KỸ THUẬT ARRAY CGH VÀ ỨNG DỤNG TRONG CHẨN ĐOÁN ...

Một trong những giới hạn chính của kỹ thuật này là để chỉ định xét nghiệm bằng kỹ thuật FISH, bác sĩ cần định hướng tới một hội chứng liên quan đến bất thường NST dựa trên biểu hiện lâm

KỸ THUẬT ARRAY CGH* VÀ ỨNG DỤNG TRONG

CHẨN ĐOÁN TRƯỚC SINH

* Array CGH : Microarray-based comparative genomic hybridization

Nguyễn Viết Nhân, Hà Thị Minh Thi, Nguyễn Vũ Quốc Huy

Trường Đại Học Y Dược Huế

Các bất thường không cân bằng của nhiễm sắc thể (NST) được gặp khá phổ biến với tỉ lệ khoảng 2/100 trẻ sinh sống [28] Việc xác định căn nguyên di truyền liên quan đến loại bất thường này cho nhiều trường hợp bệnh lý là rất cần thiết để tư vấn di truyền và can thiệp về mặt y tế nhất là đối với các trường hợp chậm phát triển tâm thần và dị tật bẩm sinh, những bất thường chiếm tỷ lệ cao trong quần thể Để đáp ứng nhu cầu này, các kỹ thuật phát hiện các bất thường NST không ngừng phát triển để có thể phát hiện các bất thường của NST với độ phân giải ngày mỗi cao hơn Bài viết này nhằm điểm lại một số phương pháp phân tích NST truyền thống và giới thiệu về kỹ thuật array CGH, một kỹ thuật mới trong chẩn đoán các bất thường không cân bằng của NST

1 ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH NHIỄM SẮC THỂ KHÔNG SỬ DỤNG

KỸ THUẬT MICROARRAY

1.1 KỸ THUẬT LẬP KARYOTYPE BĂNG G

Để phân tích đặc điểm bộ NST của một cá thể về

cả số lượng lẫn cấu trúc, người ta dựa trên bộ

NST của tế bào ở kỳ giữa (metaphase) hoặc tiền

kỳ giữa (pro-metaphase) của nguyên phân để lập

karyotype Kỹ thuật được sử dụng phổ biến để lập

karyotype là kỹ thuật nhuộm băng G (hình 1) hiện

được sử dụng trong hầu hết các phòng xét nghiệm

di truyền tế bào học và được coi là một trong

những phương pháp phân tích di truyền tế bào

học truyền thống [43] Mặc dù đã có những phần

mềm hỗ trợ cho việc lập karyotype nhưng để có

một karyotype phục vụ tốt cho chẩn đoán và phân

tích các băng trên NST đòi hỏi rất nhiều đến kỹ

năng và kinh nghiệm của người làm tiêu bản và

người đọc kết quả

Với kỹ thuật nhuộm băng G độ phân giải của NST thường nằm trong giới hạn từ

350 - 850 băng trên bộ NST đơn bội với kích thước mỗi băng từ 5-10Mb (Mb: megabase, 1Mb = 1.000.000 bases) ở độ phân giải bình thường và kích thước mỗi băng từ 3 – 5 Mb đối ở độ phân giải cao, do đó kỹ thuật này chỉ cho phép phát hiện các bất thường có kích thước lớn hơn 3 Mb [42] Các trường hợp bất thường NST có kích thước bé hơn kích thước trên sẽ không thể được phát hiện [13] Nhiều trường hợp tái sắp xếp của NST rất

Hình 1: Karyotype của một người

nam bình thường

Hình 2: Ứng dụng kỹ thuật FISH để chẩn đoán

t r ư ớ c

s i n h

b ấ t t h ư ờ n g

N S T ở

t ế Hình 4: Nguyên tắc của kỹ thuật FISH

khó phát hiện hoặc không thể phát hiện được bằng kỹ thuật này do kích thước quá nhỏ, cường độ thuốc nhuộm không đủ và thiếu các mẫu băng ở những đoạn NST đã bị thay đổi Để khắc phục nhược điểm này các phương pháp di truyền tế bào - phân tử (molecular cytogenetic methods) đã được phát triển trong các thập niên 1980 và 1990

