KIEM NGHIEM DUOC LIEU BANG PHUONG PHAP HIEN VI

1. Một số kỹ thuật cơ bản sử dụng trong kiểm nghiệm dược liệu bằng phương pháp hiển vi

2. Phân tích vi hoá dược liệu

3. Phân tích huỳnh quang

KIỂM NGHIỆM DƯỢC LIỆU BẰNG PHƯƠNG PHÁP HIỂN VI

về cuối trang

1. Một số kỹ thuật cơ bản sử dụng trong kiểm nghiệm dược liệu bằng phương pháp hiển vi

1.1. Chuẩn bị nguyên liệu

1.1.1. Cố định nguyên liệu

1.1.2. Làm mềm nguyên liệu

1.1.3. Phương pháp ngâm mủn

1.2. Chuẩn bị và nghiên cứu tiêu bản hiển vi

1.2.1. Lá

1.2.2. Hoa

1.2.3. Thân thảo

1.2.4. Vỏ

1.2.5. Quả, hạt

1.2.6. Rễ, củ và các cơ quan dưới đất

1.3. Các chất lỏng dùng để soi và làm sáng

1.4. Cách làm tiêu bản vi phẫu thực vật

2. Phân tích vi hoá dược liệu

2.1. Các phản ứng lên thành tế bào

2.1.1. Các phản ứng lên thành tế bào cellulose

2.1.1.1. Phản ứng với Kẽm clorua - Iốt

2.1.1.2. Phản ứng hoà tan trong thuốc thử Sveize

2.1.2. Các phản ứng lên thành tế bào hoá gỗ

2.1.2.1. Phản ứng với Floroglucin và acid clohydric

2.1.2.2. Phản ứng với Pemanganat Kali

2.1.2.3. Phản ứng với safranin

2.1.2.4. Phản ứng với safranin và xanh anilin

2.1.2.5. Phản ứng với anilin sulfat

2.1.2.6. Phản ứng với paranitroanilin

2.1.3. Các phản ứng lên thành tế bào hoá bần, cutin

2.1.3.1. Phản ứng của KOH lên bần

2.1.3.2. Phản ứng của H2SO4 lên cutin

2.1.3.3. Nhuộm màu bần, cutin bằng thuốc nhuộm màu chất béo

2.2. Các phản ứng lên cacbohydrat

2.2.1. Phản ứng xác định đường với phenyl hydrazin

2.2.2. Xác định tinh bột

2.2.3. Phản ứng xác định Inulin

2.2.4. Phản ứng thử chất nhầy

2.2.4.1. Phản ứng tủa trong cồn và nở trong nước của chất nhầy

2.2.4.2. Phản ứng nhuộm kép

2.2.4.3. Xác định chất nhầy bằng mực tàu

2.3. Phản ứng thử chất béo

2.4. Phản ứng xác định tinh dầu

2.5. Phản ứng xác định nhựa

2.5.1. Phản ứng với đồng acetat

2.6. Phản ứng thử saponin

2.6.1. Xác định saponin theo tính chất phá huyết

2.6.2. Phản ứng với antimon clorua

2.7. Phản ứng thử alcaloid

2.8. Phản ứng thử anthraglycosid

2.8.1. Phản ứng với kiềm

2.8.2. Quá trình vi thăng hoa

2.9. Phản ứng thử coumarin

2.9.1. Quan sát huỳnh quang khi mở vòng lacton

2.9.2. Quá trình vi thăng hoa

2.10. Phản ứng thử flavonoid

2.11. Phản ứng thử tanin

2.11.1. Phản ứng xác định tanin bằng muối sắt

2.11.2. Xác định tanin bằng dung dịch Kalibicromat

2.11.3. Xác định tanin bằng dung dịch amonimolipdat

3. Phân tích huỳnh quang

3.1. Khái niệm về huỳnh quang và phân tích huỳnh quang

3.2. Dụng cụ để nghiên cứu huỳnh quang

3.3. Chuẩn bị tiêu bản để nghiên cứu huỳnh quang

về đầu trang

1.1. Chuẩn bị nguyên liệu

Nguyên liệu để nghiên cứu có thể ở dạng tươi hoặc khô, khi kiểm nghiệm dược liệu tuỳ mục đích mà xử lý khác nhau. Nguyên liệu tươi ngay sau khi thu hái có thể dùng để làm các lát cắt, đôi khi được cố định trong các dung dịch khác nhau. Nguyên liệu khô phải làm mềm. Nghiên cứu đặc điểm các tổ chức, tế bào có thể tiến hành trên nguyên liệu đã được ngâm mủn.

1.1.1. Cố định nguyên liệu:

Mục đích của cố định trong kiểm nghiệm dược liệu là giữ lại trong mô, tế bào dược liệu các cấu trúc, các hoạt chất cần thiết cho những quá trình nghiên cứu tiếp theo. Tuỳ thuộc vào nguyên liệu, mục đích nghiên cứu mà tiến hành cố định trong các điều kiện khác nhau:

- Nghiên cứu giải phẫu thực vật, tế bào học, cần quan sát các thành phần cấu trúc chứa trong mô, tế bào, cần cố định bằng các chất định hình như Carnua, FAC, Navasin v.v...

- Nghiên cứu alcaloid thường cố định thực vật trong dung dịch acid picric hoặc dung dịch các thuốc thử alcaloid.

- Xác định hesperidin trong vỏ cam, quít v.v... cần cố định nguyên liệu trong cồn.

- Nghiên cứu tanin trong dược liệu thường cố định trong dung dịch Kali cromat, chì acetat v.v...

1.1.2. Làm mềm nguyên liệu.

Các dược liệu khô, cứng khi làm tiêu bản cần làm mềm trước, có nhiều phương pháp làm mềm: làm mềm lạnh, làm mềm trong buồng ẩm, làm mềm nóng v.v...

Làm mềm lạnh: Các phần cây: rễ, quả, hạt, các bộ phận dưới đất, thường tiến hành làm mềm bằng cách cho vào hỗn hợp Nước - Glycerin - Ethanol (1:1:1) mẫu được giữ cho đến khi các mô thấm no chất lỏng, theo cách này mất nhiều thời gian (tuỳ thuộc vào độ dày của mẫu và cấu trúc các mô mà ngâm vài ngày đến vài tuần) nhưng rất tốt bởi vì không khí được giải phóng ra khỏi các mô và một phần được làm sáng.

Phương pháp làm mềm đơn giản thường được sử dụng nhất: Ngâm mẫu vào nước một vài giờ sau khi mềm chuyển vào hỗn hợp Glycerin - Ethanol (1:1) hay Nước - Glycerin - Ethanol (1:1:1) giữ ở trong hỗn hợp 1 - 3 ngày. Trong hỗn hợp này mẫu có thể bảo quản lâu dài. Khi cần mẫu chắc hơn bỏ vào hỗn hợp Glycerin - Ethanol (1:2) ngâm một thời gian.

Làm mềm trong buồng ẩm: Có thể sử dụng bình hút ẩm kín. Cho nước vào bình và mẫu vào bát nhỏ, thả nổi bát trong bình. Mẫu không tiếp xúc với nước mà chỉ bị ẩm bởi hơi nước trong bình, phương pháp này tốn thời gian song là phương pháp tốt nhất vì nó đảm bảo giữ được cấu trúc tế bào và các thành phần khác mà không bị rửa đi, thăng hoa, trương phồng, nhầy hoá - là những hiện tượng thường xảy ra khi sử dụng các phương pháp làm mềm khác. Với dược liệu mềm, mỏng, làm ẩm khoảng một ngày, dược liệu cứng khoảng 2-3 ngày, để tránh mốc có thể xảy ra trong quá trình làm ẩm người ta thêm vào nước một ít phenol hoặc formaldehyd. Nhược điểm của phương pháp làm ẩm này là trong dược liệu còn lại nhiều khí cần phải loại khi làm tiêu bản.

Làm mềm nóng: là phương pháp đơn giản và nhanh, cho những mẩu dược liệu dài 2-3 cm vào nước, đun sôi. Vỏ thường đun khoảng 3-5 phút, các cơ quan khác tuỳ độ rắn và mức độ hoá gỗ của mô mà đun sôi trong 10-30 phút. Quả và hạt có thể làm ẩm bằng hơi nước, gói quả hay hạt vào vải màn, treo trong hơi nước đun sôi 15-30 phút hay hơn tuỳ thuộc vào độ cứng của chúng. Lá và hoa không yêu cầu xử lý lâu, phức tạp, để làm mềm và tẩy sáng đun chúng trong dung dịch cloral hydrat 66%. Sau khi đun lấy ra, rửa sạch bằng nước và làm các lát cắt. Đặc điểm của phương pháp làm mềm nóng là làm trương thành tế bào và rửa trôi chất tế bào.

1.1.3. Phương pháp ngâm mủn.

Trong nghiên cứu thực vật nói chung và kiểm nghiệm vi học dược liệu nói riêng thường sử dụng phương pháp ngâm mủn. Đó là phương pháp phân tách tế bào khác nhau nằm trong cấu tạo của các loại mô. Bằng cách này màng gắn giữa các tế bào bị phá huỷ, các tế bào tách rời nhau mà không bị hư hại do vậy ta có thể nghiên cưú chi tiết cấu tạo của từng tế bào một từ khắp mọi phía. Phương pháp ngâm mủn có ý nghĩa quan trọng trong nghiên cứu giải phẫu thực vật đặc biệt trong kiểm nghiệm dược liệu bằng phương pháp soi bột.

