Kỹ Thuật Chuyển Gen ở Thực Vật

Có thể bạn quan tâm

Trang Chủ
Nghiên Cứu
Sản Phẩm
YHCT
Mở Rộng

Y Học Cổ Truyền
Giới thiệu
Tin Nổi Bật
Sức Khỏe
Labo Nghiên Cứu
Ảnh
Video
Ứng Dụng Công Nghệ Sinh Học
Nguyên Lý Cơ Bản Công Nghệ Sinh Học

Trang chủ
Sức Khỏe
Labo Nghiên Cứu
Y Học Cổ Truyền
Sản phẩm
Ảnh
Video
Liên hệ

Trang chủ » Labo Nghiên Cứu ĐTHT DAIBIO Ở VIỆT NAMDAIBIO báo cáo Y Học ở UBND TP Hà Nội

Phòng Khám Y Khoa DAIBIO

Mười hai kinh chính
Thực hành trị liệu châm cứu
Kê Đơn, Bốc Thuốc
Xoa Bóp, Bấm Huyệt
Thế Mạnh
- Bệnh Da Liễu
- Cai Nghiện
- Bệnh hệ hô hấp
- Bệnh da liễu
- Bệnh truyền nhiễm
- Bệnh tai mũi họng
- Bệnh về phụ khoa
- Bệnh nam khoa
- Bệnh hệ tuần hoàn
- Bệnh hệ tiết niệu
- Bệnh hệ tiêu hóa
- Bệnh hệ thần kinh
- Bệnh Cơ Xương Khớp
Đội Ngũ Nhà Khoa Học, Bác Sỹ
Truyền Thống Y Học Đại Gia Đình DAIBIO
- Nhà Văn Hóa Bác Sỹ Nguyễn Khắc Viện
- Giáo Sư Bác Sỹ Lê Kinh Duệ
- Hoàng Giáp Thượng Thư Nguyễn Khắc Niêm

Y Học Cổ Truyền

Cây thuốc Việt
Dược Học Cổ Truyền
- Bào Chế
- Nhóm Thuốc
Lý Luận Y Học Cổ Truyền
- Chuẩn Đoán Bệnh
- Âm Dương
- Ngũ Hành
- Tướng Số Bát Quái
- Lục Phủ Ngũ Tạng
Lịch Sử Y Học Cổ Truyền
- Học thuyết Kinh Lạc
- Đông Y Kinh Điển

Kỹ thuật chuyển gen ở thực vật Thông tin di truyền desoxyribonucleic acid (DNA) tồn tại ở ba dạng chính: - DNA của cơ thể bậc cao (DNA nhân và DNA cơ quan tử) - DNA của vi sinh vật - DNA của plasmid Biến nạp thông tin di truyền là kỹ thuật sử dụng DNA tinh khiết để đưa vào cơ thể hay tế bào khác và theo dõi biểu hiện của thông tin di truyền mới này. Để biến nạp hiệu quả nguyên liệu di truyền vào tế bào vật chủ, các cấu trúc di truyền cần được thiết kế thích hợp cho sự hợp nhất và biểu hiện của các gen ngoại lai. Cấu trúc di truyền phải mang một gen chỉ thị chọn lọc (selectable marker gene: gen mã hóa một protein khử độc của hóa chất bổ sung trong môi trường nuôi cấy, cho phép sinh trưởng ưu tiên của các tế bào có DNA ngoại lai được hợp nhất) hoặc sàng lọc (screenable marker gene: gen mã hóa một protein cho kết quả trong sản phẩm sống sót nhờ đó có thể xác định tế bào biến nạp thể hiện gen) để nhận biết hiệu quả biến nạp gen. Một cấu trúc di truyền đặc trưng bao gồm: gen khởi động (promoter), gen mã hóa (coding gene) và gen kết thúc (terminator). Các gen mã hóa có thể được đưa vào mô thực vật nhờ vào các plasmid vector. Hai promoter chủ yếu thường được sử dụng cho biến nạp gen ở thực vật là: promoter CaMV 35S (cauliflower mosaic virus) thích hợp cho sự biểu hiện của DNA ngoại lai ở cây hai lá mầm và promoter ubiquitin của ngô thích hợp cho sự biểu hiện mạnh của DNA ngoại lai ở cây một lá mầm. Các mẫu vật (các bộ phận của cây hoặc mô dùng để biến nạp) thích hợp nhất cho biến nạp gen là những mẫu vật đòi hỏi thời gian nuôi cấy trước và sau khi biến nạp ngắn nhất. Nhiều nghiên cứu cho thấy thời gian kéo dài của mô nuôi cấy thường tạo ra các đột biến di truyền làm mất khả năng tái sinh của các cây được biến nạp gen. Các mẫu vật được sử dụng trong chuyển gen thường là: protoplast, phôi non hoặc callus có nguồn gốc từ hạt (lúa mì), các mô nuôi cấy phát sinh cụm chồi, và trụ phôi (có nguồn gốc từ các hạt non hoặc hạt già) dùng để biến nạp trực tiếp DNA ngoại lai vào mô phân sinh ở cây hai lá mầm (legumes, bông...). Trong một số trường hợp, biến nạp thông qua nuôi cấy phát sinh phôi (embryogenic culture) cũng có thể thực hiện được, chẳng hạn ở các loài tùng bách, các loài cây ăn quả và một số loài khác. Các phương pháp chuyển gen có thể bị hoặc không bị giới hạn bởi các genotype khác nhau của thực vật. Tùy thuộc vào mục đích ứng dụng, có thể thiết kế một phương thức biến nạp thích hợp cho từng genotype khác nhau. Trong những nghiên cứu cơ bản, người ta thường tập trung tìm hiểu về cấu trúc và chức năng của các gen biến nạp, khảo sát các promoter và các cơ chế phân tử ở thực vật để có thể chuyển gen thành công vào các loài khác nhau. Công nghệ chuyển gen thực hiện việc chuyển các gen ngoại lai vào tế bào và mô thực vật. Có nhiều phương pháp chuyển gen khác nhau ở thực vật, nhưng ở đây chỉ trình bày một số phương pháp chủ yếu: 1. Biến nạp gián tiếp thông qua Agrobacterium 1.1. Vi khuẩn Agrobacterium