KỸ THUẬT NHUỘM PERIODIC ACID SCHIFF Và Các ỨNG DỤNG

Tải bản đầy đủ (.doc) (58 trang)

1. Trang chủ
>>
2. Luận Văn - Báo Cáo
>>
3. Y khoa - Dược

KỸ THUẬT NHUỘM PERIODIC ACID SCHIFF và các ỨNG DỤNG

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.9 MB, 58 trang )

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOBỘ Y TẾTRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI---------------------------NGUYỄN KIM ĐỒNGKỸ THUẬT NHUỘM PERIODIC ACID SCHIFFVÀ CÁC ỨNG DỤNGKHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN KỸ THUẬT Y HỌCKHÓA 2011 – 2015HÀ NỘI – 2015BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOBỘ Y TẾTRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI---------------------------NGUYỄN KIM ĐỒNGKỸ THUẬT NHUỘM PERIODIC ACID SCHIFFVÀ CÁC ỨNG DỤNGKHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN KỸ THUẬT Y HỌCKHÓA 2011 – 2015NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:ThS.BS. TRẦN NGỌC MINHCN. NGUYỄN NGỌC QUÂNHÀ NỘI – 2015LỜI CẢM ƠNTrong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn này, ngoài sự nỗ lựccủa bản thân, em đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ, động viên và chỉ bảo tậntình của các thầy, các cô, gia đình cũng như bạn bè.Trước hết, em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu, Phòng đào tạoĐại học, Bộ môn Giải phẫu bệnh trường Đại học Y Hà Nội, phòng Giải phẫubệnh – khoa xét nghiệm bệnh viện Đại học Y Hà Nội đã cho phép và tạo mọiđiều kiện tốt nhất để em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.Em xin bày tỏ lòng kính trọng và cảm ơn sâu sắc tới ThS.BS. TrầnNgọc Minh và CN. Nguyễn Ngọc Quân – cán bộ bộ môn Giải phẫu bệnhtrường Đại học Y Hà Nội. Thầy đã hướng dẫn, chỉ bảo tận tình, động viên emkhông chỉ trong suốt quá trình thực hiện khóa luận. Thầy đã dành cho em sựgiúp đỡ quý báu trong học tập và còn trong cả cuộc sống.Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến toàn thể các thầy, các cô, các anhchị trong bộ môn Giải phẫu bệnh – Trường Đại học Y hà Nội đã tạo mọi điềukiện, giúp đỡ tận tình trong quá trình hoàn thành khóa luận.Em xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới toàn thể thầy cô, anh chịtrong phòng Giải phẫu bệnh – khoa xét nghiệm bệnh viện Đại học Y Hà Nộiđã tạo mọi điều kiện thuận lợi, nhiệt tình hướng dẫn, chỉ bảo tận tình trongsuốt quá trình em thực hiện khóa luận.Kết quả này con xin dành tặng ông bà, bố mẹ đã luôn ở bên con, chia sẻvà động viên con suốt cuộc đời.Cuối cùng em xin được gửi lời cảm ơn tới tất cả những người bạn đãgiúp đỡ, động viên em suốt 4 năm học vừa qua.Hà Nội, tháng 6 năm 2015Nguyễn Kim ĐồngDANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮTPASPeriodic Acid SchiffHEHematoxylin – EosinGMSGrocott’s Methenamine SilverMỤC LỤCĐẶT VẤN ĐỀ....................................................................................................1CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU..........................................................31.1. Giới thiệu về phương pháp nhuộm PAS.....................................................31.2. Tổng quan về carbohydrate........................................................................41.2.1. Phân loại carbohydrate........................................................................41.2.2. Monosaccharide – cấu trúc cơ bản của carbohydrate..........................51.2.3. Polysaccharide.....................................................................................61.3. Glycogen....................................................................................................61.4. Chất nhầy – Mucins....................................................................................71.4.1. Chất nhầy trung tính............................................................................81.4.2. Chất nhầy acid.....................................................................................91.5. Nấm..........................................................................................................10CHƯƠNG 