Tuỳ từng loại dược liệu mà sử dụng các phương pháp ngâm mủn khác nhau, cơ sở của đa số các phương pháp này là xử lý mô bằng acid mạnh, các acid sẽ thuỷ phân màng giữa làm nhiệm vụ nối các tế bào với nhau, một số trường hợp ngâm mủn bằng kiềm. Ngày nay người ta thường ngâm mủn bằng men pectinaza, khi dùng men quá trình thuỷ phân xảy ra trong điều kiện ôn hoà hơn nên không làm hỏng tế bào. Với nguyên liệu cứng rắn như gỗ có thể ngâm mủn bằng cách đun các mảnh nguyên liệu trong HNO3 10% khoảng vài phút, khi đạt độ mủn rửa sạch bằng nước rồi đặt vào một giọt nước trên phiến kính, dùng kim nhọn để tách rời các tế bào. Nếu nguyên liệu được xử lý tốt thì chỉ cần đậy lá kính rồi ấn nhẹ lên lá kính là các tế bào tự tách rời nhau. Người ta đánh giá quá trình ngâm mủn theo mức độ vụn nhỏ của mô khi ép dưới lá kính. Với nguyên liệu rắn có thể dùng dung dịch ngâm mủn Schulze: cho những mẩu nguyên liệu nhỏ vào ống nghiệm có chứa hỗn hợp 2 ml HNO3 đậm đặc và 0,3 g Kali clorat đun đến khi tạo bọt (tiến hành nơi thoáng gió hoặc trong tủ hốt) và để một vài phút cho đến khi mẩu nguyên liệu bị tẩy trắng. Để nguội, lấy nguyên liệu ra, rửa sạch bằng nước rồi tiến hành tiếp tục như trên. Với nguyên liệu rắn còn có thể ngâm mủn bằng hỗn hợp HNO3 10% và Kali dicromat 10 % theo tỷ lệ 1:1 ngâm 24-48 giờ ở 600C (Hỗn hợp này có thể dùng để ngâm mủn nguyên liệu mềm trong 24 giờ ở 300C). Với nguyên liệu mềm như lá cây, chồi, các loại thân cỏ có thể ngâm mủn trong dung dịch acid cromic 1% trong nước một vài ngày, có thể đun nhẹ để phản ứng nhanh hơn hoặc ngâm mủn bằng acid cromic 5% hoặc HCl 1N, ngâm mẫu trong các dung dịch này ở 300C trong vài giờ, sau khi ngâm rửa sạch và tiến hành như mô tả ở trên. Với nguyên liệu có chứa các ống tiết, ống nhựa mủ, túi nhựa và tinh dầu v.v... sử dụng phương pháp ngâm mủn bằng kiềm sẽ tách các mô mà không làm hỏng thành mỏng của các tế bào. Tiến hành cụ thể như sau: Đun sôi nguyên liệu trong NaOH 3-5% trong vòng 30 phút hoặc đun nóng trong dung dịch NH4OH 25% khoảng 40 phút.

Đối với các mẫu cây thảo, còn tươi thường dùng phương pháp tách bằng enzim. Mô được ủ ở nhiệt độ 370C trong 24 giờ với pectinaza 5% sau khi rửa để loại enzim tiến hành tiếp tục như trên.

Thông thường trong các mô có chứa khí ngăn cản quá trình thâm nhập của các tác nhân gây mủn vì vậy với các mẫu ngâm mủn bằng phương pháp không đun nóng cần phải đun sôi trước trong nước để loại không khí hoặc tiến hành loại không khí trong điều kiện chân không, cụ thể- thả những mẩu mô nhỏ (thường nhỏ hơn 0,5 cm) vào nước chứa trong bình, nối với bơm chân không, không khí trong bình được hút ra trong vòng 10-12 phút, lặp lại vài lần.

về đầu trang

1.2. Chuẩn bị và nghiên cứu tiêu bản hiển vi

Tiêu bản hiển vi thường được làm từ dược liệu đã được xử lí sơ bộ (1.1.). Cách làm tiêu bản phụ thuộc vào các đặc điểm hình thái, trạng thái của nguyên liệu (nguyên vẹn, các mảnh bị cắt rời, bột...) và mục đích nghiên cứu. Cơ sở của kiểm nghiệm hiển vi là giải phẫu thực vật và hoá thực vật (dựa vào các đặc điểm thực vật cũng như dựa vào các phản ứng vi hoá, mô hoá), trong quá trình kiểm nghiêm hiển vi cần có hiểu biết sâu sắc về cấu tạo giải phẫu, các cơ quan của cây cũng như trạng thái tồn tại, tính chất hoạt chất của dược liệu. Những kiến thức này có vai trò quan trọng trong việc xác định các đặc điểm, các phản ứng đặc trưng của đối tượng nghiên cứu, cho phép phân biệt các cơ quan tương tự của các dược liệu khác nhau. Sau đây là một số vấn đề cần lưu ý khi kiểm nghiệm dược liệu từ các cơ quan khác nhau.

1.2.1. Lá

Lá mỏng có thể quan sát dưới kính hiển vi không cần cắt lát, thông thường để tẩy sáng mô lá khô đun sôi lá trong dung dịch kiềm hoặc trong dung dịch cloral hydrat 30% trong vòng 10-15 phút. Các lá nhỏ khi tẩy sáng lấy cả lá, lá to hoặc lá bị cắt nhỏ lấy các phần khác nhau có chứa các yếu tố có thể dùng để chẩn đoán như mép lá, răng lá, gân chính, bề mặt trên, dưới v.v... Lá hoặc các mẩu lá sau khi tẩy sáng rửa bằng nước, lên kính trong glycerin hoăc dung dịch cloral hydrat. Lá dày cần phải làm các lát cắt ngang, một số lá có thể dùng dao sắc để tách phần biểu bì ra khỏi thịt lá.

Để nghiên cứu bột lá dùng kim mũi mác lấy một lượng nhỏ bột cho lên phiến kính đã có sẵn 2-3 giọt dung dịch cloral hydrat, nghiền bột cho thấm dung dịch, đặt phiến kính và đun nóng 2-3 phút để làm trong các mô lá (có thể đun đến khi tạo bọt khí), sau khi để nguội di nhẹ lên lá kính để tạo nên lớp bột mỏng, không chồng chéo lên nhau. Cần chú ý làm sạch lá kính và đủ chất lỏng để soi. Lá có chứa nhiều chất diệp lục làm sáng trong dung dịch như trên ít có hiệu quả. Trong trường hợp này có thể làm trong bột lá bằng dung dịch NaOH 3%, khi đun nóng dung dịch nhanh chóng bay hơi vì vậy cần chú ý theo dõi để tiêu bản không bị khô. Sau khi đun nóng cần thêm 1-2 giọt glycerin để ngăn cản sự kết tinh của kiềm và làm cho tiêu bản lâu khô. Các yếu tố đặc trưng chủ yếu để kiểm nghiệm lá là biểu bì, lông, tuyến, tinh thể.

Biểu bì: Lá của các cây khác nhau đặc trưng bởi các dạng tế bào biểu bì xác định, ở một số cây tế bào biểu bì có dạng uốn khúc nhiều hoặc ít, ở một số có nhiều góc, có khi tế bào biểu bì bị kéo dài rõ rệt theo một hướng v.v... Kích thước của tế bào biểu bì là một trong các yếu tố đặc trưng để xác định các cây. Tế bào biểu bì thường được bọc bởi một lớp màng mỏng cấu tạo từ cutin, đa số trường hợp cutin có bề mặt nhẵn song đôi khi tạo thành các nếp gấp thẳng hoặc lượn sóng, hay có những chỗ lồi dưới dạng u, mấu. Các đặc điểm của lớp cutin bao phủ biểu bì cũng như chiều dày của nó đặc trưng cho một số loại cây có ý nghĩa trong kiểm nghiệm dược liệu. Chiều dày của lớp cutin có thể quan sát rõ khi nhuộm tiêu bản (lát cắt ngang) bằng dung dịch Sudan III. Biểu bì lá có các lỗ khí, dạng của lỗ khí và sự phân bố của chúng (ở một mặt, hai mặt lá) và đặc điểm của các tế bào biểu bì bao quanh là những đặc điểm đặc trưng đối với mỗi dạng cây hoặc họ và là những đặc điểm có ý nghĩa trong kiểm nghiệm. Dựa vào đặc tính phân bố của lỗ khí và các tế bào biểu bì bao quanh người ta phân biệt ra nhiều kiểu:

-Kiểu lỗ khí không có tế bào kèm (Kim ngân)

-Kiểu hỗn bào: lỗ khí bao bọc bởi tế bào giống như tế bào biểu bì, không có tế bào phụ (họ Hoàng liên)

- Kiểu song bào: lỗ khí bao bọc bởi hai tế bào phụ nằm song song với trục dọc của nó (họ Cà phê)

- Kiểu trực bào: lỗ khí bao bọc bởi hai tế bào phụ nằm thẳng góc với trục dọc của lỗ khí (họ Cẩm chướng).

- Kiểu dị bào: lỗ khí bao bọc bởi ba tế bào phụ một tế bào nhỏ hơn rõ rệt so với hai tế bào kia (họ Cải) v.v...

Số lượng lỗ khí (số lỗ khí trên 1 mm2 biểu bì) và chỉ số lỗ khí (tỷ lệ lỗ khí và số tế bào biểu bì trên một đơn vị diện tích) thường là những đại lượng cố định đối với một loài, trong nhiều trường hợp chúng cho phép phân biệt các loài của cùng một chi.

ở các lát cắt ngang phiến lá khi quan sát mô giậu có thể thấy một hàng hay hai hàng, có thể chỉ có ở mặt trên hoặc cả hai mặt. Tỷ lệ mô giậu (số tế bào của mô giậu dưới mỗi tế bào biểu bì) cũng có ý nghĩa đặc trưng cho các loài.

Lông: ở phần lớn thực vật tế bào biểu bì mọc dài ra tạo thành lông. Lông có thể có ở nhiều phần của cây, chúng có thể tồn tại trong suốt đời sống của một cơ quan, hoặc chỉ một thời gian. Lông thường hết sức khác nhau trong các họ cây, các nhóm cây nhỏ hơn và ngay trong cùng một cây, đôi khi lại có sự khá đồng nhất về lông trong phạm vi một nhóm cây. Lông có thể phân chia thành nhiều loại hình thái khác nhau, về mặt cấu trúc lông có thể chia thành loại đơn bào và đa bào. Lông đơn bào có thể phân nhánh hay không phân nhánh. Lông đa bào có thể bao gồm một dãy tế bào riêng lẻ hoặc phân nhánh. Một số lông có các nhánh toả ra nhiều hướng trong một mặt phẳng (lông hình sao). Thường một lông đa bào có thể phân chia thành phần chân (phần bám vào biểu bì) và phần lồi trên bề mặt. Những tế bào quanh chân đôi khi về mặt hình thái khác hẳn với tế bào biểu bì khác. Có kiểu lông hình khiên gồm một phiến tế bào hình đĩa, phần nhiều được sinh ra trên một cán hoặc đính trực tiếp vào chân. Những lông đơn bào, đa bào và hình khiên có thể là lông tiết. Một số lông đa bào đơn giản có thể bao gồm một chân và một đầu đơn bào hoặc đa bào, các đầu thường tạo thành phần tiết của lông. Bề mặt lông có thể nhẵn hay sần sùi tuỳ thuộc vào đặc điểm của lớp cutin bao bọc. Kích thước của lông cũng rất khác nhau, ở một số cây lông có thể quan sát bằng mắt thường, có cây phải dùng kính lúp, kính hiển vi. Sự đa dạng của lông là một trong những yếu tố quan trọng nhất để phân biệt dược liệu. Người ta cũng đã sử dụng thành công việc phân loại các chi, thậm chí các loài ở một số họ và trong việc nhận biết cây lai giữa các loài dựa vào kiểu lông.

Các tuyến tiết, túi tiết, ống nhựa mủ: Trong lá nhiều cây có chứa tinh dầu, vị trí tinh dầu có thể rất khác nhau, ở một số cây tinh dầu chứa trong các tuyến tiết nằm trên bề mặt biểu bì (Bạc hà, Hương nhu) một số cây khác tinh dầu chứa trong các túi tiết (lá Bạch đàn). Cấu tạo của túi tiết, tuyến tiết tinh dầu thường đặc trưng cho mỗi chi cây, có khi đặc trưng cho toàn họ. Ví dụ họ Bạc hà có tinh dầu chứa trong các lông tiết hình bánh xe, nhiều cây trong họ Cúc có tuyến tiết gồm hai hàng tế bào xếp thành 3-4 lớp. Một số cây có các túi tiết, ống tiết đặc biệt chứa tinh dầu, nhựa, nhựa mủ. Đặc điểm và phân bố của tuyến tiết tinh dầu, các túi tiết, ống tiết với tinh dầu, nhựa, nhựa mủ trong đó là những đặc điểm đặc trưng để phân biệt các nguyên liệu khác nhau khi kiểm nghiệm dược liệu.

Tinh thể: Trong cây thường gặp các tinh thể calci oxalat, đôi khi có tinh thể của các chất khác như calci sulfat, calci cacbonat, oxyt silic (SiO3). Dạng của các tinh thể rất khác nhau và đặc trưng đối với mỗi loài cây, có khi đặc trưng cho chi thậm chí cho cả họ. Calci oxalat thường gặp dưới dạng đơn hoặc kép, hình lăng trụ, hình kim, bó, cầu gai, cát có khi tập trung thành khối, thông thường trong một cây calci oxalat thường ở một dạng nào đó, có những cây calci oxalat ở 2-3 dạng. Hình dạng các tinh thể cũng như vị trí của chúng có ý nghĩa trong kiểm nghiệm dược liệu. Các tinh thể calci oxalat không hoà tan trong nước và trong acid acetic mà hoà tan trong acid hydrocloric, acid nitric, acid sulfuric. Khi tác dụng với acid sulfuric xảy ra quá trình hoà tan tinh thể và lại tạo nên tinh thể calci sulfat, quá trình này xảy ra nhanh và có thể quan sát dưới kính hiển vi. Để quan sát tinh thể calci oxalat trong các cơ quan có thể sử dụng các chất lỏng làm sáng tiêu bản như cloral hydrat, lactophenol.

Khi nghiên cứu tinh thể nên sử dụng kính hiển vi phân cực vì dưới kính hiển vi phân cực thấy rất rõ các tinh thể, thậm chí có thể quan sát được những mảnh tinh thể rất nhỏ. Để nghiên cứu tinh thể dưới kính hiển vi phân cực có thể làm các tiêu bản cố định không nhuộm màu trong bôm Canađa. Trong lá một số cây có chứa nang thạch (đá túi) cũng là đặc điểm đặc trưng khi kiểm nghiệm dược liệu.

Khi nghiên cứu lá đã nghiền nhỏ một số yếu tố có thể bị biến dạng song phần lớn vẫn giữ nguyên dạng và các đặc điểm của chúng, đó là những yếu tố để xác định dược liệu khi kiểm nghiệm.

1.2.2. Hoa.

Trước khi làm tiêu bản cần làm mềm hoa hoặc các bộ phận của hoa (1.1.2.), sau khi rửa sạch bằng nước, đặt lên phiến kính trong một giọt chất lỏng để soi (nước, glycerin, dung dịch cloral hydrat) dùng kim mũi mác làm cho phẳng, đậy lá kính, nung nóng để loại không khí, nghiên cứu dưới kính hiển vi bề mặt các bộ phận của hoa. Các yếu tố có ý nghĩa trong kiểm nghiệm vi học hoa là: hạt phấn, biểu bì trong, ngoài của cánh hoa, đài hoa, lá bắc, tế bào của cuống hoa, lông, tinh thể calci oxalat, tuyến tiết tinh dầu...

Phân tích bột hoa cần chú ý tới các hạt phấn, các mảnh mô với tinh thể (nếu có), các mảnh biểu bì cánh hoa, các yếu tố cơ giới của lá bắc, lông. Trong nhiều trường hợp hạt phấn là yếu tố định hướng trong kiểm nghiệm.

1.2.3. Thân thảo

Xác định thân thảo chủ yếu theo lá, cần làm tiêu bản từ lá hoặc các mẩu lá (nếu dược liệu bị cắt nhỏ). Khi nghiên cứu thân thảo không có lá làm tiêu bản biểu bì và lát cắt ngang thân. Dược liệu phải được làm mềm (1.1.2.), làm tiêu bản, lên kính bằng nước, glycerin hay dung dịch cloral hydrat quan sát bề mặt biểu bì và cấu trúc giải phẫu . Với các mẩu thân bị cắt nhỏ có thể nghiên cứu bằng phương pháp ngâm mủn (2.1.3.) Làm tiêu bản từ bột dược liệu thân thảo cũng tiến hành như bột từ lá, không nên lấy những mảnh thân lớn vì khó làm sáng, hơn nữa những mảnh này ít có ý nghĩa trong kiểm nghiệm và gây khó khăn khi làm tiêu bản. Xác định dược liệu thân thảo tiến hành như với lá vì vậy những yếu tố có ý nghĩa trong kiểm nghiệm lá cũng có ý nghĩa trong kiểm nghiệm thân thảo. Bột cây thân thảo được phân biệt ở chỗ ngoài những yếu tố, đặc điểm của lá còn gặp các yếu tố, đặc điểm của thân, hoa, các bộ phận của quả. Với thân đặc điểm quan trọng nhất là biểu bì và hình dạng tế bào biểu bì. Mảnh mạch của thân thường lớn và thẳng phân biệt với mảnh mạch nhỏ, phân nhánh của lá. Trong bột dược liệu thân thảo thường gặp các yếu tố từ hoa như hạt phấn, biểu bì cánh hoa, nhị, các yếu tố từ quả: tế bào biểu bì vỏ quả, nếu quả chín có thể gặp các lớp vỏ hạt, các mảnh nội nhũ với dầu béo.

về đầu trang

1.2.4. Vỏ

Khi nghiên cứu vỏ thường làm các lát cắt ngang và dọc. Nguyên liệu sau khi xử lý (1.1.) tiến hành làm các lát cắt, lên kính trong dung dịch cloral hydrat, nước hay glycerin, đậy lá kính và đun nóng để làm sáng tiêu bản và loại không khí. Để làm rõ các cấu trúc hay hoạt chất xử lý lát cắt bằng các thuốc thử tương ứng.

Khi nghiên cứu các lát vỏ cắt ngang dưới kính hiển vi cần chú ý tới độ dày và đặc điểm cấu taọ của lớp bần, chiều rộng của tia tuỷ, các yếu tố cơ giới như sợi, libe, tế bào mô cứng, thể cứng, cấu tạo, phân bố và số lượng của chúng. Cấu tạo, kích thước của sợi, tế bào mô cứng quan sát rõ hơn trên các lát cắt dọc. Trong vỏ một số cây có ống nhựa mủ hay túi chứa tinh dầu có ý nghĩa trong kiểm nghiệm dược liệu.

Hầu như trong vỏ luôn có tinh thể calci oxalat chúng thường phân bố trong các mô mềm. Tinh bột cũng thường có trong mô mềm vỏ nhưng không có ý nghĩa kiểm nghiệm vì hầu như tất cả các hạt tinh bột gần tương tự nhau: nhỏ, hình tròn hoặc hình trái xoan. Các phản ứng vi hoá để phát hiện hoạt chất cũng như phản ứng xác định sự hoá gỗ của các yếu tố vỏ có vai trò lớn khi kiểm nghiệm.

1.2.5. Quả, hạt.

Khi nghiên cứu quả, hạt dưới kính hiển vi người ta thường làm các lát cắt ngang. Để nghiên cứu toàn diện cần làm và quan sát các lát cắt ngang qua các phần khác nhau của quả, hạt và nghiên cứu chi tiết ở những lát cắt phần giữa vì ở đó các yếu tố cấu trúc được thể hiện đầy đủ nhất. Để làm các lát cắt từ quả, hạt nhỏ cần cố định chúng trong parafin và đặt chúng cẩn thận đúng theo hướng xác định.

Vỏ quả có ý nghĩa quan trọng nhất trong kiểm nghiệm quả. ở một số quả vỏ quả có các ống, túi tiết tinh dầu, số lượng và phân bố của chúng là những đặc trưng chủ yếu đối với từng loại quả xác định.

Số lượng hạt, dạng hạt, phân bố của hạt trong quả, mô cơ giới của vỏ quả, lông biểu bì quả cùng với các phản ứng vi hoá xác định chất béo, tinh dầu, các yếu tố hoá gỗ v.v...là các vấn đề có ý nghĩa trong kiểm nghiệm quả, bột quả.

Khi nghiên cứu hạt dưới kính hiển vi cần chú ý tới cấu trúc chung của hạt (Đặc điểm vỏ hạt, độ lớn các mô dinh dưỡng, nội nhũ, dạng và vị trí của phôi, rễ mầm, các lá mầm) hình dạng, kích thước tế bào vỏ hạt có ý nghĩa phân biệt. Cấu tạo nội nhũ và các mô của phôi (trừ một vài dược liệu - Mã tiền, quả họ Cần) thường không khác nhau nhiều. Khi nghiên cứu bột hạt đặc điểm của lớp vỏ hạt là đặc trưng quan trọng nhất.