Agrobacterium tumefaciens và Agrobacterium rhizogenes là hai loài vi khuẩn gây bệnh cho thực vật được sử dụng như các vector tự nhiên để mang các gen ngoại lai vào mô và tế bào thực vật. A. tumefaciens có chứa một plasmid lớn kích thước khoảng 200 kb gọi là Ti-plasmid (tumor inducing plasmid) chính là tác nhân truyền bệnh cho cây. Khi cây bị nhiễm A. tumefaciens qua các vết thương, biểu hiện bệnh rõ nhất là các khối u được hình thành ở ngay chỗ lây nhiễm. Sự hình thành khối u sau đó có thể tiếp tục mà không cần thiết phải có sự hiện diện của vi khuẩn. Khả năng này có được do A. tumefaciens đã chuyển một đoạn DNA của Ti-plasmid (T-DNA) xâm nhập vào hệ gen của cây bị bệnh. 1.2. Plasmid Trong thế giới động-thực vật đều tồn tại các thể plasmid, đó là các vòng DNA tự sinh sản độc lập. Ở vi khuẩn và động-thực vật, plasmid liên quan tới yếu tố giới tính của tế bào, đến khả năng chống chịu các loại kháng sinh... Đặc điểm quan trọng của plasmid là chúng có thể liên kết vào nhiễm sắc thể nhưng cũng có thể tồn tại bên ngoài nhiễm sắc thể một cách độc lập. Các plasmid của Agrobacterium được sử dụng vào công nghệ gen thực vật ở hai dạng vector cis và trans. Đây là hai dạng vector rất thuận lợi để tái tổ hợp gen ngoại lai và chuyển vào tế bào thực vật. Dạng cis chỉ sử dụng Ti-plasmid và tế bào vật chủ là Agrobacterium tumefaciens mà không có sự tham gia của plasmid và vi khuẩn khác. Vùng T-DNA của Ti-plasmid được thiết kế lại để gắn những gen ngoại lai mong muốn, các phần còn lại của Ti-plasmid vẫn được giữ nguyên. Agrobacterium tumefaciens được dùng làm tế bào vật chủ để nhân lên nhiều bản sao của Ti-plasmid và chuyển gen. Dạng trans hay binary là dạng sử dụng hai hay nhiều loại plasmid và vi khuẩn cùng lúc, ví dụ: vi khuẩn E. coli và Agrobacterium, plasmid trong trường hợp này thích ứng với cả E. coli và Agrobacterium. Trước tiên, plasmid của E. coli chứa đoạn T-DNA được giới hạn bởi bờ phải (right border-RB) và bờ trái (left border-LB) mang gen ngoại lai được thiết kế và nhân lên trong vi khuẩn E. coli. Tiếp đến plasmid mang gen ngoại lai được chuyển nạp vào vi khuẩn Agrobacterium nhờ một helper plasmid (quá trình triparental matting). Vi khuẩn Agrobacterium đã mang sẵn một loại plasmid khác chứa vùng vir (virulence region) có chức năng quan trọng trong quá trình chuyển gen ngoại lai. Sự tồn tại song song hai plasmid này đã tương tác lẫn nhau trong việc chuyển gen vào tế bào thực vật. Như vậy, gen ngoại lai và vùng DNA giúp quá trình chuyển gen (vùng vir) không nằm trên cùng một plasmid nên hệ chuyển gen này được gọi là hệ trans. 1.3. Vùng T-DNA Vùng T-DNA được nghiên cứu rất kỹ. Đó là một đoạn DNA có kích thước 25 kb trong đó chứa gen mã hóa cho sinh tổng hợp auxin, cytokinin, opine và các gen gây khối u (oncogenes). Trong Ti-plasmid, vị trí của T-DNA được giới hạn bằng RB và LB. Ngoài T-DNA, trên Ti-plasmid còn có các vùng DNA mã hóa cho việc tái sinh plasmid (replication), cho khả năng lây nhiễm và tiếp hợp (vùng vir), cho việc tiêu hóa opine (opine catabolism) (Hình 4.5). Trong các vùng DNA của Ti-plasmid, ngoài T-DNA, được nghiên cứu nhiều hơn cả là vùng DNA phụ trách khả năng lây nhiễm còn gọi là vùng vir. Sản phẩm hoạt động của các gen nằm trong vùng vir dưới tác động kích thích của các hợp chất phenol tiết ra từ vết thương là một loạt các protein đặc hiệu như virE2, virB, virD, virD2, virC1... Các protein này nhận biết các vết thương ở các cây chủ thích hợp (hầu hết là cây hai lá mầm), kích thích sản sinh ra các đoạn T-DNA, bao bọc che chở các đoạn DNA này và giúp chúng tiếp cận với hệ gen của cây chủ một cách an toàn. Khi cây nhiễm A. tumefaciens, do T-DNA nạp vào trong hệ gen của cây chủ bắt đầu hoạt động và sản sinh ra auxin, cytokinin và opine, toàn bộ sinh trưởng của cây bị rối loạn, các tế bào phân chia vô tổ chức và tạo ra các khối u. Opine được vi khuẩn sử dụng như một loại “thức ăn”. Nhờ gen chuyển hóa opine trên Ti-plasmid. Cơ chế lây nhiễm của A. rhizogenes đối với cây hai lá mầm cũng tương tự, nhưng trong vùng T-DNA của A. rhizogenes chỉ có gen sản sinh ra auxin, vì thế sự thay đổi hình thái chính của thực vật là chúng tạo