LY TRÍCH DNA BẰNG Bí Quyết CỘT SILICA — Vietsinhtech

hiện nay phương pháp ly trích DNA bằng bí quyết sử dụng cột silica đang tỏ ra cực kỳ điểm tốt chóng vánh và giản đơn hơn so với bí quyết tách chiết thủ công. hầu hết các cách ly trích DNA đều nhắm đến mục đích là giải phóng và tinh sạch DNA, trong các giải pháp thì cột silica đem lại sản phẩm sau ly trích đạt được độ tinh sạch cao.

quá trình ly trích DNA bằng cột silica.

quá trình ly trích phá màng.

mục đích của giai đoạn này là phá bỏ màng tế bào và màng nhân của tế bào vi sinh vật, giải phóng DNA/ RNA ra ko kể dung dịch tạo tiền để cho việc thu nhận và tinh sạch DNA. Việc ly trích sẽ tiêu dùng các loại hóa chất Có khả năng biến tính phá vỡ màng tế bào ưng chuẩn việc phá vỡ những cấu trúc đạm. những hóa chất ly trích có thành phần và nồng độ đệm ly giải biến đổi tùy theo mục đích tách chiết là ADN hoặc ARN, nhưng về căn bản đều chứa các muối chaotropic (guanidine HCL, guanidine thiocyanate, urea và lithium perchlorate) ở nồng độ cao, làm mất tính bền vững của link hydro, lực Van der Waals và các thúc đẩy kỵ nước. Do đặc tính này, những chất chaotropic có một số công dụng sau: Ly giải màng tế bào,

Biến tính đạm, ADN và các đại phân tử khác,

Bất hoạt nuclease,

tác động giai đoạn gắn acid nucleic vào silic.

bên cạnh đó, một số chất tẩy rửa (detergent) và enzyme (thường dùng là proteinkinase hoặc lysozyme) cũng được sử dụng nhằm tăng hiệu quả hòa tan đạm và giai đoạn ly giải.

Trong quy trình ly trích DNA plasmid, những chất chaotropic ko được thêm vào dung dịch ly giải với mục tiêu tách plasmid khỏi ADN hệ gen trước, tránh ví như cả plasmide và ADN hệ gen đều được giải phóng cùng một lúc vì rất khó để phân tích ADN mạch vòng nhỏ với ADN hệ gen có trọng lượng phân tử cao.

quá trình gắn cột.

Sau lúc biến tính phá vỡ cấu trúc tế bào, DNA/ RNA được giải phóng ra ngoài dung dịch, tiếp đó dung dịch này sẽ được di chuyển qua cột silica để những DNA/ RNA Có thể link với những hạt silica và được giữ lại, các thành phần khác sẽ đi qua và chuyển sang đáy tube từ đấy tách được DNA/ RNA ra khỏi dung dịch. Ở bước này những hóa chất theo bộ kit sẽ có nhiệm vụ là tăng cường ái lực giữa hạt silica và DNA/ RNA hỗ trợ quá trình gắn kết, song song có tách dụng rửa DNA/ RNA giúp loại bỏ các thành phần xác tế bào và hóa chất ly trích ở bước trước đó. Cồn thường được dùng để tăng năng lực gắn của acid nucleic vào silica, thường sử dụng là ethanol hoặc đôi lúc là isopropanol. Nồng độ cồn sẽ được tối ưu hóa để đảm bảo các DNA/ RNA ko bị tác động, quá phổ biến ethanol sẽ làm đứt gãy ADN, trái lại quá ít ethanol sẽ ko thể tương trợ cho quá trình rửa.

Rửa.

Đây là bước loại bỏ những thành phần còn sót lại từ quá trình ly trích như protein, polysaccharide, các loại vật chất nội bào nhằm đạt hiệu năng tách chiết và tinh sạch ADN/ ARN cao. Về căn bản có 2 phương pháp rửa mẫu.

(1) nếu mẫu chứa đa dạng protein và mẫu ly trích có màu (VD : gan, phân, lá cây…) bắt buộc tăng cường ly trích nhẹ với hóa chất ở nồng độ phải chăng.

(2) Mẫu ko chứa rộng rãi đạm như giai đoạn tách chiết ADN plasmid hoặc tinh sạch sản phẩm PCR, thì Có khả năng chỉ nên dùng ethanol để thực hành công đoạn rửa.

Sau khi rửa

thực hiện ly tâm làm khô cột nhằm loại ethanol. trường hợp cột lọc vẫn còn sót lại ethanol, chất này sẽ đi vào trong phản ứng PCR/ Real time PCR sau đó làm tác động đến hiệu năng phản ứng.

Ethanol còn sót lại trong mẫu tách chiết ko thể được nhận diện được ưng chuẩn Kết cục UV 280/260. bởi thế để kiểm tra ethanol còn sót lại là dịch DNA sau ly trích sẽ không đông đá hoàn toàn lúc bảo quản ở – 20oC.

\ Link: