện và điều chỉnh nhiệt độ sao cho dung môi trong bình cầu sôi nhẹ đều Khi dung dịch

trong bình cầu sôi, dung môi tinh khiết sẽ bốc hơi, sau đó theo ống B lên cao hơn rồi theo ống ngưng hơi để lên cao hơn nữa nhưng tại đây hơi dung môi bị ống ngưng làm lạnh, ngưng tụ thành thể lỏng, rớt thẳng xuống ống D đang chứa bột cây Dung môi ngấm vào bột cây và chiết những chất hữu cơ nào có thể hòa tan vào dung môi Theo quá trình đun nóng, lượng dung môi rơi vào ống D càng nhiều, mức dung môi dâng lên cao trong ống D và đồng thời cũng dâng cao trong ống E vì đây là ống thông nhau Đến một mức cao nhất trong ống E, dung môi sẽ bị hút về bình cầu A, lực hút này sẽ rút hết lượng dung môi đang chứa trong ống D

Bếp vẫn tiếp tục đun và một quy trình mới vận chuyển dung môi theo như mô tả lúc đầu Các hợp chất được hút xuống bình cầu và nằm lại tại đó, chỉ có dung môi tinh khiết là được bốc hơi bay lên để tiếp tục quá trình chiết Tiếp tục đến khi chiết kiệt chất trong bột cây

Kiểm tra sự chiết kiệt bằng cách tắt máy để nguội và mở hệ thống chỗ nút mài (3), rút lấy một giọt dung môi và thử trên mặt kính, nếu thấy không còn vết gì trên kính là

Việc chiết lỏng-lỏng được thực hiện bằng bình lóng, trong đó cao alcol thô ban đầu được hòa tan vào pha nước Sử dụng lần lượt các dung môi hữu cơ, loại không hòa tan với nước để chiết ra khỏi pha nước các hợp chất có tính phân cực khác nhau (tùy vào độ phân cực của dung môi)

Tùy vào tỉ trọng so sánh giữa dung môi và nước mà pha hữu cơ nằm ở lớp trên hoặc ở dưới so với pha nước

Việc chiết được thực hiện lần lượt từ dung môi hữu cơ kém phân cực đến dung môi

phân cực ví dụ như: n-hexane, dichloromethane, ethyl acetate,… Với mỗi loại dung môi

hữu cơ, việc chiết được thực hiện nhiều lần, mỗi lần một lượng nhỏ thể tích dung môi, chiết đến khi không còn chất hòa tan vào dung môi thì đổi sang chiết với dung môi có tính phân cực hơn Dung dịch của các lần chiết được gom chung lại, cô đuổi dung môi thu được cao chiết

Kỹ thuật chiết lỏng-lỏng có nhược điểm là do phải lắc bình lóng nhiều lần nên ở những lần chiết sau dung môi trong bình lóng tạo nhũ tương, gây khó khăn trong việc tách pha thành hai lớp Khi dung môi trong bình lóng tạo nhũ tương có thể sử dụng một đũa thủy tinh dài đưa vào bình lóng, khuấy nhẹ dung dịch hoặc cọ xát nhẹ vào thành bình, chỗ mặt thoáng của dung dịch nhằm phá vỡ các bọt khí để dung dịch nhanh chóng phân thành hai lớp

3.4 Sắc ký lớp mỏng (Thin layer chromatography, TLC) [14]

Sắc ký lớp mỏng (sắc ký bản mỏng) chủ yếu dựa vào hiện tượng hấp thu trong đó pha động là một dung môi hoặc hỗn hợp các dung môi, di chuyển ngang qua pha tĩnh là một chất hấp thu trơ được tráng thành một lớp mỏng, phủ đều trên bề mặt một tấm kính, tấm kim loại thường là nhôm hoặc tấm nhựa

Bình sắc ký: một chậu, hũ, lọ,… bằng thủy tinh, hình dạng đa dạng có nắp đậy Pha tĩnh: một lớp mỏng khoảng 0,25 mm của một loại chất hấp thu trơ, như silica gel, alluminium,…

Mẫu chất cần phân tích: hỗn hợp nhiều chất với độ phân cực khác nhau, thông qua một ống vi quản, được đưa lên lớp pha tĩnh ở vị trí cao hơn một chút so với mặt thoáng của chất lỏng đang chứa trong bình sắc ký

Trong quá trình sắc ký, pha động di chuyển theo chiều từ dưới lên nhờ lực mao quản, mỗi thành phần của mẫu chất sẽ di chuyển với một vận tốc khác nhau, đi phía sau mực của dung môi Vận tốc di chuyển này phụ thuộc vào các tương tác với pha tĩnh và pha động của các thành phần trong mẫu chất

Các bước chuẩn bị trước khi sắc ký lớp mỏng:

- Chuẩn bị vi quản: Lấy một ống thủy tinh có đường kính 1-2 mm, dài 10-20 cm (loại dùng để đo điểm nóng chảy) Hai tay cầm hai đầu ống, hơ đoạn giữa ống trên một đèn cồn, vừa hơ vừa xoay vòng vòng để khoảng vùng chính giữa của ống được nóng đều Khi nhận thấy thủy tinh mềm dẻo và có vẻ như muốn chảy, dùng hai ngón tay nắm hai đầu ống kéo dang ra xa (về hai phía), thủy tinh của ống sẽ dãn dài ra Tay vẫn giữ

hai đầu ống, chờ đến khi thủy tinh nguội, đông cứng lại mới thôi, nếu không, ống còn nóng sẽ chảy cong queo

- Chấm mẫu lên tấm bản mỏng: Dùng kéo cắt các bản mỏng với kích thước thích hợp, dùng bút chì để vạch nhẹ các nét mức xuất phát và mức tiền tuyến dung môi Với mẫu chất lỏng, có thể chấm trực tiếp mẫu lên bản mỏng, trường hợp mẫu là dung dịch quá sệt, có thể pha loãng mẫu, với mẫu rắn cần phải hòa tan trong dung môi thích hợp

Sử dụng một vi quản, đặt dung dịch mẫu lên trên bề mặt của tấm sắc ký lớp mỏng một cách thận trọng Sau khi chấm hoàn tất, dùng máy sấy nhẹ để dung môi bay hơi khỏi vết chấm, rồi nhúng bản mỏng vào dung dịch giải ly

- Giải ly bản mỏng: Cần chuẩn bị một bình giải ly phù hợp với bản mỏng Trước khi cho tấm bản mỏng vào bình, bình cần được bão hòa dung môi để có một bầu khí quyển đồng nhất, thực hiện bằng cách phủ lên bề mặt trong của bình bằng một tờ giấy lọc, nghiêng đảo nhẹ bình giải ly để dung môi thấm ướt tờ giấy lọc Sau đó, đặt tấm bản mỏng vào bình, cạnh đáy của bản ngập vào dung môi giải ly khoảng 0,5-1,0 cm

- Hiện hình các vết sau khi giải ly: Có thể sử dụng đèn chiếu tia UV 254 nm để phát hiện các hợp chất có thể hấp thu tia UV (các hợp chất sẽ tạo thành vết có màu tối sẫm) hoặc 365 nm để phát hiện một số chất có phát huỳnh quang (xuất hiện các vết có màu sáng trên nền bản mỏng) Có thể sử dụng phương pháp hóa học là phát hiện các vết bằng thuốc thử, bằng cách hòa thuốc thử vào một dung môi thích hợp rồi phun xịt thuốc thử này lên bản mỏng hoặc nhúng bản mỏng vào các dung dịch thuốc thử Thuốc thử sẽ kết hợp với các chất để tạo ra các dẫn xuất có màu