ra rất nhiều rễ tơ (hairy roots) khi bị nhiễm bệnh. Trên thực tế bệnh cây, Agrobacterium chỉ gây hại ở cây hai lá mầm, vì vậy người ta cho rằng chúng chỉ có thể đưa T-DNA vào hệ gen các cây hai lá mầm. Gần đây, nhiều tác giả đã chứng minh khi nhiễm vi khuẩn, các cây một lá mầm cũng có thể sản xuất opine và có thể khai thác khả năng biến nạp gen của Agrobacterium vào cây một lá mầm. 1.4. Chuyển DNA ngoại lai vào tế bào và mô thực vật nhờ Agrobacterium tumefaciens Cơ chế gây bệnh của các Agrobacterium là sau khi xâm nhiễm vào tế bào, chúng gắn đoạn T-DNA vào bộ máy di truyền của tế bào thực vật, dẫn đến sự rối loạn các chất sinh trưởng nội sinh, tạo ra khối u (trường hợp A. tumefaciens) hoặc rễ tơ (trường hợp A. rhizogenes). Khả năng chuyển gen này đã được khai thác để chuyển gen ngoại lai vào bộ máy di truyền của tế bào thực vật theo ý muốn. Để gắn T-DNA vào tế bào thực vật, đầu tiên vi khuẩn A. tumefaciens phải tiếp xúc với thành tế bào thực vật bị tổn thương. Quá trình này được thực hiện nhờ các gen chvA và chvB. Gen chvB mã hoá một protein liên quan đến hình thành β-1,2 glucan mạch vòng, trong khi đó gen chvA xác định một protein vận chuyển, định vị ở màng trong của tế bào vi khuẩn. Protein vận chuyển giúp vận chuyển β-1,2 glucan vào khoảng giữa thành tế bào và màng sinh chất. β-1,2 glucan giữ vai trò quan trọng để vi khuẩn Agrobacterium tiếp xúc với thành tế bào thực vật. Nếu không có sự tiếp xúc này, sẽ không có sự dẫn truyền T-DNA. Các sản phẩm protein của vùng vir có tác dụng cho việc dẫn truyền T-DNA từ vi khuẩn vào tế bào thực vật. Các loại protein đó rất cần thiết cho quá trình cắt T-DNA khỏi Ti-plasmid, cảm ứng thay đổi màng tế bào thực vật mà chúng tiếp xúc, tham gia di chuyển phần T-DNA qua màng vi khuẩn tới tế bào chất của tế bào thực vật, vận chuyển tới nhân rồi cuối cùng xâm nhập vào genome của cây chủ. Thực chất chỉ riêng T-DNA của Ti-plasmid được chuyển vào genome tế bào thực vật, mà không còn phần nào khác. Quá trình dẫn truyền chỉ do sản phẩm của các gen vir (vùng vir) và gen chv quyết định mà không liên quan đến các gen khác trên T-DNA. Tuy nhiên, chuỗi DNA 25 bp (RB và LB của T-DNA) có vai trò là vị trí cảm ứng cho các sản phẩm của tổ hợp các gen vùng vir, đặc biệt là protein từ gen virE mang chúng dẫn truyền vào tế bào thực vật. Chúng hoạt động như các tín hiệu nhận biết và khởi động quá trình dẫn truyền. Trước hết gen virA trong tổ hợp gen vùng vir được phosphoryl hoá nhờ tác động của các hợp chất phenol như acetosyringone giải phóng ra từ các tế bào thực vật tổn thương. Sản phẩm của quá trình này lại tiếp tục phosphoryl hóa gen virG. Sản phẩm của gen virG liên tiếp làm hoạt hóa toàn bộ các gen vir còn lại, mà hai gen cuối cùng được hoạt hóa là gen virB và virE. Trước đó, khi gen virD được hoạt hoá, sản phẩm của nó cảm ứng nhận biết RB và LB của T-DNA và làm đứt phần T-DNA ra khỏi DNA của Ti-plasmid thành các sợi đơn. Đồng thời quá trình phosphoryl hóa này cũng làm thay đổi thẩm xuất màng tế bào thực vật, màng tế bào bị mềm ra và bị thủng. Các sợi đơn T-DNA được gắn vào protein do gen virE tổng hợp và dịch chuyển về phía màng tế bào vi khuẩn. Ngay sau đó, sợi T-DNA được trượt từ vi khuẩn vào tế bào thực vật. Cầu nối chính là sự tiếp hợp (conjugation) giữa hai tế bào do cảm ứng sản phẩm gen virB mà thành. Khi T-DNA đã được chuyển giao vào tế bào thực vật, chúng nhanh chóng xâm nhập vào genome tế bào thực vật (integration) được ổn định và di truyền như các gen bình thường khác (Hình 4.6). 2. Các gen chỉ thị chọn lọc và gen chỉ thị sàng lọc Các gen chỉ thị chọn lọc chung nhất mã hóa các protein khử độc các nhân tố ức chế trao đổi chất như các kháng sinh hoặc chất diệt cỏ (herbicide). Các gen chỉ thị sàng lọc thường được sử dụng là các gen β-glucuronidase (gusA), luciferase và gần đây hơn là gen mã hóa protein phát huỳnh quang màu xanh lục (green fluorescent) của sứa. Bằng các phương pháp sinh học phân tử có thể tạo ra các cấu trúc DNA plasmid, trong đó ngoài các gen khởi động (promoter gene), các gen của vi khuẩn Agrobacterium giúp cho DNA plasmid gắn được vào bộ gen thực vật, gen ngoại lai cần chuyển vào... còn có các gen giúp phân lập ra tế bào hoặc mô thí nghiệm. Các gen được Nhập môn Công nghệ sinh học 120 lắp ghép vào DNA plasmid với mục đích này được gọi là gen chỉ thị chọn lọc hay gen chỉ thị sàng lọc. Gen chỉ thị chọn lọc thường dùng nhất là các gen mã hóa cho một số enzyme chỉ có trong vi khuẩn ở điều kiện tự nhiên mà không có trong giới thực vật. Sau khi chuyển gen, nếu thấy enzyme vi khuẩn hoạt động thì có thể suy ra là toàn bộ DNA plasmid đã được gắn vào bộ gen của thực vật và gen ngoại lai mà ta cần chuyển đã trở thành một bộ phận của bộ máy di truyền thực vật. Các gen chỉ thị thường dùng nhất là các gen: gus A, npt II, lux, cat, nos và bar (Bảng 4.3). - Gen npt II. Gen mã hóa cho neomycin phosphotransferase, đây là một enzyme vi sinh vật có trọng lượng phân tử khoảng 25 kD, xúc tác cho phản ứng phosphoryl hóa một số kháng sinh gốc aminoglycoside như neomycin, kanamycin và G148. Trong phản ứng này, nhóm γ phosphate của ATP được gắn vào phân tử chất kháng sinh làm nó trở nên bất hoạt do ngăn trở sự liên kết của kháng sinh với ribosome. - Gen bar. Gen bar là tên gọi của gen mã hóa cho enzyme phosphinothricin acetyltransferase (PAT), có tác dụng làm mất độc tính của phosphinothricin (PPT), là hoạt chất chính của thuốc trừ cỏ như Bialaphos và Basta. Gen bar được tạo dòng đầu tiên từ một dòng vi khuẩn Streptomyces hygroscopicus. Phương pháp đơn giản nhất để kiểm tra sự có mặt của gen bar là phương pháp trực tiếp. Mô, tế bào hoặc cây chuyển gen được đặt trên môi trường có các nồng độ phosphinothricin khác nhau (hoặc các thuốc trừ cỏ tương ứng) và so sánh sinh trưởng của mô, tế bào hoặc cây đối chứng đặt trên cùng môi trường. - Gen gus A. Gen mã hóa cho sinh tổng hợp enzyme β-glucuronidase. β-glucuronidase là một hydrolase xúc tác cho sự phân giải các β-glucuronide, sản phẩm phân giải có màu xanh chàm đặc trưng, dễ nhận biết. β-glucuronide thường dùng nhất trong phản ứng để nhận biết sự tồn tại của gen gus A là X-Gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide). Dung dịch X-Gluc không màu dưới tác động của enzyme β-glucuronidase sẽ chuyển sang màu xanh chàm. - Gen lacZ. Gen mã hóa cho enzyme β-galactosidase có trọng lượng phân tử 116 kD. Gen lacZ ở E. coli được dùng rất phổ biến trong công nghệ gen và đã có sẵn các hệ thống phương pháp kiểm tra rất nhạy với thuốc thử X-Gal. Sự tồn tại hoạt động của lacZ trong tế bào thực vật đã được khẳng định. Vì vậy trước khi kiểm tra sự có mặt của gen lacZ ngoại lai, cần phải bất hoạt gen lacZ nội sinh bằng glutaraldehyde. - Gen cat. Được phân lập và tạo dòng từ dòng vi khuẩn Tn9, là gen gây khả năng kháng chloramphenicol ở vi khuẩn nói chung. Gen cat đã được dùng rộng rãi trong công nghệ gen động vật và thực vật vì gen cat mã hóa cho enzyme chloramphenicol acetyltransferase (CAT). Enzyme này xúc tác phản ứng acetyl hóa hai vị trí trên phân tử chloramphenicol và làm nó bất hoạt. Nhập môn Công nghệ sinh học 122 Bảng 4.3. Hệ thống các gen chỉ thị chọn lọc và các gen chỉ thị sàng lọc A. Một số gen chỉ thị chọn lọc Ký hiệu gen Enzyme tương ứng Chất dùng để chọn lọc npt II Neomycin phosphotransferase Kanamycin hyg Hygromycin phosphotransferase Hygromycin gent Gentamycin acetyl transferase Gentamycin aat Streptomycin phosphotransferase Streptomycin bleo Enzyme kháng bleomycin Bleomycin bar Phosphinothricin acetyltransferase Phosphinothricin bxn Bromoxynil nitrilase Bromoxynil B. Một số gen chỉ thị sàng lọc Ký hiệu gen Enzyme tương ứng Chất dùng để phát hiện gus A β-glucuronidase X-Gluc lacZ β-galactosidase X-Gal luc Luciferase đom đóm Lumis Phos lux Luciferase vi khuẩn Lumi Phos cat Chloramphenicol acetyltransferase Chloramphenicol đánh dấu nos Nopaline synthase Nopaline 3. Chuyển gen bằng vi đạn Đây là phương pháp hiện đang được sử dụng phổ biến tại các phòng thí nghiệm công nghệ sinh học thực vật ở trong nước và trên thế giới. Phương pháp này được Sanford (Cornell University, USA) đề xuất lần đầu tiên vào năm 1987. Nguyên tắc của phương pháp này là sử dụng các viên đạn có kích thước hiển vi, có tỷ trọng cao để đạt gia tốc cao xuyên qua vỏ và màng tế bào, đưa lớp DNA bọc ngoài tiếp cận với bộ máy di truyền của tế bào. Hạt tungsten hoặc vàng có đường kính 1-1,5 μm được dùng làm vi đạn (microprojectile). Vi đạn được trộn với DNA theo một tỷ lệ thích hợp cùng với các chất phụ gia và sau khi kết tủa DNA bao quanh vi đạn, hỗn hợp được làm khô trên trên một đĩa kim loại mỏng kích thước 0,5-0,8 cm. Đĩa kim loại được gắn vào đầu một viên đạn lớn (macroprojectile) vừa khít với nòng của súng bắn gen (gene gun) hoặc hệ thống dội bom (bombardement). Thường đạn lớn làm bằng nhựa hoặc bông nén hay các vật liệu nhẹ. Khi bắn, áp suất hơi đẩy viên đạn lớn đi với tốc độ cao. Ra khỏi đầu nòng, một lưới thép mịn cản viên đạn lớn lại, nhưng các vi đạn vẫn tiếp tục quỹ đạo với gia tốc lớn đến đích và xuyên vào tế bào. Một tỷ lệ nhất định DNA ngoại lai hội nhập với DNA tế bào và biểu hiện, thực hiện quá trình biến nạp gen (Hình 4.7 và 4.8). 4. Các ứng dụng của công nghệ gen 4.1. Một số kết quả bước đầu Ứng dụng của các kỹ thuật chuyển gen trong công nghệ sinh học thực vật có một tiềm năng rất lớn, vượt qua các tiến bộ kỹ thuật quan trọng trong cuộc cách mạng sản xuất nông nghiệp trước đây. Nó chỉ mất bốn năm cho sự phát triển thương mại các cây trồng chuyển gen ở Bắc Mỹ và đạt tới 52% đối với đậu tương, 30% với ngô, và 9% cho cả hai loại bông và canola (năm 1999) cùng với việc tăng sản lượng trên nhiều loại cây trồng chuyển gen khác như: lúa, lúa mì, lúa mạch, lúa miến, mía, củ cải đường, cà chua, khoai tây, hướng dương, đậu phụng, đu đủ, các loài cây gỗ và các loài cây hoa như cẩm chướng… Trong số 27,8 triệu hecta cây trồng chuyển gen được canh tác trong năm 1998, thì 74% được trồng ở Mỹ, 15% Argentina, 10% ở Canada và 1% ở Úc. Các tính trạng chuyển gen được tập trung chủ yếu là chống chịu chất diệt cỏ (71%), kháng côn trùng (28%) và 1% cho các tính trạng khác. Các cây chuyển gen đang được thương mại hóa hiện nay là thế hệ đầu tiên của các cây trồng chuyển gen, và ba thế hệ cây trồng chuyển gen có thể được dự đoán trước là : - Thế hệ thứ nhất: các tính trạng sản xuất (ví dụ: chống chịu chất diệt cỏ, kháng bệnh/côn trùng). - Thế hệ thứ hai: các gen xếp thành chồng cho nhiều tính trạng (ví dụ: tổ hợp của các gen kháng bệnh cộng với các tính trạng chất lượng). - Thế hệ thứ ba: các tính trạng khác nhau được đáp ứng cho việc sử dụng đặc biệt cuối cùng (ví dụ: thực phẩm, sợi, nhiên liệu, dầu nhờn, nhựa, dược phẩm và các nguyên liệu thô cho các quá trình công nghiệp). Việc sản xuất các cây trồng chuyển gen thế hệ thứ hai đang tiến triển. Tuy nhiên, để hướng tới các lợi ích tiềm tàng của công nghệ sinh học thực vật chuyển gen, có nhiều nhân tố bổ sung cần xem xét bao gồm: sự kiểm soát công nghệ sinh học, sở hữu trí tuệ, an toàn thực phẩm, sự chấp nhận của cộng đồng, tính chất gây dị ứng, nhãn hiệu, sự chọn lựa, môi trường, sự phân biệt của các sản phẩm chuyển gen và mậu dịch quốc tế. Tầm quan trọng ở đây là việc ứng dụng và các lợi ích tiềm tàng của các kỹ thuật chuyển gen. Trong khi mọi kỹ thuật đang phát triển, thì mục đích cần đạt được là tối đa các lợi ích và giảm thiểu các rủi ro. 4.2. Triển vọng và hướng phát triển Trong những năm qua, các phương pháp biến nạp gen ở thực vật bậc cao đã có rất nhiều tiến bộ. Hiện nay, các phòng thí nghiệm công nghệ gen đang bắt tay vào việc cải thiện có ý nghĩa cho một số loài cây trồng nhờ các công cụ của sinh học tế bào và sinh học phân tử. Trong một vài trường hợp đặc biệt (đậu tương, lúa, ngô và bông) các phương pháp biến nạp gen bị giới hạn bởi genotype. Một số các cây trồng quan trọng cần thiết cho nhu cầu sử dụng của người dân ở các nước đang phát triển hiện ít được chú ý. Công nghệ di truyền thực vật là một bước ngoặt quyết định. Một số cây trồng quan trọng đã được biến nạp gen; một vài vấn đề kỹ thuật vẫn đang còn tồn tại, nhưng chúng đang dần dần được giải quyết. Để có kết quả cần phải thay đổi dần dần sang một phạm vi khác, như là phát hiện và tạo dòng các gen mang các tính trạng đa gen (multigenic traits). Một điều không thể quên là vấn đề nhận thức của xã hội và dự báo nguy cơ tác động xấu đến môi trường do các sản phẩm có nguồn gốc từ công nghệ tái tổ hợp DNA mang lại. Hiện nay, công nghệ biến nạp gen đang được quan tâm