Năm Bước Thiết Kế Và Tối ưu Hóa Phản ứng Real-time PCR Và One ...

One-step Multiplex RT-qPCR (RT-qPCR một bước đa mục tiêu) là kỹ thuật định lượng nhanh, trực tiếp nhiều mục tiêu khác nhau trong mẫu RNA chỉ với một phản ứng. Đây là phương pháp tiết kiệm chi phí, công sức và thời gian khi thực hiện xét nghiệm với mẫu RNA. Tuy nhiên, để đạt được kết quả tốt như mong đợi, phản ứng one-step multiplex RT-qPCR cần được thiết kế và tối ưu hóa một cách hợp lý. Nếu bạn đang loay hoay với công việc thiết kế và tối ưu hóa phản ứng Real-time PCR, hãy cùng chúng tôi tìm hiểu năm bước cần thiết để hoàn thiện một phản ứng One-step Multiplex RT-qPCR nhé!

Ưu điểm của phản ứng One-step Multiplex RT‑qPCR:

• Thu được nhiều dữ liệu từ một mẫu xét nghiệm
• Tăng cường công suất xét nghiệm
• Chuẩn hóa dữ liệu biểu hiện gen chính xác hơn
• Giảm số lần thao tác tay và thời gian
• Tiết kiệm chi phí

Các ứng dụng phổ biến của multiplex PCR:

• Phân tích biểu hiện gen (Gene expression analysis)
• Phát hiện virus/tác nhân gây bệnh (Virus/pathogen detection)
• Nghiên cứu chẩn đoán (Diagnostic research)
• Sàng lọc phân tử nhỏ (Small molecule screening)
• Phát triển thuốc (Drug discovery)
• Thử nghiệm liều lượng thuốc (Dosage experiments)
• Sàng lọc CRISPR (CRISPR screening)
• Nghiên cứu độc chất học (Toxicology studies)

Thiết kế và tối ưu hóa phản ứng Real-time PCR cho xét nghiệm

Để có một quy trình One-step Multiplex RT-qPCR thành công, không thể thiếu bước tối ưu hóa và đánh giá chính xác xét nghiệm. Động tác này tuy làm kéo dài thời gian xây dựng quy trình nhưng có tác dụng giảm thiểu việc tiêu tốn hóa chất, thiết bị, vật tư và mẫu thử về sau, cho ra kết quả tối ưu, tránh gây lãng phí. Tối ưu hóa phản ứng Real-time PCR còn đặc biệt quan trọng với những phòng thí nghiệm chỉ tập trung phân tích một số mục tiêu nhất định và sản phẩm tạo ra (từ phản ứng RT-qPCR) được dùng làm đầu vào cho nhiều thử nghiệm khác.

Chúng tôi đề xuất 5 bước cho quá trình tối ưu hóa phản ứng Real-time PCR và One-step Multiplex RT-qPCR như sau.

Hình 1. Năm bước cơ bản khi tối ưu hóa phản ứng Real-time PCR

1. Thiết kế mồi và mẫu dò cho phản ứng multiplex

- Tất cả mồi nên có cùng một giá trị Tm, với Tm thuộc khoảng 55-60°C.

- Tm của mẫu dò nên cao hơn Tm của cặp mồi tương ứng một khoảng 8-10°C.

- Sản phẩm nhân bản nên có độ dài 70-150 bp để đạt hiệu suất Real-time PCR tối ưu.

- Sàng lọc toàn bộ mồi để giảm tối thiểu khả năng tạo phân tử primer dimer.

- Tuân thủ các nguyên tắc thiết kế chung dành cho mồi PCR.

Khuyến cáo:

- Vì tất cả mồi và mẫu dò sẽ cùng tham gia vào một phản ứng nên điều quan trọng khi tối ưu hóa phản ứng Real-time PCR là phải đảm bảo những bộ mồi – mẫu dò nhân bản các mục tiêu khác nhau không thể bắt cặp với nhau.