2: KỸ THUẬT NHUỘM PERIODIC ACID SCHIFF................122.1. Nguyên lý của phương pháp nhuộm PAS................................................122.2. Cơ chế phản ứng của kỹ thuật PAS..........................................................122.2.1. Phản ứng oxy hóa của acid periodic..................................................132.2.2. Phản ứng hiện màu của thuốc thử Schiff...........................................152.2.3. Nhuộm nhân......................................................................................182.3. Chuẩn bị mảnh cắt và hóa chất nhuộm....................................................202.3.1. Chuẩn bị mảnh cắt.............................................................................222.3.2. Chuẩn bị hóa chất..............................................................................242.4. Quy trình nhuộm......................................................................................292.4.1. Quy trình nhuộm PAS theo hướng dẫn của tài liệu “Giải phẫu bệnh vithể lâm sàng”...............................................................................................292.4.2. Quy trình nhuộm PAS tại phòng Giải phẫu bệnh – Bệnh viện Đại họcY Hà Nội......................................................................................................292.5. Kết quả.....................................................................................................302.6. Tiêu chuẩn của một tiêu bản nhuộm PAS đạt yêu cầu.............................312.7. Các kỹ thuật PAS cải tiến.........................................................................332.7.1. Kỹ thuật PAS phát hiện glycogen......................................................332.7.2. Kỹ thuật nhuộm phối hợp Alcian blue - PAS....................................34CHƯƠNG 3: CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG CHẤT LƯỢNG NHUỘMPERIODIC ACID SCHIFF VÀ CÁCH KHẮC PHỤC.................................373.1. Cố định.....................................................................................................373.2. Cắt và dán mảnh.......................................................................................383.3. Tẩy paraffin..............................................................................................393.4. Quá trình oxy hóa trong acid periodic......................................................393.5. Thời gian phản ứng với thuốc thử Schiff.................................................403.6. Nhuộm nhân.............................................................................................413.7. Chất lượng hóa chất..................................................................................413.8. pH nước rửa.............................................................................................423.9. Một số yếu tố khác ảnh hưởng tới chất lượng tiêu bản nhuộm PAS........423.10. Một số kiến nghị nhằm đảm bảo chất lượng tiêu bản nhuộm PAS........43KẾT LUẬN.....................................................................................................45TÀI LIỆU THAM KHẢODANH MỤC BẢNGBảng 2.1. Một số phương pháp pha thuốc thử Schiff.....................................25Bảng 2.2. Một số cách pha Hematoxyline theo Gill...........................................28DANH MỤC HÌNHHình 1.1. Cấu trúc của β-D-glucose..................................................................5Hình 1.2. Hai đơn vị glucose liên kết với nhau bởi liên kết α1-4 glycosidic.....6Hình 2.1. Chuỗi phản ứng trong kỹ thuật PAS..............................................13Hình 2.2. Acid periodic....................................................................................13Hình 2.3. Quá trình oxy hóa của acid periodic...............................................14Hình 2.4. Phản ứng tạo thành thuốc thử Schiff..............................................17Hình 2.5. Cơ chế nhộm màu của thuốc thử Schiff trong kỹ thuật PAS.........18Hình 2.6. Hematoxylin bị oxy hóa thành