1.2.6. Rễ, củ và các cơ quan dưới đất.

Nghiên cứu hiển vi các cơ quan này tiến hành làm tiêu bản cũng như với các cơ quan khác song vì tinh bột là yếu tố có ý nghĩa lớn trong xác định nguyên liệu nên khi làm mềm (1.1.2.) cần sử dụng các phương pháp lạnh để giữ nguyên trạng thái của chúng. Nghiên cứu đặc điểm phân bố các mô dẫn (bó mạch dẫn) cần làm lát cắt qua tất cả các phần của rễ hay củ rễ và quan sát ở độ phóng đại nhỏ. Sau đó nghiên cứu chi tiết các cấu trúc, thành phần các mô với độ phóng đại lớn. Số lượng các lát cắt không cần nhiều song phải đại diện cho tất cả các phần có chứa các yếu tố khác nhau. Đầu tiên thường nghiên cứu các lát cắt không đun nóng để nhận xét sự có mặt của tinh bột, hình dạng và kích thước của chúng, sau đó đun nóng tiêu bản để tẩy sáng và nghiên cứu các đặc điểm giải phẫu. Thường sử dụng cloral hydrat làm chất lỏng lên kính, ít khi dùng glycerin và nước. Để nghiên cứu cấu trúc hay các chất thường xử lý lát cắt bằng các thuốc thử tương ứng. Nghiên cứu bột rễ và rễ củ thường bắt đầu với việc xác định các chất dinh dưỡng dự trữ, lên kính bột dược liệu trong nước hay trong dung dịch Lugol (đối với tinh bột) hay trong dung dịch Sudan III (đối với dầu béo). Để nghiên cứu những mảnh mô riêng biệt cần quan sát trong dung dịch cloral hydrat sau khi đun nóng (làm sáng). Đặc điểm cấu tạo, phân bố của các mô dẫn (gỗ, libe), sự biến đổi của chúng trong quá trình phát triển cá thể cùng với các đặc điểm giải phẫu khác (sợi, thể cứng, ống nhựa mủ, túi chứa tinh dầu, nhựa, hạt tinh bột, tinh thể) có ý nghĩa quan trọng trong kiểm nghiệm. Kết quả các phản ứng vi hoá định vị hoạt chất làm tăng thêm độ xác thực.

1.3. Các chất lỏng dùng để soi và làm sáng

Đặc tính môi trường để soi đặc biệt là những chất làm sáng tiêu bản có ý nghĩa rất quan trọng trong kỹ thuật vi học. Làm sáng tiêu bản tức là làm cho đối tượng nghiên cứu trở nên sáng hơn, rõ ràng hơn bằng cách loại bỏ ảnh hưởng của các thành phần trong tế bào cản trở sự quan sát. Các chất lỏng có thể làm sáng bằng tác dụng hoá học, dẫn tới phân huỷ, hoà tan, làm mất màu tất cả những thành phần “thừa” trong tiêu bản nghiên cứu hoặc bởi tác động vật lý vì có những chất trơ về mặt hoá học nhưng có hoạt tính quang học, tạo ra những điều kiện xác định để ánh sáng xuyên qua tiêu bản làm cho các chi tiết của đối tượng được quan sát tốt hơn. Các đối tượng quan sát được càng rõ khi sự khác nhau về chỉ số khúc xạ ánh sáng của nó với môi trường soi càng lớn. Các cấu trúc thành tế bào cellulose có chỉ số khúc xạ n=1,52. Chỉ số khúc xạ của glycerin n=1,47, của lactophenol n=1,48. Khi các đối tượng có cấu trúc tế bào mỏng, trong lên kính bằng nước (n=1,33) quan sát rõ hơn lên kính bằng glycerin và lactophenol. Nếu đối tượng ít trong suốt cần sử dụng chất lỏng để soi có chỉ số khúc xạ lớn, loại đối tượng này lên kính bằng glycerin và lactophenol sẽ trong suốt hơn khi lên kính bằng nước.

Để làm sáng tiêu bản sử dụng các chất lỏng khác nhau, tuỳ vào bản chất của đối tượng, mật độ (độ sít) của mô, các cấu trúc tế bào. Thông thường dùng nước, glycerin. cloral hydrat, kiềm, nước oxy già để soi và làm sáng. Ta lần lượt xét từng chất:

- Nước: là chất lỏng trung tính thường sử dụng để lên kính vì nước không làm biến đổi hình dạng, độ lớn của tế bào, cấu trúc và màu của mô. Các hạt tinh bột nhìn rõ trong môi trường nước, hạt alơron bị phân huỷ, dầu béo tập hợp lại thành giọt lớn, chất nhầy bị hoà tan, các mô tối khó phân biệt.

- Glycerin: Khi dùng pha loãng với nước theo tỷ lệ 1:1 (glycerin không pha loãng hút nước từ mô làm nhăn rúm mẫu và làm biến dạng chúng). Chỉ trường hợp khi nghiên cứu các chất hoà tan trong nước (Ví dụ: chất nhầy) sử dụng glycerin không pha hoặc pha nó với cồn theo tỷ lệ 1:1. Glycerin cũng là một chất lỏng trung tính nhưng so với nước nó có ưu điểm là lâu khô và có tính chất làm sáng nhẹ, dưới tác dụng lâu dài của glycerin các mô trở nên trong suốt hơn.

- Cloral hydrat: Sử dụng dưới dạng dung dịch đậm đặc trong nước để làm sáng các lát cắt dày, bột dược liệu trên kính hiển vi. Cloral hydrat là một trong những chất làm sáng tốt nhất, nó nhanh chóng thấm vào tế bào, loại bọt khí ra. Trong cloral hydrat các hạt tinh bột trương ra, dầu béo và tinh dầu ban đầu tập hợp lại thành giọt lớn hơn, sau đó dần dần bị hoà tan. Protein, clorofin và các chất khác bị phá huỷ, các mô có màu thẫm sáng lên, các tinh thể không bị biến đổi. Thông thường đun nóng các mẫu khi cho vào dung dịch cloral hydrat, đôi khi đun đến sôi nhẹ để tăng cường tác dụng làm sáng và rút ngắn thời gian. Nhược điểm của cloral hydrat là làm biến dạng các mô do thành tế bào trương phồng mạnh.

- Kiềm: sử dụng dung dịch trong nước, nồng độ kiềm và thời gian xử lý tuỳ vào đối tượng nghiên cứu, thường sử dụng dung dịch 3-5% đôi khi 10-15%. Dung dịch NaOH là chất làm sáng mạnh, trong dung dịch NaOH hạt tinh bột trương phồng và bị hồ hoá. Khi tác dụng lâu dài hay đun nóng dược liệu trong kiềm chất béo bị xà phòng hoá, protein bị hoà tan, các mô thẫm sáng ra. Trong dung dịch kiềm thành tế bào giãn nở, thay đổi hình dạng, kích thước và dễ bị vỡ khi bị tác động. Có thể dùng KOH hoặc NH4OH, NH4OH có ưu điểm là ít làm giãn nở thành tế bào.

- H2O2: sử dụng dung dịch 3% để làm sáng, nồng độ cao hơn H2O2 làm mủn các mô dược liệu.

1.4. Cách làm tiêu bản vi phẫu thực vật.

Tuỳ thuộc vào mục đích nghiên cứu có thể tiến hành làm tiêu bản dược liệu theo các quá trình khác nhau, tài liệu này giới thiệu phương pháp làm tiêu bản vi phẫu thường sử dụng phổ biến trong nghiên cứu thực vật.

Tiêu bản tạm thời: Khi nghiên cứu cấu tạo giải phẫu cần xác định nhanh, không giữ lại mẫu có thể làm tiêu bản đơn giản như sau:

1. Dược liệu tươi hay khô đã ngâm mềm cắt ngang hoặc cắt dọc bằng lưỡi dao cạo hoặc dụng cụ cắt vi phẫu cầm tay, chọn các lát cắt mỏng.

2. Ngâm nước Javen hay dung dịch cloramin để tẩy các chất có chứa trong các tế bào, thời gian ngâm tuỳ loại nguyên liệu, có thể rút ngắn thời gian bằng cách đun nóng.

3. Rửa nước: nếu vi phẫu có nhiều tinh bột cần tẩy thì sau khi rửa ngâm hoặc đun trong cloral hydrat rồi rửa nước lần nữa.

4. Rửa bằng acid acetic.

5. Rửa bằng nước.

6. Nhuộm vi phẫu bằng lục iốt, lục metyl hoặc xanh metylen thời gian nhuộm tuỳ vào quá trình bắt màu của đối tượng (thường khoảng 10 giây đến 1 phút).

7. Rửa cồn, nếu dùng xanh metylen thì chỉ cần rửa bằng nước.

8. Nhuộm đỏ son phèn, thời gian nhuộm tuỳ đối tượng (có thể từ khoảng 1 phút đến 1 giờ).

9. Rửa nước.

10. Đặt vi phẫu vào một giọt glycerin trên phiến kính, đậy lá kính, soi trên kính hiển vi.

Tiêu bản cố định: Tiêu bản sau khi nhuộm xong đã rửa bằng nước (9) tiến hành tiếp tục như sau:

10. Loại nước lần lượt bằng cồn 30%, 50%, 70%, 95% và cồn tuyệt đối.

11. Lắc vi phẫu ba lần trong xylen.

12. Đặt vi phẫu vào một giọt bôm canada trên phiến kính, đậy lá kính, để ở chỗ thoáng 2-3 tuần.

Mẫu sau khi cố định có thể bảo quản nhiều năm không thay đổi màu sắc.

về đầu trang

2. Phân tích vi hoá dược liệu

Từ “phân tích vi hoá” dùng trong tài liệu này để chỉ phương pháp phân tích dựa vào các phản ứng hoá học, quá trình vật lý quan sát kết quả dưới kính hiển vi. Phân tích vi hoá bổ sung thêm tư liệu để định tính dược liệu, cho phép phát hiện các chất trực tiếp trong mô và tế bào, cho khả năng xác định vị trí hoạt chất trong mô.

Các lát cắt để tiến hành phản ứng vi hoá không được mỏng quá, phải có một vài lớp tế bào chưa bị phá huỷ khi cắt, có chứa các chất nghiên cứu. Có thể tiến hành phản ứng vi hoá trên lát cắt tươi, khô hay lát cắt từ các dược liệu đã được ổn định bằng các phương pháp đặc biệt.

Phản ứng vi hoá cho phép phát hiện các chất với số lượng nhỏ vì vậy phải đặc biệt chú ý đến sự lẫn tạp có thể xảy ra trong quá trình tiến hành. Khi tiến hành phân tích vi hoá cần tuân thủ các nguyên tắc sau:

- Phương pháp chỉ có ý nghĩa trong trường hợp phản ứng tiến hành là đặc trưng.

- Trong tất cả các trường hợp cần tiến hành song song với các mẫu đối chứng. Kết quả có độ tin cậy cao khi tiến hành bằng những phương pháp có bản chất khác nhau thu được kết luận như nhau.

- Cần tiến hành các phản ứng vi hoá với tác phong cẩn thận, tỉ mỉ, chính xác. Ngoài ra cần chú ý tới các yếu tố có thể ảnh hưởng tới kết quả nghiên cứu. Ví dụ: Nhiều thuốc thử không bền phải bảo quản ở những điều kiện đặc biệt hoặc dùng thuốc thử mới pha. Một số phản ứng vi hoá yêu cầu tiến hành và quan sát kết quả rất nhanh khi các chất nghiên cứu chưa bị phân tán hay các mô chưa bị phá huỷ bởi tác dụng của thuốc thử.