1.2 KỸ THUẬT LAI HUỲNH QUANG TẠI CHỖ (FISH: Fluorescence In Situ Hybridization)

Kỹ thuật FISH là một trong những

kỹ thuật di truyền tế bào học - phân tử được sử dụng để xác định một cách hiệu quả số lượng và vị trí của các đoạn ADN đặc hiệu trên NST ở kỳ giữa hoặc trong nhân tế bào ở gian kỳ và cũng được coi như là một phương pháp phân tích di truyền tế bào học truyền thống

Việc thực hiện kỹ thuật FISH trên tế bào ở gian kỳ đã làm cho việc chuẩn bị mẫu xét nghiệm trở nên đơn giản và thời gian thực hiện xét nghiệm nhanh chóng hơn rất nhiều so với việc lập karyotype, điều này đặc biệt có ý nghĩa đối với các xét nghiệm cần có kết quả nhanh như trong trường hợp phát hiện các bất thường số lượng của NST 13, 18, 21 và X, Y trong chẩn đoán trước sinh (hình 2)[52] Các ứng dụng

của FISH khá rộng bao gồm việc phát hiện

các trường hợp lệch bội trong chẩn đoán

trước sinh, trong một số các trường hợp u ác

tính, trong bệnh ung thư máu, ung thư hạch

bạch huyết (lymphoma), đánh giá các trường

hợp vi mất đoạn (microdeletion) trong các

hội chứng gen kề (contiguous gene

syndromes) và sự tái sắp xếp ở các vùng như vùng cận đầu tận cùng (subtelomere) của NST (hình 3)

Kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ có thể thực hiện trên các đầu tận cùng hoặc vùng cận đầu tận cùng của NST (subtelomeric FISH) hoặc trên các mục tiêu đã được xác định trước trên NST (targeted FISH) thông qua các đoạn dò ADN đặc hiệu cho các lôcút hoặc một trình

tự nucleotit nhất định trên NST Những đoạn dò ADN này được thiết kế và đánh dấu bằng các loại thuốc nhuộm huỳnh quang, trên tiêu bản đánh giá đoạn dò sẽ lai với đoạn ADN tương ứng trong genome

Hình 3 : Phân bố các vùng trên

nhiễm sắc thể

theo nguyên tắc bổ sung và phát tín hiệu màu huỳnh quang, các tín hiệu này sẽ được phân tích dưới kính hiển vi huỳnh quang (hình 4) để

đánh giá các bất thường đặc hiệu của NST

Bên cạnh các đoạn dò đặc hiệu cho từng

locus trên NST, các loại đoạn dò cho phép

nhuộm huỳnh quang nguyên một NST cũng

được phát triển để đánh giá toàn bộ bộ NST

(kỹ thuật SKY: spectral karyotype) (hình 5)

[49]

Kỹ thuật FISH cho phép phát hiện các

bất thường NST có kích thước bé hơn 1Mb,

tùy thuộc vào kích thước của các đoạn dò được

sử dụng Các đoạn dò này chủ yếu là ADN lấy

từ các nhiễm sắc thể vi khuẩn nhân tạo (BAC:

bacterial artificial chromosome) có kích thước khoảng từ 150 – 350 Kb (1Kb = 1000 bazơ)

Mặc dù là một công cụ chẩn đoán khá hiệu quả nhưng FISH cũng có những giới hạn nhất định Một trong những giới hạn chính của kỹ thuật này là để chỉ định xét nghiệm bằng kỹ thuật FISH, bác sĩ cần định hướng tới một hội chứng liên quan đến bất thường NST dựa trên biểu hiện lâm sàng điển hình của bệnh nhân hoặc trong trường hợp karyotype cho thấy có các bất thường đòi hỏi phải có thêm các phân tích sâu hơn về NST

để trên cơ sở đó quyết định lựa chọn đoạn dò thích hợp Các đoạn dò trong FISH cho phép phát hiện tình trạng thừa, mất hoặc tái sắp xếp của các đoạn ADN đặc hiệu nhưng không thể cung cấp thông tin về phần còn lại của genome do đó ngoài các đoạn dò đã được định sẵn FISH không thể phát hiện thêm những bất thường khác trong genome Một hạn chế khác nữa của FISH do hạn chế về loại màu huỳnh quang hiện có để đánh dấu các đoạn dò dẫn đến sự giới hạn trong số lượng các đoạn dò khác nhau có thể được

sử dụng đồng thời trên cùng một mẫu đánh giá [19],[3]