Hematin.........................................19Hình 2.7. Quá trình gắn hematin vào nhân qua chất gắn màu.............................20DANH MỤC ẢNHẢnh 2.1. Ung thư biểu mô tế bào nhẫn. PAS x 100 và 400.............................31Ảnh 2.2. Ung thư biểu mô tế bào nhẫn di căn tới tủy xương PAS x 100 và 400..........................................................................................................31Ảnh 2.3. Tế bào gan chứa glycogen. PAS x 100..............................................32Ảnh 2.4. Nấm Candida bắt màu hồng đậm. PAS x 400..................................32Ảnh 2.5. Glycogen dương tính với mảnh S, âm tính với mảnh C. PAS x 100..........................................................................................................34Ảnh 2.6. Mô dạ dày có dị sản ruột (Xanh Alcian/PAS). pH =1,5...................36Ảnh 2.7. Tiêu bản nhuộm nhạt màu do thời gian phản ứng với thuốc thửSChiff chưa đủ. PAS x 100..............................................................40Ảnh 2.8. Bắt màu quá mức do thời gian phản ứng với thuốc thử Schiff quá lâu.PAS x 100.........................................................................................401ĐẶT VẤN ĐỀTrong chẩn đoán bệnh, nhiều phương pháp chẩn đoán khác nhau đượcsử dụng phối hợp, hỗ trợ nhằm chẩn đoán bệnh một cách chính xác. Thế kỉ 21là thế kỉ của y học bằng cớ, cho nên chẩn đoán giải phẫu bệnh là một trongnhững phương pháp chẩn đoán có vai trò to lớn và vô cùng quan trọng, giúpquan sát đánh giá tận bản chất của các tổn thương. Vì vậy, trong chẩn đoánbệnh học hiện đại người ta cho rằng, tiêu chuẩn của chẩn đoán giải phẫu bệnhgần như được coi là tiêu chuẩn vàng. Để có thể chẩn đoán mô bệnh học, cácmảnh sinh thiết hay tử thiết từ các mô cần phải được nhuộm màu. Các thànhphần khác nhau trong tế bào khi được nhuộm màu sẽ bắt màu riêng biệt, giúpcác nhà mô bệnh học có thể phân biệt rõ ràng các thành phần cấu thành tế bàovà mô, là cơ sở cho chẩn đoán và tiên lượng bệnh. Có thể sử dụng một loạiphẩm nhuộm hay cùng lúc nhiều loại phẩm nhuộm khác nhau để nhuộm nhiềuthành phần khác nhau của tế bào và mô nhưng phải tuân thủ hai nguyên tắc cơbản: một là các phẩm nhuộm phải bắt màu chọn lọc trên từng thành phần màkhông cản trở sự bắt màu của phẩm nhuộm kế tiếp hoặc sau đó; hai là phải đạtđược sự tương phản giữa các thành phần hoặc cấu trúc cần phân tích để có thểnhận định rõ ràng. Kỹ thuật nhộm Hematoxylin - Eosin (HE) với nhiều ưuđiểm, cho phép phân biệt rõ ràng thành phần nhân và bào tương, cho phépnhận định khá rõ các thành phần cũng như cấu trúc của tế bào và mô, cungcấp những thông tin rất có giá trị đã trở thành kỹ thuật thường quy ngay từthời kì sơ khai.Tuy nhiên, với sự đa dạng của các tổn thương, đòi hỏi nhận định cácthành phần cụ thể hơn, cung cấp thông tin đặc hiệu hơn cho các tình trạngbệnh lí khác nhau thì kỹ thuật nhuộm HE là chưa đủ. Vì vậy, cần có sự ra đờicủa các kỹ thuật nhuộm khác nhau phục vụ cho những mục đích khác nhau2trong chẩn đoán, giúp cung cấp những thông tin mà kỹ thuật nhuộm HEkhông đáp ứng được. Kỹ thuật Periodic Acid Schiff (PAS) được ra đời để đápứng một trong số yêu cầu trên, cung cấp những thông tin hữu ích cho chẩnđoán mô bệnh học.Kỹ thuật nhuộm PAS với bản chất hoạt động dựa trên các phản ứng hóahọc kế tiếp nhau, giúp các chất cần phát hiện tạo thành phức hợp với nhómmang màu, kết quả là sự nhuộm màu đặc trưng cho một số thành phần ngoàinhân trong tế bào và mô. Kỹ thuật nhuộm PAS được sử dụng chủ yếu nhằmphát hiện sự có mặt của glycogen, chất nhầy, nấm và một số thành phần khácdựa trên cấu trúc hóa học của các thành phần này. Sự có mặt của liên kết giữahai nguyên tử carbon trong vòng hexose của các phân tử carbohydrate, cótrong một số nhóm hóa học (các nhóm glycol 1-2, hydro-1, amino-2,hydroxy-1, alkylamino-2, hydroxyl-1, ceto-2…) ở các thành phần trên là cơsở của kỹ thuật nhuộm PAS.Với những giá trị của mình, kỹ thuật nhuộm PAS ngày càng đóng vaitrò quan trọng trong chẩn đoán mô bệnh học, được phổ biến rộng rãi, songhành cùng với kỹ thuật HE thường