hơn thông qua các quỹ tài trợ của các cơ quan quốc tế như là chương trình Rockefeller Foundation (Mỹ), và vấn đề đang được thảo luận nhiều là cần thiết xác định phương thức tốt nhất để chuyển các lợi ích do công nghệ biến nạp gen mang lại đến các nước đang phát triển. Cây biến nạp gen đầu tiên thu được vào năm 1983. Điều này cho phép nhận xét rằng mới chỉ hơn hai thập niên, các công cụ của công nghệ DNA tái tổ hợp và sinh học tế bào đã giúp ích rất nhiều cho các nhà tạo giống thực vật. Việc lựa chọn phương thức sử dụng các cây trồng thu được từ công nghệ DNA tái tổ hợp có thể cung cấp thêm nguồn tài nguyên mới cho công nghiệp và người tiêu dùng, như vậy có thể mở rộng cơ sở kinh tế ở cả các nước công nghiệp lẫn các nước đang phát triển. 5. Công nghệ di truyền trong kháng chất diệt cỏ Ước tính khoảng 10% tổng sản lượng lương thực hàng năm trên thế giới bị mất mát do cỏ dại, mặc dù đã tiêu tốn khoảng 10 tỷ USD và sử dụng trên 100 loại hoá chất khác nhau để diệt trừ. Hơn nữa, dùng thuốc diệt cỏ dại vẫn bị hạn chế vì nhiều loại thuốc không phân biệt được cỏ dại và cây trồng. Glyphosate (phosphonomethyl glycine) là một loại thuốc diệt được nhiều loại cỏ dại nhưng chúng cũng có thể làm chết cây trồng. Vì vậy, nếu tạo được các giống cây chuyển gen chống chịu được glyphosate thì nó sẽ được dùng phổ biến để diệt cỏ. Một trong những hướng nghiên cứu là chuyển gen sản xuất dư thừa 5-enolopyruvyl-shikimate-3-phosphatase (EPSP), một enzyme bị ức chế bởi thuốc diệt cỏ glyphosate. Nghĩa là nếu cây sản xuất được nhiều enzyme EPSP chúng có thể chống chịu được glyphosate. Chất diệt cỏ là phương pháp được chọn lựa để kiểm soát cỏ dại trong hầu hết các hệ thống nông nghiệp quy mô lớn. Chúng đóng một vai trò quan trọng trong việc tăng sản lượng cây trồng bằng cách giảm thiểu sự cạnh tranh giữa cây trồng với cỏ dại về không gian, ánh sáng, nước và chất dinh dưỡng. Cỏ dại cũng có thể hoạt động như một nguồn cung cấp các tác nhân gây bệnh cho cây trồng. Do các gen kháng chất diệt cỏ cũng là các gen chỉ thị chọn lọc hiệu quả trong trồng trọt, nên đây là tính trạng chuyển gen đầu tiên được sản xuất và thương mại hóa, và các thứ (variety) chống chịu chất diệt cỏ vẫn đang là các cây trồng chuyển gen sinh trưởng rộng rãi nhất. Dựa trên cơ sở hoặc là sự biểu hiện của gen không mẫn cảm chất diệt cỏ, sự thoái biến của chất diệt cỏ hoặc sự biểu hiện mạnh của sản phẩm gen đích của chất diệt cỏ, mà tính kháng được chuyển gen thích hợp trong một phạm vi rộng các chất diệt cỏ như: 2,4-D, glyphosate, glufosinate, protoporphyrinogen oxidase inhibitors, imidazalonones, chlorsulfuron/sulfonylureas, bromoxynil, triazines và isoxazoles. Hiện nay, có những bằng chứng tốt cho thấy chẳng những không tăng sử dụng của các chất diệt cỏ, mà sự điều chỉnh các cây trồng chuyển gen kháng chất diệt cỏ được cung cấp cho nông dân đã cho kết quả giảm sử dụng glyphosate tới 33% trên các giống đậu tương Roundup Ready, và giảm sử dụng glufosinate khoảng 20% đối với giống canola Liberty Link. 6. Công nghệ di truyền trong kháng sâu-bệnh 6.1. Kháng côn trùng Sử dụng hóa chất để phòng trừ sâu bọ côn trùng vừa đắt tiền vừa tác động xấu đến môi trường. Các cây trồng như bông, ngô và khoai tây chuyển gen đang được sinh trưởng thương mại biểu hiện độc tố của Bacillus thuringiensis (Bt) để tạo ra tính kháng đối với các côn trùng nhóm nhai-nghiền (chewing insects). B. thuringiensis tổng hợp các protein δ-endotoxin tinh thể được mã hóa bởi các gen Cry. Khi côn trùng ăn vào bụng, các prototoxins bị đứt gãy trong dạ dày kiềm của côn trùng để tạo thành độc tố hoạt động. Các liên kết này tạo ra các receptor đặc trưng trong các tế bào biểu mô ruột làm thành các lỗ chân lông và cuối cùng là gây chết côn trùng. Một số ưu điểm của độc tố Bt như sau : - Tính đặc hiệu, mỗi protein Cry chỉ hoạt động chống lại một hoặc một vài loài côn trùng. - Sự đa dạng, nhiều protein Cry khác nhau đã được nhận biết. - Các ảnh hưởng không bất lợi hoặc bị giảm đã được xác nhận trên các côn trùng không phải đích hoặc các địch thủ tự nhiên của côn trùng. - Độc tính với động vật có vú là rất thấp. - Có thể thoái biến dễ dàng. Kết quả