- Nhiều dược liệu khi đưa vào sử dụng được chế biến bằng các phương pháp khác nhau: ngâm nước, đun, tẩm cồn, giấm v. v... khi phân tích vi hoá dược liệu cần chú ý tới sự ảnh hưởng của các quá trình này.

2.1. Các phản ứng lên thành tế bào

2.1.1. Các phản ứng lên thành tế bào cellulose (không hoá gỗ)

Cellulose là chất chủ yếu của thành tế bào thực vật, phần non của cây thành tế bào cấu tạo chỉ từ cellulose tinh khiết. Khi các tế bào già hơn thành tế bào thấm các chất hữu cơ, các chất khoáng khác nhau. Cellulose gần như nguyên chất chỉ có ở các sợi bông, sợi lanh và một vài loại sợi khác. Cellulose là một polisaccarit (C6H10O5) n phân tử lớn, không hoà tan trong acid yếu và các dung môi khác, thành tế bào cellulose trong suốt, có tính khúc xạ kép, chỉ số khúc xạ n=1,52.

2.1.1.1. Phản ứng với Kẽm clorua - Iốt.

Phản ứng tiến hành trên phiến kính. Đặt lát cắt vào một giọt nước cho giãn thẳng ra, thấm nước bằng giấy thấm, nhỏ một giọt thuốc thử lên lát cắt, đậy lá kính, quan sát dưới kính hiển vi. Thành tế bào cấu tạo từ cellulose tinh khiết (nguyên chất) sẽ có màu xanh tím hoặc màu hoa cà (thành đã hoá gỗ hay hoá suberin thì có màu vàng nâu).

2.1.1.2. Phản ứng hoà tan trong thuốc thử Sveize.

Đặt lát cắt vào một giọt thuốc thử trên phiến kính, đậy lá kính và quan sát dưới kính hiển vi. Ban đầu thấy rõ các chi tiết cấu trúc thành tế bào, sau đó chúng trương phồng và hoà tan dần dần, thành tế bào hoá gỗ, cutin không hoà tan trong thuốc thử này.

2.1.2. Các phản ứng lên thành tế bào hoá gỗ.

2.1.2.1. Phản ứng với floroglucin và acid hydrocloric.

Đặt lát cắt lên phiến kính trong dung dịch floroglucin 1% trong cồn. Hút thuốc thử bằng giấy lọc, nhỏ lên lát cắt một giọt acid hydrocloric đặc qua 1-2 phút thêm một giọt glycerin, đậy lá kính và quan sát ở kính hiển vi với độ phóng đại nhỏ, thành tế bào hoá gỗ có màu tím đỏ tươi, độ đậm của màu xác định mức độ hoá gỗ.

2.1.2.2. Phản ứng với Pemanganat Kali

Bỏ các lát cắt vào dung dịch KMnO4 1% trên mặt kính đồng hồ, sau 5 phút rửa bằng nước và đặt vào acid hydrocloric 10% trong 2 phút, rửa sạch và chuyển lên phiến kính trong một giọt dung dịch NH4OH đậy lá kính và quan sát, thành tế bào hoá gỗ nhuộm màu đỏ.

Phản ứng với floroglucin và với pemanganat Kali dùng để phát hiện các thành phần khác nhau cuả lignin (gỗ) (lignin F và lignin M) vì vậy kết quả thu được khi tiến hành hai phản ứng này có khi không trùng khớp.

Thành tế bào hoá gỗ dễ nhuộm màu bằng các thuốc nhuộm, thường sử dụng safranin hay kết hợp nó với các thuốc nhuộm khác nhuộm thành tế bào cellulose.

2.1.2.3. Phản ứng với safranin.

Các lát cắt cho vào lọ đậy kín có chứa safranin 1% trong cồn 500, ngâm trong 30 phút, rửa bằng cồn 500 sau đó rửa bằng cồn acid hoá (100 ml cồn thêm 2 giọt HCl đậm đặc) để rửa màu ra khỏi các yếu tố không hoá gỗ (5-10 giây) chuyển lên phiến kính, soi trong một giọt glycerin, thành tế bào hoá gỗ nhuộm thành màu đỏ.

2.1.2.4. Phản ứng với safranin và xanh anilin.

Ngâm các lát cắt trong dung dịch safranin 1% trong cồn 500 trong 24 giờ, rửa bằng cồn 500 và chuyển vào dung dịch xanh anilin 1% trong cồn 2-3 phút, rửa bằng cồn 500 lại chuyển vào cồn acid hoá vài giây, rửa bằng cồn có vết soda, sau đó lại rửa bằng cồn tinh khiết và đặt vào một giọt glycerin, đậy lá kính, quan sát trên kính hiển vi: thành tế bào hoá gỗ bắt màu đỏ, thành tế bào cellulose bắt màu xanh.

2.1.2.5. Phản ứng với anilin sulfat.

Đặt lát cắt vào một giọt thuốc thử trên phiến kính, đậy lá kính, quan sát trên kính hiển vi, thành tế bào hoá gỗ chuyển thành màu vàng.

2.1.2.6. Phản ứng với paranitroanilin.

Đặt lát cắt vào một giọt dung dịch paranitroanilin 1% thành tế bào hoá gỗ nhanh chóng nhuộm thành màu vàng cam, chuyển lát cắt vào một giọt glycerin và quan sát dưới kính hiển vi.

2.1.3. Phản ứng lên thành tế bào hoá bần, cutin.

Thành tế bào hoá bần (suberin) và cutin không cho phản ứng đặc trưng của cellulose. Bần và cutin trong thành phần của thành tế bào có thể thấy được khi nhuộm bằng các thuốc nhuộm đặc hiệu hoặc bằng các thuốc nhuộm dùng để nhuộm chất béo.

2.1.3.1. Phản ứng của KOH lên bần.

Đặt lát cắt trong KOH đậm đặc, thành tế bào hoá bần nhuộm thành màu vàng, khi hơ nóng màu đậm lên phản ứng tiến hành trên phiến kính, nếu đun đến sôi các lát cắt trong KOH từ thành tế bào xuất hiện các giọt màu vàng. Trong trường hợp thành tế bào đồng thời hoá gỗ và hoá bần cần phải xử lý trước lát cắt bằng nước javen sau đó rửa bằng dung dịch HCl 1% để loại lignin ra khỏi thành tế bào và tiến hành phản ứng lên bần. Phản ứng này cũng xảy ra với cutin nhưng chậm hơn. Có thể phân biệt thành tế bào hoá gỗ và hoá bần như sau: Xử lý các lát cắt trong vòng 2-3 giờ bằng nước javen sau đó cho lát cắt vào thuốc thử kẽm clorua - iốt (2.1.1.1.) tiến hành trên phiến kính, quan sát dưới kính hiển vi sẽ thấy thành tế bào hoá gỗ nhuộm thành màu hoa cà, bần thành màu vàng.

về đầu trang

2.1.3.2. Phản ứng của H2SO4 lên cutin.

Đặt lát cắt vào một giọt H2SO4 đậm đặc trên phiến kính, đậy lá kính và quan sát dưới kính hiển vi cutin và các lớp cutin nhuộm thành màu vàng thẫm hoặc nâu.

2.1.3.3. Nhuộm màu bần, cutin bằng thuốc nhuộm màu chất béo.

Lát cắt đặt vào một giọt thuốc thử Sudan III đun nóng nhẹ để rút ngắn quá trình nhuộm màu, thấm thuốc nhuộm bằng giấy lọc, cho lát cắt vào một giọt glycerin, đậy lá kính, quan sát trên kính hiển vi: thành tế bào hoá bần và cutin nhuộm thành màu đỏ cam.

Có thể tiến hành phản ứng tương tự với dung dịch đỏ Sarlac 0,1-0,2% trong cồn 700. quá trình nhuộm màu 20-30 phút nếu không hơ nóng hoặc nhanh hơn nếu hơ nóng nhẹ.

2.2. Các phản ứng lên cacbohydrat.

2.2.1. Phản ứng xác định đường với phenyl hydrazin.

Thường tiến hành làm hai tiêu bản. trên phiến kính đặt các lát cắt vào thuốc thử, đậy lá kính, tiêu bản thứ nhất để ở nhiệt độ phòng, tiêu bản thứ hai hơ nóng trên nồi cách thuỷ trong vòng nửa giờ, sau đó làm lạnh, trong thời gian đun trên cách thuỷ khi có đường các lát cắt và chất lỏng nhuộm thành màu vàng và khi làm lạnh tiêu bản quan sát thâý xuất hiện tinh thể hình kim vàng của ozazon tập hợp lại thành bó, hình sao v.v... Tiêu bản để lạnh không đun tạo thành tinh thể ozazon chậm (trong vòng vài giờ, thậm chí vài ngày) và phần lớn tạo thành tinh thể dạng cầu. Phản ứng với phenylhydrazin có ưu điểm cho phép xác định vị trí của đường vì các tinh thể tạo thành chỉ trong các tế bào chứa đường, hơn nữa phản ứng cho phép phân biệt các dạng đường có trong cây vì khi phản ứng ở điều kiện thường và đun cách thuỷ 10 phút chỉ tạo thành tinh thể ozazon với các đường đơn. Nếu trong tế bào có đường đôi (saccaroze) thì tinh thể ozazon chỉ được tạo thành khi đun nóng lâu (khoảng 1-2 giờ) đường đôi bị thuỷ phân tạo thành đường đơn và tạo thành ozazon với phenyl hydrazin.