quy. Trong phạm vi bài khóa luận tốtnghiệp Cử nhân Kỹ thuật y học, em lựa chọn đề tài: “Kỹ thuật nhuộmPeriodic Acid Schiff và các ứng dụng” với mục tiêu như sau:1. Trình bày tổng quan kỹ thuật nhuộm Periodic Acid Schiff trong chẩnđoán mô bệnh học.2.Nhận xét về một số yếu tố ảnh hưởng đến phương pháp nhuộm PAS.3CHƯƠNG 1TỔNG QUAN TÀI LIỆU1.1. Giới thiệu về phương pháp nhuộm PASKỹ thuật PAS được sử dụng lần đầu tiên bởi McManus vào năm 1946để phát hiện sự có mặt của chất nhầy. Tuy nhiên sau đó nhiều công trìnhnghiên cứu khác đã cho thấy của kỹ thuật PAS còn rất hữu ích trong sự pháthiện các phân tử có chứa carbohydrate khác như là glycogen và đặc biệt là cácglycoprotein. Phản ứng PAS dương tính với nhiều loại mô và tế bào khácnhau trong cơ thể, với các thành phần như: glycolgen, tinh bột, chất nhầy(chất nhầy trung tính, sialomucin), màng đáy, nấm…Kỹ thuật PAS có thể hỗ trợ trong việc chẩn đoán phân biệt các khối uthông qua việc phát hiện các chất nhầy hoặc glycogen. Phản ứng của thuốcthử Schiff với glycoprotein có trong màng đáy cho kỹ thuật PAS một phươngtiện có giá trị để đánh giá độ dày màng đáy. Tăng độ dày màng đáy, đặc biệt làtrong các mao mạch cầu thận của thận, là dấu hiệu của một số bệnh lý. Kỹ thuậtPAS cũng là một phương pháp có độ nhạy cao và tương đối đặc hiệu để pháthiện nấm trong mô dựa trên sự xuất hiện của các polysaccharide phản ứng vớiacid periodic trong bao nang hoặc lớp vách của nhiều loài nấm. Một số loài nấmthông thường dương tính với kỹ thuật PAS bao gồm Candida albicans,Histoplasma capsulatum, Cryptococcus, và Blastomyces.Kỹ thuật PAS sử dụng acid periodic làm tác nhân oxy hóa để bẻ gãyliên kết giữa hai nguyên tử carbon liền kề trong vòng hexose của carbohydratecó trong mô và làm xuất hiện nhóm chức aldehyde sẽ được phát hiện nhờthuốc thử Schiff. Các chất có cấu tạo với hàm lượng lớn carbohydrate sẽ đượcphát hiện bởi kỹ thuật nhuộm PAS dựa trên cấu trúc hóa học của chúng (chấtnhầy, glycogen, màng đáy, nấm).4Phương pháp nhuộm PAS thường được sử dụng để chẩn đoán và hỗ trợđiều trị các bệnh sau:- Bệnh dự trữ glycogen.- Ung thư biểu mô tuyến nói chung thường tiết chất nhầy trung tính.- Nhiễm nấm, thành tế bào của nấm có màu đỏ tươi.- Bệnh lí cầu thận.- Ung thư mô liên kết phần mềm dạng nang.- Bệnh Paget của vú.- Nhuộm các đại thực bào trong bệnh Whipple.- Nó có thể được sử dụng để chẩn đoán thiếu hụt α-1-antitrypsin nếuxung quanh tĩnh mạch cửa của gan dương tính với phương pháp nhuộm này.- Erythroleukemia, bệnh bạch cầu non trong máu ngoại vi. Những tếbào này khi nhuộm bắt màu sáng.- Phế nang phổi có protein (tích tụ protein thừa).- Còn được sử dụng để xác định glycogen trong mẫu sinh thiết phổi củatrẻ sơ sinh trong bệnh glycogenosis phổi kẽ.1.2. Tổng quan về carbohydrate1.2.1. Phân loại carbohydrateCarbohydrate được chia thành hai loại lớn: carbohydrate đơn giản hoặcnhững phân tử gồm hoàn toàn của carbohydrate, và glycoconjugate -những phântử gồm carbohydrate và các phân tử khác như protein hoặc lipid. Cáccarbohydrate đơn giản được tiếp tục phân loại như monosaccharide (glucose,mannose, galactose), oligosaccharide (sucrose, maltose), hoặc polysaccharide(glycogen, tinh bột). Glycoconjugate tiếp tục được chia thành các proteoglycan,chất nhầy - mucin, glycolipid và glycoprotein 'khác' [1].51.2.2. Monosaccharide – cấu trúc cơ bản của carbohydrateMonosaccharide là dạng cơ bản nhất và đơn giản nhất của carbohydrate,có công thức phân tử là (CH2O)n với n nằm trong khoảng từ 3-9. Cácmonosaccharide chính là đơn vị cấu trúc nên các oligosaccharide vàpolysaccharide. Monosaccharide cơ bản là một carbohydrate đơn giản 6 carbonnhư glucose (hình 1). Glucose không tích điện hay bị ion hóa nên được gọi làmột đường trung tính. Ngoài ra còn có các đường trung tính khác như: mannose,galactose và fructose, chúng là các monosaccgaride có trong tự nhiên ở dạng tựdo và đóng vai trò vô cùng quan trọng đối với sự sống.Monosaccharide có hai dạng đồng phân quang học là dạng D và L do vịtrí của các nguyên tử carbon không đối xứng trong phân tử, tuy