nghiên cứu cho thấy điểm mấu chốt là gen chịu trách nhiệm tổng hợp protein tinh thể trừ sâu của vi khuẩn B. thuringiensis chủng kurstaki, chưa đặc biệt biểu hiện rõ ở cây trồng. Để nâng cao hiệu quả của độc tố, các nhà nghiên cứu đã cắt bớt gen chỉ để tổng hợp phần protein có hoạt tính chứa độc tố mà không cần các phần gen phụ khác. Gen Cry được cắt bớt đã biểu hiện tổng hợp protein gấp 500 lần so với gen tự nhiên. Hiện nay, hơn 40 gen khác nhau mang tính kháng côn trùng đã được hợp nhất trong cây trồng chuyển gen với một vài giống đã được thương mại hóa ở các nước khác nhau như Mỹ và Úc. Đưa ra lợi ích của các độc tố của Bt đối với sự kiểm soát côn trùng, các phương thức quản lý khác nhau phải được chấp nhận để làm chậm sự phát triển của tính kháng côn trùng đối với Bt. Những cái đó bao gồm : - Bố trí các vùng bên cạnh trồng cây bông không chuyển gen Bt làm nơi trú ẩn để giảm áp lực chọn lọc hướng tới việc kháng côn trùng. - Triển khai các gen kháng côn trùng khác nhau (ví dụ: protease inhibitors). - Dùng các loại độc tố Bt cho các receptors đích khác nhau. - Dùng các promoter khác nhau để điều chỉnh sự biểu hiện của các gen Bt. - Dùng các promoter đặc trưng mô (tissue-specific promoter) như thế côn trùng có thể ăn mà không tổn hại đến kinh tế trên các bộ phận ít quan trọng của thực vật. Có các hướng khác để phát triển tính kháng côn trùng cho cây chuyển gen dựa trên cơ sở: protease inhibitors, α-amylase, lectins, chitinases, cholesterol oxidase, các virus của côn trùng được tạo dòng, tryptophan decarboxylase, anti-chymotrypsin, anti-elastace, nhân tố ức chế trypsin tuyến tuỵ của bò và nhân tố ức chế lá lách. 6.2. Kháng các virus thực vật Các virus gây ra những thiệt hại đáng kể trong hầu hết các cây trồng lương thực và cây cho sợi trên phạm vi thế giới. Nhiều phương thức được sử dụng để kiểm soát sự xâm nhiễm virus bao gồm các xử lý hóa học để giết các vector virus, chuyển vào cây trồng các gen kháng tự nhiên từ các loài liên quan, sử dụng chẩn đoán và chỉ dẫn để đảm bảo nhân giống các vật liệu khởi đầu sạch virus (ví dụ: hạt, củ…). Tuy nhiên, sự phát triển chính đã khai thác tính kháng xuất phát từ các tác nhân gây bệnh, ví dụ: sử dụng các trình tự xuất phát từ virus được biểu hiện trong các cây chuyển gen để cung cấp tính kháng đối với các virus thực vật. Hướng này dựa trên cơ sở các nghiên cứu về sự gây nhiễm (inoculation) hay xâm nhiễm (infection) ở thực vật khởi đầu với các chủng virus nhẹ cung cấp sự bảo vệ chống lại sự gây nhiễm tiếp theo với cùng loại chủng virus hoặc các virus liên quan gần gũi. Tính kháng bắt nguồn từ tác nhân gây bệnh như vậy đòi hỏi sự biến nạp thực vật với các trình tự xuất phát từ virus; tính kháng vật chủ xuất hiện cho kết quả từ hai cơ chế khác nhau: (1) sự bảo vệ được dàn xếp bởi sự biểu hiện của các protein virus tự nhiên hoặc cải biến (ví dụ: protein vỏ, replicase, và replicase khiếm khuyết), và (2) sự bảo vệ được dàn xếp ở mức độ phiên mã (“RNA-mediated resistance”), đòi hỏi sự phiên mã của RNA hoặc từ các chuỗi hoàn chỉnh hoặc từng phần xuất phát từ virus đích (bao gồm các gen cho protein vỏ, replicase, replicase khiếm khuyết, protease, protein vận động…). Trường hợp các phân tử làm nền tảng cho tính kháng xuất phát từ virus là đối tượng của nghiên cứu chuyên sâu. Cơ sở của tính kháng virus được sắp đặt bởi RNA (RNA-mediated) và sự im lặng của các gen hậu dịch mã có khả năng tương tự và phản ánh các họat động cơ bản trong trong các tế bào thực vật để phát hiện, bất hoạt và đào thải các DNA hoặc các RNA ngoại lai. Ví dụ : các gen nội sinh của thực vật được chèn vào virus như PVX có thể biểu hiện im lặng của gen nội sinh của thực vật. Để tạo giống cây trồng chống chịu virus, hiện nay có các hướng : - Bảo vệ chéo. - Sử dụng RNA vệ tinh. - Sử dụng enzyme replicase. 