Kinh Nghiệm Lựa Chọn: Sắc Ký Cột – Nhồi Cột - Phần 2

BioMedia

Sắc ký cột là kỹ thuật phổ thông nhất trong các phòng thí nghiệm. Phương pháp này rất đơn giản và có thể phân lập các hợp chất khỏi hỗn hợp một cách nhanh chóng. Tuy nhiên, giống như nhiều kỹ thuật hóa học thực hành khác, để có thể thiết lập và chạy một cột sắc ký nhanh và hiệu quả lại cần đến nhiều năm kinh nghiệm. Bài viết này có đề cập đến một số cách giúp bạn tối ưu hóa các thông số thí nghiệm để bạn có thể phân tách tốt nhất các hợp chất của mình. Một khi bạn đã chọn được hệ dung môi phân tách, tính được lượng silica bạn cần và tìm ra được cột phù hợp (xem trong bài "Kinh nghiệm lựa chọn: Sắc ký cột – Phần 1"), khi đó bước tiếp theo của bạn là nhồi cột.

Trong một cột tiêu biểu (Hình 1), pha tĩnh – chất hấp thụ rắn thường là silica gel (SiO2) hoặc alumina (Al2O3) được nhồi trong cột thủy tinh thẳng đứng. Pha động – dạng lỏng, được rót vào từ trên đỉnh cột và chảy xuống dưới cột nhờ tác dụng của trọng lực hoặc của áp suất bên ngoài (trong sắc ký cột nhanh – flash chromatography). Quá trình phân tách các chất đạt được nhờ khả năng hấp thụ khác nhau và tương tác giữa pha động và pha tĩnh.

Hình 1. Thiết lập cột nói chung

Chất lượng của quá trình phân tách phụ thuộc vào nhiều yếu tố tối thiểu để tránh tạo thành bóng khí trong pha tĩnh. Để tránh tạo thành bóng khí, việc nhồi cột đúng cách là rất quan trọng.

1. Lựa chọn Silica hay Alumina cho Pha tĩnh

Silica và alumina đều là những chất hấp phụ phân cực nên các cấu tử phân cực hơn trong hỗn hợp sẽ bị giữ lại mạnh hơn trong pha tĩnh và do đó sẽ đi ra khỏi cột sau cùng.

Silica có thể dùng cho hầu hết các hợp chất, nhưng lại có tính axit nhẹ, nó thích hợp với các hợp chất có tính bazơ. Alumina có tính kiềm nhé, nên lực liên kết với các hợp chất có tính axit mạnh hơn phù hợp để tách các hợp chất phân cực yếu hoặc trung bình và tinh chế các amin.

Kích thước của hạt hấp phụ bị ảnh hưởng bởi dung môi chảy quả cột. Silica và alumina hiện có rất nhiều loại kích thước.

Kích thước được tính bằng giá trị mesh – là số lỗ lọc tạo thành trong một đơn vị silica, để lựa chọn chất hấp phụ. Vì giá trị mesh càng cao chẳng hạn như “silica gel 230–400” sẽ có nhiều lỗ lọc trên một đơn vị diện tích hơn và đương nhiên kích thước hạt sẽ nhỏ hơn loại "silica gel 60". Thông thường, loại silica gel 70-230 mesh thường dùng trong sắc ký cột thường (tách bằng trọng lực) và silicagel 230-400 mesh dùng trong sắc ký cột nhanh. Alumina có 3 loại I, II và III. Phân loại này dựa trên hàm lượng nước có trong alumnia, loại I có ít nước nhất và loại III là nhiều nhất. Hàm lượng nước ít có nghĩa là có nhiều hạt phân cực trong alumina tự do liên kết với các hợp chất hữu cơ hơn, và các hợp chất phân cực sẽ giữ lại trên cột lâu hơn. Alumina loại II và III, kích thước 150 mesh thường dùng nhiều nhất.

Kỹ thuật nhồi cột mô tả dưới đây sử dụng pha tĩnh là silica, nhưng cũng có thể áp dụng với alumina.