1.3 KỸ THUẬT ĐỊNH LƯỢNG HUỲNH QUANG PCR (QF-PCR: Quantitative Fluorescence PCR)

Kỹ thuật QF-PCR sử dụng các cặp mồi được thiết kế để khuếch đại các trình tự lặp nối tiếp ngắn (STR: short tandem repeat sequences) của các NST đặc hiệu và của các vùng có tính đa hình cao Bằng cách kết hợp màu huỳnh quang trong quá trình khuếch đại nên kỹ thuật này cho phép định lượng các sản phẩm cho mỗi STR đặc hiệu của từng NST Dựa trên nguyên tắc này QF-PCR có thể phát hiện các dạng lệch bội phổ biến và các bất thường số lượng NST giới tính một cách nhanh chóng thông qua chỉ một phản ứng (hình 6) [21] Đã có nhiều nghiên cứu cho thấy đây là một kỹ thuật chẩn đoán có độ tin cậy cao [29]; [32] Một điểm thuận lợi nữa của kỹ thuật QF-PCR là không đòi hỏi phải thực hiện việc nuôi cấy tế bào và tự động hóa do đó cho phép trả kết quả chẩn đoán trước sinh chỉ trong vòng từ 24 đến 48 giờ Tuy nhiên hạn chế lớn nhất của kỹ thuật này

Hình 5: Lập karyotype với kỹ thuật SKY

so với kỹ thuật lập karyotype truyền thống là QF-PCR không cho phép đánh giá toàn bộ genome và do đó không thể phát hiện hết được tất cả các bất thường của các NST trong

bộ NST như khi đánh giá bằng phân tích karyotype [15] Chính vì lí do này mà kỹ thuật QF-PCR thường được sử dụng phối hợp mà không thể thay thế cho kỹ thuật lập karyotype truyền thống

Hình 6: sử dụng kỹ thuật QF- PCR trong chẩn đoán trường hợp lệch bội, trên hình là

trường hợp trisomy 21 được chẩn đoán bằng QF-PCR

2 0KỸ THUẬT ARRAY CGH

Trong thập niên 1990 kỹ thuật CGH (Comparative Genomic Hybridization) bắt đầu được phát triển Về bản chất kỹ thuật này cũng tương tự kỹ thuật FISH nhưng cho phép đánh giá trên toàn bộ genome tình trạng mất cân bằng của bộ NST CGH cũng vấp phải giới hạn về độ phân giải, kỹ thuật CGH trong giai đoạn này chỉ cho phép phát hiện các bất thường có kích thước trong giới hạn 10 – 20 Mb [14] và trong một số nghiên cứu kích thước nằm trong giới hạn 5 – 10Mb [12] Vào cuối thập niên 1990 kỹ thuật array CGH (Comparative Genomic Hybridization microarray) ra đời cho phép giải quyết những vấn đề tồn đọng của kỹ thuật CGH và khắc phục những nhược điểm của kỹ thuật lập karyotype và kỹ thuật FISH Với array CGH những bất thường trên NST xảy ra ở dưới mức phát hiện của kính hiển vi (submicroscopic) dưới dạng vi mất đoạn

(microdeletion) hoặc vi nhân đoạn (microduplication) có thể được phát hiện một cách dễ dàng

2.1 NGUYÊN TẮC

Kỹ thuật array CGH thực hiện việc so sánh mẫu

ADN cần phân tích với mẫu ADN chứng và thông qua

sự khác biệt giữa 2 ADN này để phát hiện các trường

hợp mất đoạn hoặc nhân đoạn nếu có trên ADN

Nguyên lý của kỹ thuật array CGH được dựa trên khả

năng bắt cặp (base pair) hoặc còn được gọi một cách

khác là lai (hybridise) giữa một mạch đơn của ADN

này và một mạch đơn của ADN khác theo nguyên tắc

bổ sung giữa các bazờ ađênin (A) và Tymin (T),

Guanin (G) và Cytôzin (C) của các nuclêotit (hình 6)