nhiênmonosaccharide cấu hình D lại chiếm đại đa số trong tự nhiên.Hình 1.1. Cấu trúc của β-D-glucose.Sự có mặt số lượng lớn các nhóm hydroxyl (-OH) trong cấu trúc củacác monosaccharide làm cho chúng hầu hết có khả năng hòa tan vô cùng tốttrong nước. Các monosaccharide có trong mô bệnh phẩm sẽ bị mất đi trongquá trình cố định do kích thước nhỏ và khả năng hòa tan tốt trong nước củachúng. Vì vậy, các monosaccharide khó được phát hiện bởi hầu hết các kỹthuật hóa mô. Tuy nhiên, monosaccharide là cấu trúc cơ bản của cáccarbohydrate phức tạp hơn, chính vì vậy mà các tính chất hóa học, vật lý vàđặc đính của các polysaccharide và glycoconjugate được xác định bởi cácmonosaccharide cấu thành cũng như các nhóm phản ứng trong phân tử6monosaccharide [1].1.2.3. PolysaccharideLà một trong các chất phổ biến nhất trong cuộc sống. Đối với cơ thểsống polysaccharid có chức năng tạo năng lượng và làm cấu trúc nền tảng chothành phần của nhiều tế bào. Trong thành phần của polysaccharide có rấtnhiều các monosaccharide, các monosaccharide này được liên kết với nhaubởi các liên kết đồng hóa trị được gọi là liên kết glycosidic (hình 2).Hình 1.2. Hai đơn vị glucose liên kết với nhau bởi liên kết α1-4 glycosidic.Liên kết α1-4 glycosidic giữa các đơn vị glucose là mối liên kết chủ yếutrong tinh bột và glycogen. Ngoài ra, một số các đơn vị glucose của cácpolysaccharide có thể tham gia nhiều hơn một mối liên kết glycosidic, do đótạo thành cấu trúc phân nhánh. Cả glycogen và tinh bột đều bao gồm các đơnvị glucose với liên kết α1-4 và α1-6 glycosidic, chỉ khác nhau về kích thướcvà cấu trúc phân nhánh.1.3. GlycogenGlycogen là một polysaccharide đơn giản bao gồm các chuỗi phânnhánh hoặc chuỗi thẳng mà các đơn vị cấu tạo là D-glucose liên kết với nhaubởi liên kết α1-4 và α1-6 glycosidic. Glycogen chỉ có ở các loài động vật cũngnhư con người mà không có ở thực vật. Glycogen là dạng dự trữ năng lượngchính của cơ thể người. Carbohydrate được hấp thụ sau bữa ăn được chuyểnđổi thành glycogen bởi các tế bào gan của gan. Khi đói hay khi lượng glucosetrong máu giảm nhanh do hoạt động quá mức, glycogen được chuyển hóathành các đơn vị glucose có thể được sử dụng như một nguồn năng lượng7ngay lập tức cung cấp cho cơ thể.Glycogen được phân bố rộng khắp cơ thể, được tìm thấy với số lượnglớn nhất trong: gan, cơ tim và cơ xương, nang lông, tuyến nội mạc tử cung,âm đạo và biểu mô vảy cổ tử cung [3]. Glycogen có thể có ý nghĩa chẩn đoántrong một số loại khối u bao gồm ung thư biểu mô, u trung biểu mô và ungthư mô liên kết cơ vân. Sự phân phối bình thường glycogen có thể bị giánđoạn trong các bệnh gây ra bởi sự thiếu hụt enzyme chuyển hóa carbohydratenhư bệnh von Gierke và bệnh Pompe hay sự tích lũy bất thường glycogentrong mô của bệnh nhân mắc bệnh tích lũy glycogen cũng rất có giá trị.Glycogen có thể được nhìn thấy bằng kính hiển vi điện tử dưới hai hìnhthức chủ yếu:- Alpha: nhìn thấy như hình hoa thị hoặc cụm hạt beta đường kínhkhoảng 60-250nm.- Beta: nhìn thấy những hạt tự do hoặc là một phần của một hình hoathị và có đường kính 20-40nm.Ngoài ra còn có loại thứ ba, hay gamma, hình thức đã được mô tả tronggan chuột và là một glycogen không hạt được tìm thấy giữa hạt beta trong hoahồng alpha. Glycogen gamma chỉ nhìn thấy khi kali ferixianua được kết hợp vàomột tetroxide cố định osmium, người ta cho rằng một hợp chất được hình thànhlà giảm phản ứng với các nhóm hydroxyl của glycogen [2].1.4. Chất nhầyChất nhầy là thành phần chủ yếu của carbohydrate có trong mô, cònđược gọi là mucopolysaccharide, glycosaminoglycan và mucosubtance. Gầnđây, tên glycocojugate được đề nghị là tên chung thay thế cho những tên gọitrước đó.Chất nhầy giống như các proteoglycan, bao gồm chuỗi polysaccharideđồng hóa trị liên kết với một lõi protein thông qua một liên kết O-glycosidic.8Trong cấu trúc của chất nhầy còn có sự góp mặt của các acid hexuronic xen kẽvới hexsoamin, acid sialic hoặc các gốc sulfate, carboxyl. Các nhóm hexose tựdo thường có sẵn cùng với các tính chất nửa acid, sự biểu hiện của các loạinày sẽ ảnh hưởng rõ rệt đến phản ứng hóa mô. Carbohydrate có thể chiếm tới90% trọng lượng phân tử của chất nhầy.Chức năng của chất nhầy còn chưa được tìm hiểu hết, phụ thuộc vàocác vị trí mô của tế bào chế nhầy cũng như các loại . Được tiết ra bởi nhiềuloại tế bào biểu mô và mô liên kết, chúng có chức năng như một chất bôi trơn,hỗ trợ kết dính tế bào hoặc bảo vệ và hình thành một môi trường thích hợpcho sự khuếch tán các phân tử và ion.Trong chẩn đoán, phát hiện sự có mặt của chất nhầy có giá trị trongviệc xác định các khối u ác tính. Ngoài ra, việc xác định loại chất nhầy (trungtính hay acid) có thể hữu ích trong việc đánh giá những thay đổi trong một môung thư. Các phát hiện của acid hoặc sulfomucin trong niêm mạc dạ dày cóthể hỗ trợ trong việc phát hiện và mô tả đặc điểm của dị sản ruột, tổn thươngliên quan đến ung thư dạ dày. Chất nhầy được sản xuất bởi nhiều khối u baogồm ung thư biểu mô, liposarcoma và u trung biểu mô. Sự bất thường của hệthống sản xuất chất nhầy cũng được tìm thấy trong các bệnh gây ra bởi sựthiếu hụt enzyme (bệnh Hurler, bệnh Schele, bệnh Hunter) [3].Phân loại chất nhầyChất nhầy được phân thành hai loại lớn bao gồm chất nhầy trung tínhvà chất nhầy acid. Có rất nhiều kiểu phụ của chất nhầy acid dựa trên nguồngốc (biểu mô, mô liên kết) và cấu trúc phân tử (nhóm sulfate, carboxyl).1.4.1. Chất nhầy trung tínhChất nhầy trung tính bao gồm các nhóm hexosamine liên kết với cácnhóm hexose tự do. Các mucin trung tính có chứa một hàm lượng cao của9monosacaride nguyên hiện như mannose, galactose, và galactosamine. Cótrong biểu mô và phong phú nhất trong tuyến Brunner của tá tràng và biểu môniêm mạc dạ dày. Chất nhầy trung tính thường được tìm thấy với nhiều mứcđộ khác nhau trong phần lớn các tế bào hình đài tế bào tiết hình trụ trong biểumô đường hô hấp và tiêu hóa và tuyến tiền liệt [2]. Với sự có mặt của sốlượng lớn các monosacaride nguyên liệu, chất nhầy trung tính dễ dàng đượcphát hiện bởi kỹ thuật nhuộm PAS.1.4.2. Chất nhầy acida.Chất nhầy sulfate mạnh- Chất nhầy mô liên kết sulfate mạnh:Chất nhầy này phản ứng tại giá trị pH thấp với các thuốc nhuộm cationthích hợp và âm tính với PAS thông thường. Có nhiều tế bào sản xuất ranhững chất nhầy sulfate này, là các nguyên bào sợi, tế bào nội mô, tế bàoxương, tế bào sụn và các dưỡng bào, tế bào hình chén của đường ruột.- Chất nhầy biểu mô sulfate mạnh:Loại này được phân biệt bởi nguồn gốc biểu mô. Chất nhầy biểu môsulfate mạnh được tìm thấy trong những tuyến thanh dịch của phế quản và cóthể có một phần nhỏ trong tế bào hình chén của đường ruột. Về mặt hóa mô,nó phản ứng ở nồng độ pH thấp với những thuốc nhuộm cation tương tự nhưnhững chất nhầy sulfat của mô liên kết.b.Chất nhầy sulfate yếuChất nhầy này thuộc loại biểu mô, gồm các este sulfate polysaccharide,trong đó các gốc sulfate tự do được liên kết với những hexosamine khác nhaunhư glucosamine. Các nhóm sulfate không điển hình về hóa mô. Chúng đượcphân bố rộng trong mô, thường xuất hiện trong những tế bào hình chén củađại tràng. Các chất nhầy sulfate yếu khác loại sulfate mạnh ở phản ứng tại độpH cao hơn với thuốc nhuộm cation.c.Carboxylate Sialomucin10Enzyme-labile: đây là một chất nhầy có nguồn gốc biểu mô, cấu trúcbao gồm nhóm N-acetyl. Tên gọi ‘Enzyme-labile’ bởi thực tế N-acetylsialomucins bị phân cắt bởi enzyme sialidase (không bền). Được phân bốrộng trong cơ thể (tuyến dưới niêm mạc phế quản, tuyến nước bọt dưới hàm,các tế bào hình chén của ruột non) ở dạng đơn hoặc ở dạng hỗn hợp với cácdạng chất nhầy khác (bao gồm cả chất nhầy acid và trung tính). Được pháthiện bởi kỹ thuật nhuộm PAS.Emzym-resistant: enzyme này không bị phân cắt bởi enzyme sialidase(bền) và âm tính với PAS. Chúng được tìm thấy trong niêm mạc của ruột già,dạ dày và phế quản.d.Sulfate sialomucinĐây là chất nhầy gặp nhiều trong mô liên kết, có cấu trúc bao gồm cácnhóm carboxylate, acid uronic không sulfate hóa.Kỹ thuật PAS có khả năng phát hiện được chất nhầy trung tính và Nacetyl sialomucin dựa trên khả năng phản ứng của nhóm hexose trong phân