2.2.2. Xác định tinh bột.

Tinh bột quan sát rất rõ trong nước và glycerin, do có tính khúc xạ kép hạt tinh bột khi quan sát dưới kíng hiển vi phân cực có hiện tượng chữ thập đen, nơi giao nhau của chữ thập là trung tâm phân lớp (rốn) của hạt. Phản ứng với iốt là phản ứng màu duy nhất của tinh bột. Tuỳ điều kiện cụ thể mà người ta sử dụng các dung dịch chứa iốt khác nhau. Ví dụ: Mayer, Lugol, Iốt/ Cloralhydrat, Iốt/ acid lactic. Để phát hiện tinh bột khi nó có lượng rất nhỏ, ví dụ : trong lục lạp, hạt phấn, túi phôi dùng dung dịch Iốt đậm đặc hơn (khoảng 2g/100 ml). Dung dịch Iốt/ Cloralhydrat nhuộm tinh bột đồng thời với làm sáng tiêu bản, tiện lợi để phát hiện tinh bột trong lục lạp của lá, có thể quan sát trực tiếp mà không cần làm các lát cắt. Phản ứng được thấy rõ hơn nếu lá, lát cắt được xử lý trước bằng cồn để chiết chất diệp lục. Iốt/ acid lactic được dùng chủ yếu khi xác định tinh bột của các dược liệu dưới dạng bột, thuốc thử vừa có tính chất làm sáng, vừa nhuộm tinh bột. Một số chất có trong tế bào thực vật (tanin) làm chậm phản ứng iốt với tinh bột. Phản ứng iốt với tinh bột là phản ứng thuận nghịch, tinh bột nhuộm màu bởi iốt bị mất màu tương đối nhanh nhất là khi đun nóng. Hầu hết tinh bột bị nhuộm bởi iốt thành màu xanh, song có một số cây có chứa tinh bột nhuộm với iốt thành màu đỏ hoặc đỏ tím gọi là “tinh bột đỏ” mặc dù về mặt bản chất còn nhiều ý kiến chưa thống nhất song nó có ý nghĩa quan trọng trong kiểm nghiệm dược liệu.

2.2.3. Phản ứng xác định Inulin.

Inulin là hydratcacbon thuộc nhóm polisaccarit gần giống tinh bột song hoà tan trong dịch tế bào. Inulin có trong rễ nhiều loai cây thuộc họ Cúc, họ Hoa chuông... Khi cố định nguyên liệu trong cồn Inulin tạo thành các tinh thể hình dạng kích thước khác nhau tuỳ thuộc độ cồn và điều kiện kết tinh, trong nước nóng các tinh thể inulin bị hoà tan. Xác định inulin trong dược liệu tiến hành như sau: Dược liêu tươi cắt thành mẩu, ngâm trong cồn vài ngày, lấy ra, cắt lát, lên kính trong cồn hoặc glycerin, quan sát dưới kính hiển vi sẽ thấy các tinh thể inulin có hình dạng và kích thước khác nhau. Tinh thể inulin có tính khúc xạ kép, thấy rõ dưới kính hiển vi phân cực, nếu tinh thể inulin được tạo thành ở dạng cầu (kết tinh chậm) thì dưới kính hiển vi phân cực sẽ thấy hiện tượng chữ thập đen như hạt tinh bột. Khi thêm nước và đun nóng tinh thể inulin bị tan.

Phản ứng Molisa xác định hydratcacbon.

Là phản ứng cho kết quả dương tính với tất cả các hydratcacbon (đường, tinh bột, inulin). Trên phiến kính đặt lát cắt vào dung dịch thymol 15% (hoặc a- naphtol) trong cồn, thêm một giọt acid sulfuric đặc, đậy lá kính và quan sát dưới kính hiển vi. Khi có hydratcacbon xuất hiện màu đỏ cam (thymol) hay tím đỏ (a- naphtol). Phản ứng này còn có tác dụng lên thành tế bào hoá gỗ tạo màu xanh biển đến xanh lục. Với bột dược liệu tiến hành trên mặt kính đồng hồ và quan sát bằng mắt thường.

2.2.4. Phản ứng thử chất nhầy.

2.2.4.1. Phản ứng tủa trong cồn và nở trong nước của chất nhầy.

Lát cắt dược liệu tươi cho vào cồn, đậy lá kính, quan sát dưới kính hiển vi. Chất nhầy thấy được trong các tế bào dưới dạng hạt khúc xạ ánh sáng mạnh. nếu thêm nước vào một phía của lá kính và phía kia hút cồn bằng một mảnh giấy lọc có thể thấy chất nhầy dần dần trương phồng trong nước. Thay nước bằng cồn quá trình xảy ra ngược lại.

2.2.4.2. Phản ứng nhuộm kép.

Lát cắt đặt vào dung dịch FeCl3 khoảng 20 phút sau đó chuyển vào dung dịch xanh metylen 2-3 phút, rửa bằng nước, lên kính bằng glycerin, soi dưới kính hiển vi, các tế bào có chứa chất nhầy bị nhuộm thành màu vàng, sợi thành màu xanh da trời, mạch gỗ màu xanh lá cây.

2.2.4.3. Xác định chất nhầy bằng mực tàu.

Bột dược liệu cho vào một giọt mực tàu trên phiến kính, dầm cho thấm đều bằng kim mũi mác, đậy lá kính, quan sát dưới kính hiển vi. Trên vi trường có màu xám tối (gần như đen) có những vết sáng của chất nhầy (vì chất nhầy không thấm mực tàu).

2.3. Phản ứng thử chất béo.

Chất béo chứa trong dược liệu là chất dự trữ, thường chứa trong cây với tỷ lệ lớn. Khi nghiên cứu dược liệu chứa chất béo sử dụng dược liệu tươi không cố định hoặc các dược liệu khô.

Chất béo dễ bị nhuộm màu bởi các thuốc nhuộm khác nhau. Phương pháp nhuộm đơn giản nhất là dùng Sudan III. Đặt lát cắt vào dung dịch nhuộm, đậy lá kính và hơ nóng nhẹ để làm nhanh quá trình nhuộm, đem quan sát dưới kính hiển vi. Nhuộm bằng Sudan III có thể tiến hành theo cách khác: Ngâm lát cắt vào dung dịch nhuộm một ngày đêm sau đó rửa bằng cồn 500, đặt lát cắt lên phiến kính trong glycerin và quan sát dưới kính hiển vi. Sudan III nhuộm chất béo thành màu đỏ cam, các phản ứng nhuộm màu bằng các thuốc nhuộm khác tiến hành tương tự song các phản ứng nhuộm màu chất béo không đặc trưng vì chúng nhuộm cả tinh dầu, nhựa, cutin, suberin. Nhuộm màu chất béo bằng thuốc nhuộm huỳnh quang là phương pháp có độ nhạy cao và cho khả năng xác đinh vị trí của chất béo trong mô, tế bào chính xác hơn là sử dụng Sudan III. Thuốc nhuộm huỳnh quang thích hợp nhất là 3.4. benzpiren, focfin 3R và đỏ trung tính, các thuốc nhuộm này được chất béo hấp thu mạnh. Để thu được kết quả có độ tin cậy cao cần tiến hành phản ứng xà phòng hoá: lát cắt dược liệu được đặt vào dung dịch KOH 15% trong nước và đun nóng nhẹ sau một thời gian các tinh thể hình kim (muối của các acid béo) được tạo thành, đem quan sát trên kính hiển vi (phản ứng xà phòng hoá theo Rozentaler). Phản ứng có thể thực hiện theo cách khác: trên phiến kính đặt một giọt dung dịch KOH 15% và một giọt NH4OH 20% đặt lát cắt vào hỗn hợp, đậy lá kính lên, mép lá kính viền bao quanh bằng parafin nóng chảy để chống khô, qua 1-2 ngày xung quanh dầu tạo thành các tinh thể (muối của các acid béo) quan sát ở kính hiển vi thường và kính hiển vi phân cực.

2.4. Phản ứng xác định tinh dầu.

Tinh dầu là một hỗn hợp phức tạp của các chất. Trong cây chúng định vị ở các túi có dạng khác nhau hay trong các tế bào đặc biệt. Có thể nhận ra tinh dầu ở trong tiêu bản không cần sử dụng thuốc nhuộm, chúng có dạng hạt, khúc xạ ánh sáng mạnh, khi quan sát giọt tinh dầu có thể có màu vàng nhat, vàng sẫm, xanh vàng hay nâu đỏ. Để nhuộm tinh dầu sử dụng thuốc nhuộm như là nhuộm chất béo, nhựa (Sudan III) để phân biệt tinh dầu với chất béo, nhựa sử dụng dung dịch xanh metyl trong nước (0,1 g xanh metyl/ 500 ml nước) các mẫu cắt đặt vào thuốc thử sau vài phút rửa, đặt vào nước hoặc glycerin, đậy lá kính, soi dưới kính hiển vi tinh dầu được nhuộm thành màu xanh. Dùng thuốc nhuộm xanh indophenol cũng cho két quả tương tự. Có thể phân biệt tinh dầu với chất béo, nhựa dựa trên tính chất bay hơi, hoà tan của chúng: các mẫu đem đun sôi trong nước tinh dầu bay hơi, chất béo không bay hơi cho phản ứng với thuốc nhuộm.

về đầu trang

2.5. Phản ứng xác định nhựa.

Nhựa có chứa trong cây ở các túi đặc biệt, các ống nhựa, đôi khi kết hợp với tinh dầu. Để xác định nhựa thường sử dụng phản ứng nhuộm màu song các phản ứng này không đăc trưng.

2.5.1. Phản ứng với đồng acetat.

Cho các mẩu dược liệu vào đồng acetat bão hoà, sau vài ngày lấy ra, cắt lát, lên kính trong một giọt glicerin và quan sát dưới kính hiển vi. Nhựa được nhuộm thành màu lục ngọc bích.

Một số thuốc nhuộm khác như Sudan III, xanh metyl v.v... nhuộm màu nhựa song cũng nhuộm nhiều thành phần khác trong cây (chất béo, tinh dầu, cutin).

2.6. Phản ứng thử saponin.

Phát hiện saponin bằng phương pháp vi hoá không hoàn toàn chắc chắn vì không có phản ứng đặc trưng nào có thể tiến hành trên mô thực vật. Phản ứng tin cậy hơn cả là dựa vào tính chất phá huyết của saponin.

2.6.1. Xác định saponin theo tính chất phá huyết.

Lát cắt dược liệu tươi đặt lên một mẩu gelatin huyết đậy lá kính và để 30-40 phút. Khi có saponin trong dược liệu xung quanh lát cắt tạo thành vùng đỏ, trong, gọi là “vùng tan huyết”

Điều chế gelatin huyết: cho 2-3 giọt huyền phù hồng cầu hay máu loại fibrin trong dung dịch NaCl đẳng trương vào 2-3 ml dung dịch gelatin 6-8% sau khi gelatin đông kết dưới dạng lớp mỏng (dày 2-3 mm) cắt thành mẩu nhỏ, gelatin huyết sau khi điều chế phải dùng ngay.