Trong kỹ thuật array CGH, hàng ngàn đoạn ngắn

ADN (gọi là các đoạn dò) được sắp xếp một cách

chính xác tại những vị trí nhất định trên lam kính

thành một hệ thống lưới được gọi là con chip (hình 8) Đầu tiên mẫu ADN cần phân tích

sẽ được cắt thành những đoạn ngắn, những đoạn ADN này được nhuộm màu huỳnh quang, mẫu ADN chứng không mang bất thường về mặt di truyền sẽ được nhuộm bằng một màu huỳnh quang khác, hai loại màu huỳnh quang được sử dụng phổ biến là màu đỏ

và xanh lục Sau đó hai mẫu ADN này sẽ được trộn lẫn với nhau và cho lên con chip để tiến hành quá trình lai Các đoạn ADN này sẽ lai với các đoạn dò tương ứng trên con chip

Sau khi hoàn tất quá trình lai con chip sẽ được đọc trên máy quét microarray (microarray scanner) để

đo lượng huỳnh quang màu đỏ và xanh lục ứng với mỗi vị trí trên con chip (hình 9) [33]; [46]; [47] và phân tích bằng phần mềm chuyên dụng trên máy tính để tính tỷ số giữa màu huỳnh quang đỏ và xanh lục tại mỗi vị trí ứng với một đoạn

dò đặc hiệu trên chip để xác định tình trạng thừa, thiếu hoăc cân bằng vật liệu di truyền giữa mẫu ADN cần phân tích và ADN chứng tại vị trí đó (hình 10)[4]; [11]

Nếu mẫu ADN cần phân tích có lượng bình thường sẽ thể hiện trên chip bằng màu vàng do có sự cân bằng giữa lượng ADN cần phân tích và mẫu ADN chứng, nếu bị thừa ADN (nhân đoạn) sẽ thể hiện bằng màu đỏ do có lượng ADN cần phân tích nhiều hơn so

Hình 8: Chip sử dụng trong kỹ thuật microarray với

kích thước ≤ 50kb

Hình 7: Sự bắt cặp giữa 2 mạch của ADN theo nguyên tắc bổ sung

với mẫu ADN chứng và nếu bị thiếu ADN (mất đoạn) sẽ thể hiện bằng màu xanh lá cây

do có lượng ADN cần phân tích ít hơn so với mẫu ADN chứng

Hình 9: Sơ đồ minh họa các bước cơ bản trong kỹ thuật array CGH, hình cuối cùng

cho thấy bệnh nhân bị nhân đoạn

Để đánh giá trình trạng bình thường, thừa hoặc mất đoạn của ADN cần phân tích so với ADN chứng ứng tại mỗi vị trí của đoạn dò, log2 tỷ số của cường độ bắt màu huỳnh quang giữa mẫu bệnh / mẫu đối chứng được sử dụng để tính toán [24]:

 Log2 giữ vai trò trung tâm, với giá trị bằng 0

 Trường hợp mất đoạn bán hợp tử (hemizygote deletion) của mẫu bệnh:

log2 (bệnh/chứng) = log2 (1/2) = -1

 Trường hợp nhân đoạn (duplication) của mẫu bệnh:

log2 (bệnh/chứng) = log2 (3/2) = 0,59

 Trường hợp nhân đoạn đồng hợp tử (homozygous duplication):

log2 (bệnh/chứng) = log2 (4/2) = 1

Hình 10: Một mất đoạn nhỏ trên NST số 6 được chẩn đoán bằng xét nghiệm array CGH Mỗi chấm đen đại diện cho một đoạn dò oligo (oligo probe), có tất cả 10 đoạn dò trong vùng bị mất

đoạn (có màu lam và được phóng đại phía bên phải hình vẽ)

2.2 CÁC LOẠI ARRAY CGH

Có hai loại đoạn dò được sử dụng phổ biến trong kỹ thuật array CGH để phát hiện các bất thường của NST (hình 11) :

 Đoạn dò là các dòng nhiễm sắc thể vi khuẩn nhân tạo (BAC: bacterial artificial chromosome) [47] chứa các đoạn ngắn ADN của người với kích thước thay đổi từ 75 đến 150 Kb [56] được sử dụng để phát hiện các thay đổi đơn bản (single copy) trong genome với độ nhạy cao Nhược điểm của BACs là không cho phép đánh giá những bất thường có kích thước bé hơn kích thước của các đoạn dò [53];[56] Một nhược điểm khác của BACs là việc tạo ra các dòng BAC phục vụ cho kỹ thuật array CGH khá tốn kém và tiêu tốn nhiều thời gian