tửcarbohydrate. Các chất nhầy còn lại không được phát hiện bởi kỹ thuật PAS làdo sự có mặt của các nhóm chức khác (sulfate, carboxyl, O-acetyl…). Sự cómặt của nhóm sulfate khiến chất nhầy phản ứng ở giá trị pH thấp, âm tính vớikỹ thuật PAS thường sử dụng. Nhóm O-acetyl khóa các nhóm hydroxyl lâncận, bất hoạt các nhóm hydroxyl nên không được oxy hóa bởi acid periodic,âm tính với PAS [2].1.5. NấmVi nấm kí sinh là sinh vật có cấu tạo đơn bào hoặc đa bào có nhân thực,có khả năng xâm nhập vào mọi tổ chức trong cơ thể để gây bệnh. Có baonang, lớp vách dày cấu tạo bởi polysaccharide.Trên tiêu bản mô bệnh học, có thể quan sát được hình thái và kích thướccủa nấm. Đánh giá mô học là một cách nhanh chóng và dễ dàng để xác địnhvà chẩn đoán bệnh do nấm gây ra. Sự có mặt của nấm trong mô là một bằngchứng rõ ràng của nhiễm trùng xâm lấn.11Kỹ thuật nhuộm HE là một kỹ thuật nhuộm linh hoạt cho phép quan sátvà đánh giá nhiều yếu tố trong tế bào và mô. Giúp phát hiện sự có mặt củanấm hay nhân của các tế bào giống nấm men. Tuy nhiên, nếu chỉ sử dụng kỹthuật nhuộm HE để chẩn đoán nấm thì còn nhiều hạn chế, khó phân biệt cácnấm bắt màu nhẹ với các thành phần trong mô, kể cả ở độ phóng đại cao hơn.Khi mật độ nấm có mặt trong mô thấp, nấm có thể bị bỏ qua trong tiêu bảnnhuộm HE do sự tương phản thấp giữa nấm và các thành phần trong mô. Cácđặc điểm hình thái không thực sự rõ ràng, đôi khi có thể gây hiểu lầm. Vì vậy,cần có các kỹ thuật nhuộm đặc biệt cho nấm. Hầu hết các loại nấm đều có thểphát hiện bởi các kỹ thuật như Grocott’s Methenamine Silver (GMS) hayPeriodic Acid Schiff (PAS).Kỹ thuật GMS được ưu tiên trong sàng lọc nhờ sự bắt màu cho độtương phản tốt giữa nấm và các thành phần khác trong mô, nhuộm cả phầnnấm thoái hóa và không quan sát được ở hai kỹ thuật PAS và nhuộm nấmcủa Gridley. Tuy nhiên, kỹ thuật GMS không cho phép quan sắc tố tự nhiêncủa nấm, vì vậy không thể kết luận đó là một loại nấm có sắc tố hay khôngcó sắc tố. GMS là một kỹ thuật tương đối phức tạp, cho kết quả không ổnđịnh, thách thức ngay cả những kỹ huật viên giàu kinh nghiệm [4].Kỹ thuật nhuộm PAS có thể phát hiện được nấm và nha bào nấm, trongkhi đó trên tiêu bản nhuộm HE khó quan sát được, đồng thời cũng không chegiấu màu tự nhiên của nấm, cho thấy đáp ứng viêm khi nhiễm nấm – kỹ thuậtGMS không đáp ứng được. Hơn nữa, kỹ thuật PAS còn thể hiện hình thái nấmtốt hơn, và cũng không quá phức tạp để nhuộm, cũng cho kết quả nhanhchóng và ổn định hơn kỹ thuât GMS. Với những ưu điểm của mình, kỹ thuậtPAS được sử dụng trong sàng lọc nấm. Một số loài nấm thông thường dươngtính với kỹ thuật nhuộm PAS bao gồm Candida albicans, Histoplasmacapsulatum, Cryptococcus, và Blastomyces [5].12CHƯƠNG 2KỸ THUẬT NHUỘM PERIODIC ACID SCHIFFKỹ thuật nhuộm PAS được sử dụng lần đầu tiên bởi McManus năm1946 để phát hiện sự có mặt của chất nhầy. Tuy nhiên, nhiều công trìnhnghiên cứu sau đó đã cho thấy của kỹ thuật PAS còn rất hữu ích trong sự pháthiện các phân tử có chứa carbohydrate khác như là glycogen và đặc biệt là cácglycoprotein. Phản ứng PAS dương tính với nhiều loại mô và tế bào khácnhau trong cơ thể, như: glycolgen, tinh bột, chất nhầy (chất nhầy trung tính,sialomucin), màng đáy, nấm… Kỹ thuật nhuộm PAS được nghiên cứu vàhoàn thiện hơn theo thời gian, song hành cùng kỹ thuật nhuộm HE thườngquy cung cấp rất nhiều thông tin rất có giá trị trong chẩn đoán, giúp điều trị vàtiên lượng bệnh.2.1. Nguyên lý của phương pháp nhuộm PASSử dụng một tác nhân oxy hóa là acid periodic (HIO 4) để phá vỡ mốiliên kết của hai nguyên tử carbon trong một số nhóm hóa học: glycol 1-2,hydroxy-1 amino-2, hydroxy-1 alkylamino-2, và hydroxyl-1 ceto-2… cótrong các phân tử carbohydrate làm xuất hiện các nhóm chức aldehyde(-CHO) có khả năng hoạt động hóa học. Các nhóm aldehyde này được pháthiện nhờ phản ứng với thuốc thử Schiff (fuchsin basic không màu bởi acidsulfurous) tạo thành hợp chất có màu hồng cánh sen [6].2.2. Cơ chế phản ứng của kỹ thuật PASLà một kỹ thuật được sử dụng thường xuyên trong các labo giải phẫubệnh học, kỹ thuật PAS