6.2.1. Bảo vệ chéo Là biện pháp lợi dụng hiện tượng lớp vỏ protein của virus thứ nhất đã cản trở sự xâm nhập của virus thứ hai, nghĩa là cho cây nhiễm loại virus có độc lực vừa phải sẽ chống được sự xâm nhiễm của virus có độc lực cao hơn. Để tăng cường khả năng biểu hiện gen protein vỏ người ta gắn thêm vào đuôi phần promoter 35S từ virus khảm súp lơ (CaMV) và đưa vào genome cây trồng nhờ hệ thống Ti-plasmid của Agrobacterium. Thành công đầu tiên theo hướng này là kháng bệnh virus khảm thuốc lá (TMV) ở cây thuốc lá, nhờ sự biểu hiện gen CP. Thí nghiệm đồng ruộng đầu tiên về cây cà chua biểu hiện gen CP kháng bệnh TMV tiến hành năm 1987 tại Mỹ và cho kết quả kháng bệnh cao. Sau đó hàng loạt kết quả chứng tỏ gen CP có hiệu lực đối với tất cả các loại virus gây bệnh ở 20 loài cây khác nhau kể cả các loại cây trồng như cà chua (1987) dưa hấu (1987) lúa (1990) đu đủ, khoai tây (1989, 1990) và củ cải đường. Qua hàng loạt thí nghiệm đồng ruộng, Bộ Nông nghiệp Mỹ đã công nhận giống quốc gia cho giống bí xanh (Freedom II) kháng virus (1995). Các giống khoai tây, dưa chuột cà chua chống bệnh virus đã và đang được tiếp tục công nhận. 6.2.2. Sử dụng RNA vệ tinh Trong một số quần thể virus có các thực thể giống virus chứa các phân tử RNA nhỏ hơn gọi là RNA vệ tinh (sattelite RNA). RNA vệ tinh dường như không mã hóa cho bất cứ protein nào nhưng được nhân lên nhờ enzyme của RNA từ virus bình thường và hợp thành các tiểu phần giống virus có vỏ protein. Một số RNA vệ tinh có thể ức chế rất mạnh sự nhân bản của virus bình thường. cDNA từ RNA vệ tinh được tổng hợp với sự tham gia của promoter 35S CaMV rồi đưa vào cây thông qua hệ thống Ti-plasmid của Agrobacterium. Các cây được chuyển gen kiểu này thể hiện tính kháng virus thuốc lá và virus khảm dưa chuột khá tốt. Tuy nhiên, so với tính kháng theo phương pháp bảo vệ chéo, tính kháng này khó đạt hơn vì phải cần nồng độ virus rất cao. Bên cạnh đó, người ta vẫn lo ngại dễ xảy ra hiện tượng đột biến từ phân tử RNA vệ tinh thành một loại gây độc cho chính cây chủ. 6.2.3. Sử dụng enzyme replicase Replicase là enzyme tham gia quá trình tổng hợp nucleic acid của virus, hoạt hoá cho sự nhân lên của DNA hoặc RNA theo cơ chế bổ sung. Cây trồng chống virus cũng có thể được tạo ra bằng chuyển các gen replicase với nhiều đoạn bị biến đổi hoặc bị cắt bớt, kết quả cho thấy kháng virus rất cao. Ví dụ, thuốc lá theo phương pháp chuyển gen đã biểu hiện gen replicase bị cắt bớt cho khả năng kháng virus khảm thuốc lá rất tốt (1990). Hiện nay, vẫn chưa thành công với enzyme replicase của virus khảm từ cỏ alfalfa đối với bệnh virus khảm thuốc lá. Protoplast đại mạch được chuyển gen replicase từ virus khảm brome cũng chưa kháng được bệnh này ở đại mạch. Tuy thế, từ khi tìm thấy hướng ứng dụng gen replicase, người ta vẫn đang hy vọng vào hướng này. 6.3. Kháng các bệnh nấm Nấm bệnh gây hại cây trồng rất nặng, nhất là ở các nước nhiệt đới có độ ẩm cao. Cải tạo giống chống nấm hại dựa trên nguyên lý đưa gen mã hóa một loại enzyme nào đó có tác dụng ức chế trực tiếp hoặc gián tiếp đến sự phát triển của nấm hại. Enzyme làm thoái hóa các thành phần chính của vỏ tế bào nấm chitin và β-1,3 glucan là loại đang được chú ý. Khi có gen chitinase chuyển vào, cây thuốc lá chuyển gen đã tăng cường hoạt tính chống nấm hại. Sự biểu hiện đồng thời của cả hai gen chitinase và glucanase trong thuốc lá làm cho cây có tính kháng nấm hại cao hơn cây có một gen độc lập. Cũng tương tự, cà chua cho tính kháng nấm Fusarium cao hơn hẳn, sau khi được chuyển giao cả hai gen nói trên. Protein ức chế ribosome (RIP) cũng biểu hiện tính kháng nấm khả quan. Cây thuốc lá cho tính kháng nấm rất tốt, khi cây được chuyển giao đồng thời gen RIP và chitinase. 6.4. Kháng các bệnh vi khuẩn Đối với vi khuẩn, hướng nghiên cứu tạo giống CNSH mới bắt đầu. Về cơ bản có ba hướng : - Dùng gen mã hóa enzyme làm thoái hoá thành tế bào vi khuẩn, ví dụ gen lysozyme từ các nguồn tế bào động vật hoặc gen lysozyme từ thực khuẩn thể T4 đưa vào cây thuốc lá và khoai tây. Các gen này biểu hiện rất cao hoạt tính lysozyme và các tế bào có khả năng phòng trừ vi khuẩn Erwina carotovora rất tốt. - Gen mã hóa α-thionin-cystein được chuyển giao sang cây thuốc lá cũng phòng ngừa được vi khuẩn Pseudomonas syringae. - Cấy gen sản xuất protein làm giảm độc tố của vi khuẩn, là hướng có nhiều hứa hẹn. Gen này chủ yếu là gen sản xuất các loại enzyme phân hủy độc tố của vi khuẩn, do vậy vô hiệu Theo nhập môn công nghệ sinh học của Nguyễn Hoàng Lộc