 Các đoạn dò oligonucleotit gọi tắt là oligo là các đoạn ADN ngắn nhân tạo có kích thước từ 25 đến 85 bazơ (mer) Các oligonucleotit được thiết kế và tổng hợp khá dễ dàng, tùy theo mức độ thiết kế mà các đoạn dò oligonucleotit cho phép đánh giá toàn bộ genome với độ phân giải rất cao [56] nhờ đó array CGH

có thể phát hiện các trường hợp thừa hoặc mất các đoạn rất ngắn trong genome

Tuy nhiên một vấn đề đặt ra là những thay đổi nhỏ trên genome được phát hiện qua kỹ thuật microarrray có thể không gây ra những hậu quả về mặt lâm sàng

do đó cần có thêm các nghiên cứu để làm rõ mối liên hệ này [56]; [43]

Đã có nhiều nghiên cứu so sánh tính hiệu quả của BACs và các oligonucleotit trong việc phát hiện các bất thường trên genome, kết quả cho thấy các oligonucleotit cho phép phát hiện nhiều bất thường hơn và các bất thường có kích thước nhỏ hơn so với BACs [53] Tuy nhiên hiện nay cả hai kỹ thuật array CGH dựa trên BACs và oligonucleotit đều được sử dụng phục vụ cho công tác chẩn đoán

Hình 11: Hai loại đoạn dò được dùng phổ biến trong kỹ thuật array CGH

Về mặt thực hành array CGH được chia làm hai loại:

 Array có mục tiêu (targeted array): gồm ít đoạn dò, phủ tối đa những vùng đã được biết có các gen gây bệnh

 Array toàn bộ genome (whole genome array): gồm các đoạn dò phủ toàn bộ genome

2.3 MÔ TẢ KẾT QUẢ

Kết quả trong kỹ thuật array CGH tùy thuộc vào từng trường hợp cụ thể và khả năng của mỗi phòng xét nghiệm trong việc sử dụng các đoạn dò, máy quét microarray Ví

dụ dưới đây minh họa kết quả của một trường hợp phân tích bằng kỹ thuật arrayCGH:

 Nếu được phân tích bằng các đoạn dò BAC, kết quả sẽ được trình bày như sau:

arr cgh 2p15p16.1(RP11-479F13RP11-260K8)x1

 arr cgh: Kết quả được phân tích bằng kỹ thuật array CGH

 2: Mất đoạn được thấy trên NST số 2

 p15p16.1: NSt có một vị trí đứt gãy ở băng 2p15 (băng 5 của vùng 1 trên

nhánh ngắn của NST số 2) và một vị trí đứt gãy ở vị trí băng 2p16.1 (vùng dưới băng 1, băng 6 của vùng 1 trên nhánh ngắn của NST số 2) và mất đoạn NST giữa 2 vị trí này

 (RP11-479F13 RP11-260K8)x1

Vùng NST chỉ có mặt trên một bản sao thay vì phải có 2 Vùng bị mất nằm trong đoạn ADN được đánh dấu từ RP11-479F13 đến RP11-260K8

 Nếu được phân tích bằng các đoạn dò oligo, kết quả sẽ được trình bày như sau:

arr cgh 16p11.2(29581455-30106101) x 1

 arr cgh: Kết quả được phân tích bằng kỹ thuật array CGH

 16p11.2: Mất đoạn được thấy trên băng 11.2 (vùng dưới băng 2, băng 1 của

vùng 1) trên nhánh ngắn của NST số 16

 (29581455-30106101) x 1

Cặp bazơ đầu tiên bị mất (hình 12) ở số 29.581.455 tính từ phía trái của NST Cặp bazơ cuối cùng của đoạn mất là 30.106.101

Hình 12: Nhiễm sắc thể 16 bị mất đoạn từ cặp bazơ số 29.581.455 tính từ phía trái của

NST đến bazơ số 30.106.101 (vùng màu đỏ) 2.4 ƯU ĐIỂM VÀ HẠN CHẾ CỦA KỸ THUẬT ARRAY CGH

