Kỹ Thuật Nhuộm đặc Hiệu Phát Hiện Nấm Trong Mô

Phan Thị Huyền, Nguyễn Thị Quỳnh Giang Hoàng Ngọc Thạch, Phó Hồng Điệp

I. ĐẶT VẤN ĐỀ

Nấm là một tác nhân thường gặp trên lâm sàng thường không gây nhiều khó khăn cho các nhà lâm sàng trong quá trình điều trị nếu đã biết rõ tác nhân. Vị trí tổn thương do nấm gây ra có thể ở da, tóc, móng và các tạng sâu như ruột, phổi, não…

Vấn đề khó khăn cho quá trình điều trị và có thể gây tử vong là nhiều trường hợp nhiễm nấm thường gặp ở các bệnh nhân có suy giảm miễn dịch hoặc các bệnh nhân nhiễm trùng nặng đã thay đổi nhiều kháng sinh mà không kết quả.

Cấy nấm tìm tác nhân là phương pháp dễ tiếp cận tuy nhiên không phải bao giờ cũng cho kết quả dương tính thật. Trong những tình huống này sinh thiết tìm nguyên nhân là giải pháp cần thiết. Các trường hợp nhiễm trùng nặng đặc biệt là viêm phổi, đã điều trị bằng nhiều phác đồ nhưng không kết quả, bệnh nhân tử vong không rõ căn nguyên cũng cần lấy mẫu (tử thiết tối thiểu) để kiểm tra.

Trên mẫu mô học nhuộm HE (Hematoxylin – Eosin) thông thường có thể đánh giá được tổn thương tại mô nói chung, nhưng việc xác định nấm là khó khăn. Nhuộm PAS (Periodic axid-Ship) có thể xác định được thân nấm dương tính bắt màu đỏ do nhuộm đích là thành phàn glycogen trong thân nấm, tuy nhiên các thành phần khác trong mô có chứa glycogen cũng sẽ dương tính. Để nhuộm đặc hiệu tìm nấm, tránh dương tính giả, Giải phẫu bệnh sử dụng phương pháp nhuộm Grocott’s. II. PHƯƠNG PHÁP NHUỘM GROCOTT’S

Nguyên lý: Acid chromic có tác dụng oxi hoá các phân tử polysacarid trong mô bệnh và các tế bào thân nấm thành aldehyt. Sau đó chỉ những phân tử polysacrid có trọng lượng lớn (thân nấm) mới hoạt động trở lại dung dịch có tính kiềm là bạc methanamin, các phân tử bạc được gắn vào thân nấm.

Quy trình: 1. Mẫu sinh thiết cố định, chuyển, đúc theo quy trình, cắt dàydày 3 micromet 2. Tiêu bản được loại nến, xylen, cồn như thường lệ 3. Oxi hoá trong acid chromic 1h. Rửa nước 4. Xử lý mảnh cắt trong sodium metabisulfit 1% trong 1 phút. Rửa nước 3 phút 5. Để tiêu bản trong dung dịch bạc ở 600 trong 15 – 20 phút cho tới khi mảnh cắt có màu vàng nâu. Rửa nước 6. Làm dịu màu với Gold chlorid 0,2 % trong 2 phút. Rửa nước 7. Xử lý mảnh cắt với dung dịch sodium thiosulfate 2% trong 2 phút. Rửa nước 8. Đối lập màu bằng cách để trong dung dịch ligh green 1% trong 15 giây 9. Loại hoá chất thừa bằng cồn, làm sạch, gắn bôm

Kết quả: Thân nấm, bào tử nấm: Bắt màu đen Mô nền: Bắt màu xanh nhạt III. CA BỆNH THỰC HÀNH 1. Trường hợp 1: Mã BN: 12412362 Mã số GPB: 01A/13 Giải phẫu bệnh: mẫu tử thiết tối thiểu (necropsy) tại phổi. Kết quả nhuộm nấm (+), hình thái nấm loại Aspergillus. So sánh 2 phương pháp nhuộm xác định nấm Grocott’s (H1) và PAS (H2).

H1. Nhuộm Grocott’s. Sợi nấm màu đen rõ trên mô nền   H2.Nhuộm PAS. Sợi nấm màu đỏ không nổi bật trên mô nền

2. Trường hợp 2: Mã BN: 13365862 Mã số GPB: 02A/13 Giải phẫu Bệnh: Mẫu tử thiết phổi tối thiểu. Kết quả nhuộm nấm (+), hình thái nấm loại Aspergillus. So sánh 2 phương pháp nhuộm xác định nấm Grocott’s (H3) và PAS (H4).

H3. Nhuộm Grocott’s, sợi nấm (+) màu đen nổi bật.  H4. Nhuộm PAS,nấm (+) màu đỏ trên nền đỏ không tương phản.

IV. KẾT LUẬN Nhuộm Grocott’s là phương pháp tìm nấm khá đặc hiệu nên áp dụng rộng rãi cho những tổn thương mô và cơ quan nghi nhiễm nấm.