được xây dựng dựa trên cấu trúc của các đơn vịmonosaccharide tạo thành, đó là chuỗi phản ứng hóa học liên tiếp gồm haigiai đoạn kế tiếp nhau, xảy ra dưới tác dụng của acid periodic và thuốc thử13Schiff để tạo thành một sản phẩm cuối cùng có màu hồng cánh sen quan sátđược trên kính hiển vi.PolysaccharideHình 2.1. Chuỗi phản ứng trong kỹ thuật PAS.2.2.1. Phản ứng oxy hóa của acid periodicĐây là bước đầu tiên trong kỹ thuật PAS, sử dụng acid periodic nhưmột tác nhân oxy hóa nhằm mục đích phá vỡ liên kết giữa hai nguyên tửcarbon liền kề của một số nhóm hóa học có trong phân tử carbohydrate (cácnhóm glycol 1-2, hydroxyl-1 amino-2, hydroxyl-1 alkylamino-2 và hydroxyl1 ceto-2). Kết quả đạt được là sự xuất hiện của các nhóm aldehyde tự do cũngnhư phân cắt liên kết giữa hai nguyên tử carbon liền kề kể trên. Sự xuất hiệncủa các nhóm aldehyde là cơ sở cho phản ứng tiếp theo với thuốc thử Schiffđể nhận biết sự có mặt của carbohydrate. Mặt khác, với các tiểu phầnmonosacarit vắng mặt nhóm glycol 1-2 hoặc có chứa nhóm hydroxyl có liênquan đến một ester hoặc liên kết glycosidic không dễ bị oxy hóa bởi acidperiodic và do đó không thể được phát hiện bằng các kỹ thuật PAS.Hình 2.2. Acid periodic.14Hα-D-glucosedialdehydeHNH2hydroxy-1 amino-2dialdehydeHình 2.3. Quá trình oxy hóa của acid periodic.Trong quy trình kỹ thuật nhuộm PAS, acid periodic được sử dụng cónồng độ từ 0,5-1% với thời gian oxy hóa là từ 5-10 phút cho kết quả tối ưunhất. Acid periodic là tác nhân oxy hóa rất tối ưu trong sự phát hiện các nhóm1-2 glycol và nhiều cấu trúc mô học khác nhau. Sự tối ưu này do tính tính oxyhóa của acid periodic, chỉ oxy hóa các nhóm 1-2 glycol thành các nhómaldehyde mà không có sự oxy hóa quá mức thành các nhóm carboxyl làmgiảm lượng aldehyde được tạo thành – oxy hóa một nấc. Nên không gây hiệntượng âm tính giả do giảm số lượng nhóm aldehyde tạo thành.Mặc dù được sử dụng nhiều nhất và cho kết quả tối ưu nhất nhưng acidperiodic không phải là tác nhân oxy hóa duy nhất có thể sử dụng trong phảnứng này mà có thể sử dụng tác nhân oxy hóa khác như: acid cromic, kalipermanganate, acid performic, acid peracetic và chì tetracetate. Tuy nhiên, các15tác nhân oxy hóa này có tính oxy hóa quá mạnh nên ít được sử dụng. Nhưacid cromic sau khi phản ứng để bộc lộ các nhóm aldehyde sẽ tiếp tục oxyhóa chính các nhóm aldehyde vừa tạo ra thành các nhóm carboxylic – oxy hóahai nấc, nhóm carboxylic này không thể phát hiện được bằng phản ứng vớithuốc thử Schiff. Điều này sẽ dẫn tới trường hợp âm tính giả hay sự nhạt màugiả tạo do sụt giảm số lượng các nhóm aldehyde tạo thành, không phản ánhchính xác các thành phần của mô và gây khó khăn cho chẩn đoán [1].Tuy nhiên, trong trường hợp phát hiện sự có mặt của nấm còn sử dụngtác nhân oxy hóa khác. Nguyên nhân do sự bắt màu không đặc hiệu với nấmmà bắt màu với nhiều thành phần trong mô, vì vậy làm giảm sự tương phản vềmàu sắc giữa tế bào nấm và màu hồng của nền. Trong trường hợp này, acidcromic sẽ được sử dụng để oxy hóa. Sự oxy hóa quá mức của acid cromic cólợi trong sự phát hiện tế bào nấm. Acid cromic tiếp tục oxy hóa các nhómaldehyde được tạo thành thành các nhóm carboxylic, nhưng các tế bào nấmvới đặc điểm riêng với lớp vỏ rất dày cấu tạo bởi polysaccharide sẽ không bịoxy hóa hoàn toàn thành acid carboxylic vì vậy vẫn phát hiện được. Điều nàycho phép giảm cường độ nền, các thành phần dễ bị oxy hóa sẽ không bắt màu,giúp cho các loại nấm và các cấu trúc khác có thể xuất hiện nổi bật hơn do sựtương phản rõ rệt giữa các thành phần khác nhau có trong mô [7].2.2.2. Phản ứng hiện màu của thuốc thử SchiffSau khi các nhóm aldehyde được bộc lộ bởi quá trình oxy hóa của acidperiodic, cần có một quá trình tiếp theo là gắn màu cho các sản phẩm cónhóm aldehyde được tạo thành từ mô để quan sát trên kính hiển vi. Chất đượcsử dụng trong kỹ thuật nhuộm PAS là thuốc thử không màu Schiff. Thuốc thửSchiff cũng có khả năng phản ứng với các nhóm ceton, nhưng được bỏ quatrong thực tế.

Tài liệu liên quan

• CẤU TRÚC ĐỐNG VÀ CÁC ỨNG DỤNG.doc
  • 1
  • 960
  • 1