2.4.1 Ưu điểm

Ưu điểm nổi bật của kỹ thuật array CGH là khả năng đánh giá trên toàn bộ 46 NST chỉ trong một xét nghiệm duy nhất và phát hiện các bất thường mất cân bằng của NST bao gồm các trường hợp lệch bội, mất hoặc nhân đoạn của NST chính xác hơn nhiều so với phương pháp lập karyotype Kỹ thuật array CGH cho phép phát hiện các bất thường của NST ngay cả khi không có định hướng trong chẩn đoán, đây là một ưu thế của array CGH so với kỹ thuật FISH Array CGH cũng phát hiện được các trường hợp khảm (mosaic) tuy nhiên sự chính xác trong chẩn đoán còn phụ thuộc vào tỷ lệ giữa dòng tế bào bình thường và tế bào đột biến [21];[55] Trong trường hợp khảm với dòng tế bào đột

biến dạng lệch bội, array CGH cho phép phát hiện được ở mức khảm từ 10% trở lên trong khi đó tình trạng khảm với dòng tế bào đột biến mang nhân đoạn hoặc mất đoạn của một NST được phát hiện ở mức khảm từ 20 – 30% [50] trở lên Hiện nay có thể nói array CGH là kỹ thuật hiệu quả nhất cho phép phân tích một cách toàn diện bộ NST, cho phép xác định một cách chính xác các bất thường không cân bằng của NST, phát hiện các gen liên quan đến những bệnh cảnh điển hình giúp cho việc đánh giá, theo dõi và điều trị hiệu quả hơn

Array CGH cho phép phát hiện các NST đánh dấu (marker chromosome), loại NST không thể phát hiện trong kỹ thuật lập karyotype do kích thước của chúng quá nhỏ không

đủ để cung cấp các mẫu băng đặc hiệu và không thể quan sát được dưới kính hiển vi Đây

có thể coi như là loại NST thứ 47 trong bộ NST vốn dĩ chỉ có 46 NST, hiện tượng này

được gặp không phổ biến ở một số cá thể và được gọi là nhiễm sắc thể đánh dấu nhỏ bổ

sung (sSMC: small supernumerary marker chromosome), chúng có thể có xuất xứ từ một

trong số 24 NST khác nhau của NST người Khoảng 70% trường hợp sSMC là đột biến mới, 30% được di truyền trong gia đình [17] và có khoảng 30% người mang sSMC có biểu hiện bất thường trên lâm sàng [18]

Một ưu điểm khác của array CGH là có thể thực hiện trên các mẫu tế bào không cần qua nuôi cấy để gia tăng số lượng tế bào và hoàn toàn tự động hóa nhờ đó giảm thiểu được thời gian xét nghiệm và tăng mức độ chính xác của chẩn đoán, điều này đặc biệt có

ý nghĩa rất lớn trong các xét nghiệm trước sinh [26]

Các bất thường NST có thể được xác định bằng kỹ thuật array CGH:

 Các b ất thường NST ở mức hiển vi:

 Lệch bội và các trường hợp khảm

 Các loại chuyển đoạn không cân bằng

 Các nhiễm sắc thể đánh dấu (marker chromosomes)

 Các b ất thường NST ở mức dưới hiển vi:

 Các hội chứng liên quan đến vi mất đoạn; vi nhân đoạn của NST

 Các trường hợp tái sắp xếp không cân bằng của vùng cận đầu tận cùng của NST

2.4.2 Hạn chế

Xuất phát từ nguyên tắc của kỹ thuật, hạn chế của kỹ thuật array CGH là không thể phát hiện các trường hợp bất thường trong cấu trúc NST ở dạng cân bằng như chuyển đoạn cân bằng và đảo đoạn (hình 13) do không xảy ra tình trạng thừa hoặc thiếu vật liệu

di truyền Array CGH không phân biệt được các trường hợp thể ba nhiễm (trisomy) với các trường hợp chuyển đoạn Robertson không cân bằng [34]; [21];[55]

Một số trường hợp lệch bội cũng có thể không được phát hiện như trường hợp XYY nếu mẫu ADN chứng bị chọn sai giới tính [21] Array CGH cũng không thể phát hiện được các trường hợp khảm có tỷ lệ khảm thấp hơn 10% đối với trường hợp lệch bội và