2.6.2. Phản ứng với antimon clorua

Lát cắt dược liệu tươi xử lý 2-3 phút bằng hơi amoniac và cố định trong aceton, sau vài phút lấy ra, aceton bay hơi. Đặt lên phiến kính, nhỏ vào lát cắt một giọt dung dịch antimon clorua bão hoà trong cloroform, hơ nóng nhẹ, cho một giọt dầu vaselin vào lát cắt, đậy lá kính và quan sát dưới kính hiển vi. Saponin dưới tác dụng của antimon clorua cho màu đỏ điều đến đỏ tím và nhìn rõ dưới dạng hạt, cục vón trong lớp vách của chất nguyên sinh.

2.7. Phản ứng thử alcaloid

Trong cây các alcaloid tồn tại dưới dạng hoà tan trong dịch tế bào. Trong cây khô chúng bị hấp thu, vón vào các thành phần cấu trúc khác của tế bào. Để nghiên cứu alcaloid thường dụng dược liệu khô hoặc dược liệu tươi vừa thu hái. Tránh cho dược liệu tươi vào nước vì trong điều kiên này alcaloid dễ bị phân huỷ. Để giữ alcaloid có thể xử lý dược liệu tươi bằng cồn đun sôi để phá huỷ men.

Có thể phát hiện alcaloid bàng thuốc thử tạo tủa hay tạo màu. Cần song song tiến hành phản ứng thử với các tiêu bản đối chứng đã rửa alcaloid bằng cồn acid hoá. Thông thường đặt các lát cắt vào lọ nút kín 5-7 ngày với dung dịch tactric 5% trong cồn, 2-3 ngày thay dung môi mới một lần.

Phản ứng tủa alcaloid: khi tiến hành phản ứng tủa có thể sử dụng bất kỳ thuốc thử tạo tủa với alcaloid. Ví dụ: Dragendorff, Mayer, muối Reinecke v.v... Kết quả tốt nhất thường thu được khi sử dụng dung dịch acid picric, acid này tạo tinh thể picrat với nhiều alcaloid.

Phản ứng tủa alcaloid tiến hành trên phiến kính: đặt lát cắt cây tươi vào một giọt thuốc thử, đậy lá kính, quan sát kết quả phản ứng dưới kính hiển vi, so sánh với kết quả đối chứng.

Có thể tiến hành phản ứng theo cách khác: Ngâm các mẩu dược liệu vào một trong các thuốc thử trên 1-2 tuần sau đó cắt lát, lên kính trong một giọt glycerin, so sánh kết quả thu được với tiêu bản đối chứng.

Bằng phản ứng tạo tủa có thể xác định được vị trí của các alcaloid trong các mô của cây.

Với dược liệu khô và bột dược liệu phát hiện alcaloid như sau: đặt bột dược liệu nghiên cứu lên phiến kính, thêm 1-2 giọt acid acetic 5%, đậy lá kính, hơ nóng nhẹ. Sau 1-2 phút đặt một lá kính thứ hai bên cạnh để kéo chất lỏng sang, cất lá kính thứ nhất và lau sạch bột, cho một giọt thuốc thử alcaloid (Dragendorff, Mayer, muối Reinecke) bên cạnh lá kính, thuốc thử thấm vào dưới lá kính, phản ứng với dịch chiết, quan sát kết quả phản ứng dưới kính hiển vi.

Một số alcaloid trong dược liệu có thể tiến hành xác định bằng các phản ứng màu đặc hiệu hoặc quá trình vi thăng hoa (2.8.2.).

2.8. Phản ứng thử anthranoid

2.8.1. Phản ứng với kiềm

Lát cắt dược liệu đặt lên một giọt NaOH 5% hay NH4OH trên phiến kính, thêm một giọt glycerin, đậy lá kính và quan sát dưới kính hiển vi. Mô có chứa anthranoid nhuộm thành màu đỏ hay đỏ tím, màu đỏ dần dần phân tán trên toàn bộ lát cắt. Màu rực rỡ chỉ tạo nên với dẫn chất của anthraquinon, dẫn chất của anthron và anthranon với kiềm nhuộm thành màu vàng. Trong trường hợp này màu có thể tăng lên bằng cách xử lý sơ bộ lát cắt bằng H2O2.

2.8.2. Quá trình vi thăng hoa

Cho một lượng nhỏ bột dược liệu chứa anthranoid vào một nắp kim loại, đậy bằng một phiến kính, phía trên để giấy lọc hoặc bông thấm nước làm lạnh, đun trên bếp điện (qua lưới amian) luôn thay bông, giấy lọc để quá trình làm lạnh tốt. Anthranoid thăng hoa và ngưng tụ ở bề mặt dưới của phiến kính. Dưới kính hiển vi quan sát thấy các tinh thể, với các dược liệu khác nhau thường cho các tinh thể khác nhau, trong một số trường hợp có thể dựa vào hình dáng, cách sắp xếp các tinh thể để xác định dược liệu. Trong dung dịch KOH/ cồn các tinh thể hoà tan, thường cho màu đỏ. Quá trình vi thăng hoa có thể tiến hành để phát hiện sự có mặt trong dược liệu acid benzoic và một số hoạt chất thuộc nhóm coumarin, ancaloid, dẫn chất terpen.

2.9. Phản ứng thử coumarin

Trong cây coumarin có thể ở dạng tự do hoặc dạng kết hợp glycosid. Xác định coumarin trong dược liệu dựa vào phản ứng mở vòng lacton, quá trình vi thăng hoa.

2.9.1. Quan sát huỳnh quang khi mở vòng lacton

Khi mở vòng lacton của coumarin bằng kiềm thì coumarin tạo thành dẫn chất hydroxy cinamic ở dạng cis (acid cumarinic) chất này dưới tác dụng của tia tử ngoại (kính hiển vi huỳnh quang) thì chuyển thành dạng trans (o. cumaric acid) có huỳnh quang sáng hơn.

Cách tiến hành: đặt lát cắt dược liệu lên phiến kính, nhỏ lên một giọt NaOH 5%, sấy nhẹ. Quan sát dưới kính hiển vi với độ phóng đại nhỏ, che một nửa lát cắt bằng mảnh kim loại. Sử dụng phương pháp huỳnh quang phản xạ, quan sát lát cắt trong vài phút, cất mảnh kim loại sẽ thấy phần bị che có huỳnh quang yếu hơn phần không bị che, khi tiếp tục quan sát huỳnh quang ở phần bị che dần dần sáng lên.

2.9.2. Quá trình vi thăng hoa (xem 2.8.2.)

Sau khi vi thăng hoa cho coumarin tác dụng với KI sẽ tạo thành tinh thể Iodocoumarin màu nâu sẫm hoặc tím. Quan sát coumarin dưới kính hiển vi huỳnh quang.

2.10. Phản ứng thử flavonoid.

Số lượng flavonoid rất lớn, chúng có tính chất rất khác nhau, không có phản ứng chung để phát hiện chúng trong tế bào thực vật. Chỉ có thể tiến hành phân tích vi hoá flavonoid trong một số trường hợp cụ thể.

Xác định hesperidin: Hesperidin thuộc nhóm flavanon có ở nhiều loại cây, trong tế bào sống chất này tồn tại ở dạng hoà tan trong dịch tế bào, khi ngâm dược liệu chứa chất này vào cồn tuyệt đối hesperidin kết tinh trong tế bào dưới dạng hình kim hay khối hình cầu hầu như không hoà tan trong nước, khó tan trong nước nóng, điều này phân biệt các tinh thể hesperidin với inulin. Tinh thể hesperidin không hoà tan trong benzen, cloroform, ete. Hesperidin có thể phát hiện bằng amoniac hoặc kiềm loãng. Trong các dung dịch này chúng dễ tan và nhuộm dung dịch thành màu vàng.

2.11. Phản ứng thử tanin.

Trong thực vật tanin tồn tại dưới dạng hoà tan trong dịch tế bào, một phần bị hấp thu bởi keo tế bào. Trong dược liệu khô tanin tạo thành các hạt vô định hình màu vàng nâu.

2.11.1. Phản ứng xác định tanin bằng muối sắt.

Xác định tanin bằng FeCl3 hoặc phèn sắt amoni FeNH4(SO4)2 dưới dạng dung dịch 1% trong nước. Mô có chứa tanin nhuộm thành màu xanh đen hay xanh lá cây đen với muối sắt. Sắc thái màu không ổn định vì trong tế bào có các acid hữu cơ có thể biến đổi màu xanh lam thành xanh lá. Phản ứng tiến hành trên phiến kính: cho lát cắt vào một giọt thuốc thử, đậy lá kính và quan sát màu tiêu bản dưới kính hiển vi. màu nhanh chóng lan ra (phân tán) toàn bộ lát cắt.

2.11.2. Xác định tanin bằng dung dịch Kalibicromat.

Đây là phản ứng thường dùng để định vị tanin trong mô cây. Dùng dung dịch Kali bicromat trong nước 5-10%. Ngâm dược liệu vào thuốc thử vài ngày sau đó cắt lát. Trong tế bào có chứa tanin tạo thành tủa mịn màu xám và đỏ nâu, màu đỏ nâu được tạo thành khi để lát cắt một thời gian. Sự tạo thành tủa bị ngăn cản bởi các acid hữu cơ có trong cây (acid oxalic, acid citric, acid malic, acid tactric) khi có các acid này chỉ thu được màu vàng nâu đồng nhất.

2.11.3. Xác định tanin bằng dung dịch Amonimolipdat <(NH4)2MoO4> (Phản ứng Gardiner hay Viceling).

Đặt lát cắt vào một giọt dung dịch thuốc thử, đậy lá kính, quan sát dưới kính hiển vi. Dưới tác dụng của thuốc thử trong tế bào có chứa tanin xuất hiện tủa vàng hoặc đỏ. Khi kiềm hoá (thêm NH4OH) thuốc thử thâm nhập vào tế bào nhanh hơn. Phản ứng tương đối nhạy. Nhược điểm của phản ứng là tủa dễ tan trong acid loãng và trong nước, thuốc thử không bền vững khi bảo quản.

về đầu trang

3. Phân tích huỳnh quang

3.1. Khái niệm về huỳnh quang và phân tích huỳnh quang

Một số chất khi dùng các tia sáng có bước sóng ngắn chiếu vào chúng sẽ phát sáng với bước sóng dài hơn, nếu hiện tượng phát sáng đó chấm dứt ngay sau khi nguồn sáng kích ứng thôi tác dụng thì gọi là sự phát huỳnh quang.

Nhiều cây thuốc có chứa hoạt chất có tính chất phát huỳnh quang thuộc các nhóm khác nhau: coumarin, ancaloid, flavonoid v.v... vì vậy phương pháp phân tích huỳnh quang có ý nghĩa rất lớn khi nghiên cứu dược liệu. Người ta sử dụng một số loại đèn phát ra chùm tia có bước sóng ở vùng cực tím và các kính lọc để tạo ra chùm tia kích ứng có bước sóng thích hợp.