2. Chuẩn bị cột

Một số cột có lớp lọc thủy tinh frit (hình 2, bên trái) để tránh thất thoát pha tĩnh từ đáy cột; loại khác không có và cần phải có lớp đệm bông thủy tinh hoặc bông vải ở dưới đáy cột. Dùng loại nào là tùy bạn. Đặt thêm lớp vải thủy tinh hay lớp bông vải nghe có vẻ lạ nhưng với lỗ lọc thủy tinh frit khó làm sạch hơn và có thể gây nhiễm tạp, chẳng hạn như silica rò rỉ qua lỗ lọc frit vào trong phân đoạn thu hồi. Để tránh hiện tượng này có thể cho thêm một lớp cát ở giữa lỗ lọc frit và silica. Mật độ, kích thước lỗ lọc frit cũng không giống nhau. Nghĩa là tốc độ dòng dung môi ở các cột khác nhau có thể khác nhau. Loại lớp lọc frit lớn sẽ làm rò rỉ nhiều silica hơn, nhưng loại lỗ nhỏ hơn có thể cho tốc độ dòng thấp hơn – đôi khi là rất thấp – và có thể dẫn đên tạo áp lực trong sắc ký cột nhanh.

Hình 2. Cột có lớp lọc frit (trái) và không có lớp lọc frit (phải)

Cột có lớp lọc frit

1. Chọn một cột có kích thước phù hợp, rửa thật sạch, tráng với nước cất và sấy khô.
2. Kẹp cột thẳng đứng lên giá và đóng van ở phía dưới cột lại (trên hình 2).
3. Cho vào một lớp cát mỏng (khoảng 0,5cm, nếu muốn).

Cột không có lớp lọc frit

Miếng đệm bông vải hoặc sợi thủy tinh cần đủ rộng để che được đáy của cột, nhưng không được rộng quá và chặt quá sẽ làm cản trở dòng chảy của dung môi (hình 3). Một mảnh có kích thước bằng ngón tay út là đủ dùng.

1. Vị trí của miếng đệm bông hay sợi thủy tinh phải đảm bảo nằm chắc chắn ở phần hẹp nhất của cột bằng cách dùng đũa thủy tinh hoặc dụng cụ khác nén xuống.
2. Kẹp cột thẳng đứng lên giá và đóng van ở phía dưới cột lại (trên hình 2)
3. Thêm một lớp cát vào cột (khoảng 2cm, Hình 3). Điều này đảm bảo pha tĩnh một lớp nền và ngăn sự tập trung và không liên tục do lớp vải bông khi các chất đi ra ở cuối cột.

Hình 3. Hướng dẫn chọn kích cỡ của miếng đệm bông vải hay sợi thủy tinh và lượng cát phù hợp cho cột không có lớp lọc frit

3. Nhồi cột

Có một số phương pháp nhồi cột. Mỗi phương pháp đều có ưu nhược của nó, bạn nên thử cả 3 cách đề tìm ra phương pháp phù hợp nhất.

Cách 1: Nhồi cột khô kiểu 1

Dụng cụ cần thiết:

Cột đã được chuẩn bị như ở phần 2

Phễu phù hợp dùng cho chất rắn khô

Van để đóng cột

Dung môi

Silica hoặc Alumina

Ưu điểm +	Nhược điểm -
Giảm thiểu quá trình rửa cột	Khó đạt được hiệu quả nhồi cao nhất

Cách làm:

1. Cho dung môi vào cột, cho chạy qua cát và miếng đêm bông vải để loại bọt khí trong đó (Hình 4, bước B)
2. Đặt phễu khô trên đỉnh cột và đổ từ từ silica hoặc alumina (pha tĩnh) vào trong dung môi này. Để dung môi chảy ra từ từ tránh bị tràn (hình 4, bước C)
3. Để pha tĩnh lắng xuống và nhẹ nhàng đóng van cột lại để silica/alumina được nhồi chặt trong cột (Hình 4, bước D)
4. Tháo dung môi đến mức chạm vào bề mặt pha rắn (hình 4, bước E)

Hình 4. Phương pháp nhồi cột khô kiểu 1

Cách 2: Nhồi cột khô kiểu 2

Dụng cụ cần thiết:

Cột đã được chuẩn bị như ở phần 2

Phễu phù hợp dùng cho chất rắn khô

Dây dẫn chân không

Dung môi

Silica hoặc Alumina

Ưu điểm +	Nhược điểm -
Nhồi cột chặt	Cần rất nhiều dung môi

Cách làm:

1. Thêm silica gel khô vào cột và nối chân không bằng cách nối ống chân không vào đầu ra của cột (hình 5, bước B). Chân không sẽ giúp quá trình nén silica gel và giữ nó ổn định cho bước tiếp theo. Quá trình nhồi sẽ tốt hơn khi được vỗ nhẹ lên thành cột (hình 5, bước C)
2. Khi tạo độ chân không rồi, rót từ từ dung môi vào (Hình 5, bước D)
3. Để dung môi chảy qua cột tới khi chảy đến đáy cột. Tại điểm này, đóng van và tắt chân không (Hình 5, bước E)
4. Để dung môi qua cột với lượng khoảng 5 – 6 lần lượng dung môi đầy cột để đảm bảo hoàn thành quá trình nhồi cột
5. Tháo dung môi cho tới khi mức dung môi trong cột chạm vào bề mặt pha tĩnh (hình 5, bước F)

Hình 5. Phương pháp nhồi cột khô kiểu 2

Cách 3: Nhồi cột kiểu ướt (huyền phù)

Dụng cụ cần thiết:

Cột đã được chuẩn bị như ở phần 2

Phễu phù hợp dùng cho chất rắn ướt

2 cốc có mỏ hoặc bình tam giác

Que khuấy thủy tinh

Dung môi

Silica hoặc Alumina

Pipet Pasteur

Ưu điểm +	Nhược điểm -
Nhanh và dễ dàng	Cho hiệu quả rửa tốt nhất

Cách làm:

1. Rót dung môi vào khoảng 1/3 dung tích cột (Hình 6, bước B)
2. Dùng cốc có mỏ, đong lượng silica/alumina vừa đủ
3. Trong bình phản ứng hoặc cốc có mỏ, đong lượng dung môi gấp khoảng 1,5 lần lượng silica
4. Thêm silica vào dung môi, từng ít một, vừa thêm vừa lắc nhẹ, sử dụng pipet Pasteur hoặc đũa thủy tinh để khuấy lên.
5. Rót hoặc dùng pipet để thêm hỗn hợp silica và dung môi vào cột. Để dung môi thoát ra khỏi cột tránh bị tràn (Hình 6, bước C)
6. Gõ nhẹ vào cột để bọt khí thoát ra và silica lắng xuống (Hình 6, bước D)
7. Tiếp tục đổ hỗn hợp vào cột đến khi tất cả lượng silica/alumina hết.
8. Rửa thành cột bằng cách rót dung môi lên thành trong của cột.
9. Mở van tháo dung môi đến khi mức dung môi trong cột chạm đến bề mặt của pha tĩnh (Hình 6, bước E)

Hình 6. Nhồi cột kiểu ướt

Như vậy bạn đã có cột nhồi sẵn sàng cho việc tách hỗn hợp yêu cầu.

4. Làm sạch cột

Sau khi có được sản phẩm tách ra, công việc còn lại là đổ silica ra và làm sạch cột cho lần tách tiếp theo. Để làm nhanh quá rình, việc rửa giải loại bỏ dung môi có thể dùng máy nén khí và cho dòng khí đi qua cột khoảng 2 giờ. Quá trình này sẽ làm khô silica, từ đó đổ ra khỏi cột dễ hơn nhiều.

Sau khi rửa giải tất cả các dung môi và giữ cột thẳng đứng, úp ngược vào trong cốc có mỏ lớn, để khô qua đêm trong tủ hút.

Thường chỉ cần làm sạch cột bằng nước và axeton là đủ.

Lưu ý: Bụi silica rất độc khi hít phải, luôn xử lý silica trong tủ hút và mặc quần áo phù hợp để bảo vệ bản thân. Tránh quá trình làm tăng bụi khi xử lý.

Tác giả: Sarah Millar

Nguồn: Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim /www.chemistryviews.org

Dịch và biên tập BioMedia VN