ánh sáng huỳnh quang có bước sóng lớn hơn bước sóng của ánh sáng gây nên huỳnh quang (ánh sáng kích ứng). Huỳnh quang được tạo nên bởi tia cực tím ở=365 nm nằm ở phần thấy được của phổ ánh sáng có thể có màu từ tím đến đỏ. Khi kích thích huỳnh quang bằng tia tím xanh ở=400 nm có thể tạo ra huỳnh quang từ xanh lá đến đỏ.

Độ sáng huỳnh quang (cường độ huỳnh quang) phụ thuộc vào nhiều yếu tố:

- Chiều dày của lớp huỳnh quang, khi chiều dày càng lớn thì độ sáng càng lớn, độ sáng huỳnh quang của dung dịch trong ống nghiệm lớn nhất khi quan sát dọc theo trục ống. Độ sáng lớn nhất của tinh thể phát huỳnh quang nhìn thấy được khi quan sát theo chiều dọc từ đầu đến cuối tinh thể.

- Nồng độ của dung dịch huỳnh quang: Khi nồng độ của các chất tạo huỳnh quang nhỏ (10-4-10-5 g/ ml) cường độ huỳnh quang của các dung dịch tăng lên tỷ lệ với sự tăng của nồng độ chất huỳnh quang. Khi nồng độ cao hơn sự tăng huỳnh quang chậm hơn so với tăng nồng độ chất huỳnh quang và tới một mức nào đó cường độ huỳnh quang không tăng mà còn giảm.

Quá trình phát huỳnh quang cũng bị ảnh hưởng (làm yếu đi) bởi sự thay đổi (tăng) nhiệt độ hoặc sự có mặt của các chất lạ. KI là chất có tác dụng làm giảm huỳnh quang điển hình, các muối của halogen khác và một số chất hữu cơ như phenol, hydroquinol, rezocin, anilin, acid picric v.v... cũng có tác dụng làm giảm huỳnh quang. Cường độ và phổ huỳnh quang của các chất biến đổi rõ rệt khi có những biến đổi nhỏ trong cấu trúc phân tử của chúng (phân ly, dime hoá, liên kết với dung môi v.v...) vì vậy cần chú ý tới ảnh hưởng của pH môi trường, bản chất của dung môi v.v...

Các phương pháp, kĩ thuật phân tích dựa trên hiện tượng huỳnh quang, gọi là phân tích huỳnh quang được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như sinh học, y học, nông nghiệp và các ngành kinh tế quốc dân khác.

Trong nghiên cứu dược liệu phân tích huỳnh quang được chia thành hai phần: Phân tích huỳnh quang sơ bộ và phương pháp hiển vi huỳnh quang.

3.2. Dụng cụ để nghiên cứu huỳnh quang.

Để tạo ra nguồn sáng kích ứng người ta thường sử dụng đèn thuỷ ngân cao áp kết hợp với bộ lọc hoặc các đèn có bức xạ với bước sóng xác định. Các đèn này được bố trí trong các hệ thống có cấu tạo phù hợp với mục đích sử dụng. Khi nghiên cứu huỳnh quang sơ bộ nguồn sáng thường đặt trong một buồng, buồng này có thể đưa vào các bản sắc kí, dược liệu bẻ gẫy để quan sát sự phát huỳnh quang của chúng.

Phân tích huỳnh quang trong một số trường hợp có thể sơ bộ đánh giá chất lượng nguyên liệu khi chất có hoạt tính sinh học trong chúng có tính chất phát huỳnh quang (alcaloid, flavonoid, coumarin...). Khi đó sự biến đổi tính chất huỳnh quang của nguyên liệu phản ánh sự biến đổi hàm lượng hay cấu trúc của hoạt chất.

Bên cạnh quan sát huỳnh quang của bản thân nguyên liệu (huỳnh quang sơ cấp) có thể quan sát huỳnh quang được tạo thành khi phản ứng của hoạt chất nguyên liệu với thuốc thử. Ví dụ: Khi quan sát flavonoid thường xử lý bằng hơi amoniac, dung dịch kiềm để tăng huỳnh quang của chúng, trong trường hợp này các thuốc thử không chỉ làm thay đổi cường độ mà cả phổ của huỳnh quang. Khi phân tích huỳnh quang sơ bộ có thể dùng các nguồn sáng kích ứng có bước sóng gần vùng cực tím sẽ thu được huỳnh quang có nhiều màu sắc. nguồn sáng kích ứng có bước sóng trong vùng xanh tím cho huỳnh quang có cường độ lớn song giải phổ hẹp.

Để nghiên cứu sự phát huỳnh quang của các chất ở các mô, tế bào thực vật sử dụng kính hiển vi huỳnh quang.

3.3. Chuẩn bị tiêu bản để nghiên cứu huỳnh quang.

Tiêu bản để quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang có thể làm từ nguyên liệu tươi hoặc khô. Nguyên liệu đã cố định trong hỗn hợp cồn - glycerin hay các chất cố định khác không dùng để làm tiêu bản quan sát huỳnh quang vì các chất huỳnh quang bị rửa trôi. Trường hợp các chất huỳnh quang hoà tan không đáng kể trong chất cố định nhưng chúng bị phân tán làm thay đổi vị trí ở trong mô, dễ dẫn tới các kết luận sai.

Để nghiên cứu dưới kính hiển vi huỳnh quang từ dược liệu người ta làm các lát cắt, một số trường hợp sử dụng bột dươc liệu khô vì trong bột luôn gặp các mẩu mô theo tiết diện ngang hoặc dọc.

Khi làm tiêu bản để nghiên cứu dưới kính hiển vi huỳnh quang cần chú ý rằng phương pháp này có độ nhạy rất cao, nguyên liệu cũng như phiến kính, lá kính cần phải sạch , thuốc thử không bị lẫn tạp, các lát cắt cần phải làm hết sức cẩn thận.

Làm tiêu bản từ cây tươi, cắt tay bằng lưỡi dao cạo, không cần thiết phải mỏng. dùng giấy lọc thấm dịch tế bào từ các lát cắt, mỗi lần trước khi cắt lát mới cần làm sạch dao để các chất trong dịch tế bào hay trong các túi chứa không dính vào dao giây ra các mô và tế bào khác.

Lựa chọn chất lỏng để soi phụ thuộc vào thành phần hoá học của đối tượng. Chất lỏng phải không được hoà tan các chất huỳnh quang. Nếu chất lỏng soi hoà tan chất huỳnh quang thì chất lỏng sẽ phát huỳnh quang ảnh hưởng tới việc quan sát huỳnh quang ở tiêu bản. Sau một thời gian vi phẫu ngâm trong chất lỏng quan sát, một số chất phát huỳnh quang bị phân tán, để khắc phục người ta bỏ lá kính ra, lấy vi phẫu rửa qua nước hoặc nước-glycerin sau đó lại lên kính trong một giọt chất lỏng mới để quan sát. Dung dịch cloralhydrat sử dụng rộng rãi làm dung dịch soi trong kỹ thuật hiển vi không dùng trong các trường hợp này vì nó có tính chất làm tắt huỳnh quang. Để làm dung dịch soi thường sử dụng nước cất, glycerin, dầu vaselin, để làm tiêu bản cố định dùng xiro đường, dung dịch 5% polivinylancol. Cần phải kiểm tra trước để đảm bảo trong dịch soi không có mặt các chất phát huỳnh quang. Các đối tượng phát huỳnh quang sáng rõ nhất trong không khí vì vậy có thể nghiên cứu chúng không dùng dịch soi , để hạn chế quá trình khô của lát cắt dùng parafin lỏng để bọc quanh mép lá kính. Các lát cắt dược liệu khô cho kết quả tốt khi nghiên cứu dưới kính hiển vi huỳnh quang. Dược liệu khô bảo quản tương đối tốt cấu trúc, chỉ có các mô được tạo thành từ các tế bào có thành cellulose rất mỏng là dễ bị biến dạng khi khô vì mất nước. Khi sấy thường không xảy ra sự thay đổi vị trí các chất có hoạt tính sinh học. Trở ngại lớn nhất khi làm lát cắt từ dược liệu khô là độ bền cơ học của chúng, để nghiên cứu dưới kính hiển vi huỳnh quang phải làm các lát cắt dày của vỏ, rễ, rễ củ, thân (dày 2-4 mm) những lát cắt mỏng hơn thường dễ bị vụn và gẫy. Các lát cắt khô tốt nhất làm bằng cách cưa. khi cưa bụi sẽ bám chặt vào bề mặt, bịt các tế bào và các khoang. Cần phải làm sạch bụi bằng dao cạo sao cho mô và tế bào vẫn giữ được hình dạng của chúng. Gắn lát cắt vào phiến kính bằng parafin nung chảy. Quan sát không cần chất lỏng thuận lợi khi sử dụng kính hiển vi huỳnh quang phản xạ. Các lát cắt dày thuận tiện để tiến hành các phản ứng hoá học.

Các lát cắt mỏng hơn từ dược liệu khô có thể thu được sau khi làm mềm nó trong buồng ẩm, song các lát cắt mỏng thường dễ vỡ vì vậy nên quan sát dưới kính hiển vi trong nước, glicerin hay các dung môi thích hợp khác.

Kỹ thuật nghiên cứu các tiêu bản dưới kính hiển vi huỳnh quang về cơ bản không khác với phương pháp nghiên cứu sử dụng kính hiển vi thường. Khi nghiên cứu các chất huỳnh quang tự nhiên cần sử dụng các chất chuẩn, các tiêu bản đối chứng đã được loại rửa chất huỳnh quang bằng các dung môi khác nhau.

(Trích từ sách Kiểm nghiệm dược liệu bằng phương pháp hiển vi)

về đầu trang

- Phương pháp sắc ký lớp mỏng

- Phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao

- Sử dụng sắc ký lớp mỏng trong kiểm nghiệm dược liệu và chế phẩm đông dược

- Cấu tạo cơ bản của một số loại kính hiển vi dùng trong kiểm nghiệm dược liệu

- Sử dụng kính hiển vi phân cực trong kiểm nghiệm một số dược liệu

- Identification of some commercial samples of Linh chi (Ganoderma) in the Vietnam market

- Nghiên cứu đặc điểm thực vật của hai loài Huperzia

-------------------------------------------------------

Mọi thông tin liên quan đến trang web Xin vui lòng liên hệ theo số điện thoại 01234195602 hoặc theo địa chỉ Email: thannv@hup.edu.vn

Revised: August 31, 2017 .