- Sử dụng phần mềm hoặc công cụ thiết kế nguồn mở sẵn có (ví dụ: Primer3, Primer3Plus, Primer-BLAST) để thiết kế bộ mồi – mẫu dò tối ưu cho xét nghiệm đa mục tiêu.

- Một số nhà sản xuất oligo cũng cung cấp công cụ để thiết kế mồi và mẫu dò.

- Để quy trình tối ưu hóa phản ứng Real-time PCR đơn giản hơn có thể sử dụng mồi và mẫu dò được thiết kế sẵn (từ các nghiên cứu, bộ kit, panel của hãng sản xuất,...). PrimePCR Probe Assay for Gene Expression (Các xét nghiệm biểu hiện gene bằng mẫu dò PrimePCR) là một danh mục mồi và mẫu dò do Bio-Rad thiết kế và chọn lọc sẵn, có khả năng thực hiện phản ứng multiplex phát hiện nhiều gene mục tiêu đã được nghiên cứu.

2. Chọn chất phát huỳnh quang cho mẫu dò khi tối ưu hóa phản ứng Real-time PCR multiplex

- Chọn chất phát huỳnh quang thích hợp với thiết bị Real-time đang có. Tham khảo hướng dẫn sử dụng máy Real-time để biết danh sách các chất phát huỳnh quang có thể sử dụng. Một số thiết bị có khả năng hiệu chỉnh thêm chất phát huỳnh quang mới ngoài danh sách có sẵn.

- Chọn các chất phát huỳnh quang có khoảng bước sóng phát xạ ít chồng với nhau nhất để giảm thiểu hiện tượng nhiễu chéo tín hiệu giữa các kênh màu (cross-talking).

- Lưu ý đến đại lượng “cường độ tín hiệu huỳnh quang tổng” khi làm tối ưu hóa phản ứng Real-time PCR: nên sử dụng chất phát huỳnh quang sáng nhất (cường độ cao nhất) cho mẫu dò phát hiện mục tiêu có tỷ lệ thấp nhất trong mẫu. Điều này giúp giảm khả năng nhiễu chéo tín hiệu giữa các kênh màu và cải thiện tỷ số “tín hiệu/nhiễu” (signal to noise).

3. Đánh giá từng phản ứng singleplex trước khi tiến hành multiplex

Trước khi tiến hành tối ưu hóa phản ứng Real-time PCR đa mục tiêu (multiplex), cần kiểm tra khoảng động học và hiệu suất phản ứng của từng phản ứng đơn* (singleplex). Với mỗi bộ mồi – mẫu dò, dựng đường chuẩn bằng dãy nồng độ pha loãng của một mẫu đã biết nồng độ.

(* Phản ứng đơn bao gồm duy nhất một bộ mồi – mẫu dò phát hiện một mục tiêu)

Một số lưu ý khi đánh giá phản ứng Real-time PCR đơn:

- Sử dụng cùng một loại mẫu (RNA tinh sạch, RNA đã qua xử lý DNase, dịch ly giải tế bào hoặc các loại mẫu khác) và hóa chất phản ứng sẽ được sử dụng cho phản ứng multiplex.

- Điều chỉnh tỷ lệ mồi : mẫu dò để có được kết quả tối ưu dựa trên mức độ biểu hiện, bắt đầu từ tỷ lệ chuẩn 2:1. Đối với các mục tiêu chiếm tỷ lệ thấp trong mẫu, cần tăng tỷ số mồi : mẫu dò. Tỷ lệ 1:1 là phù hợp với các mục tiêu có tỷ lệ xuất hiện cao.

Một số tiêu chí về hiệu suất phản ứng cần đạt được:

- Hiệu suất của từng phản ứng singleplex phải nằm trong khoảng 90-105%

- Giá trị R2 của đường chuẩn phải > 0,980 hoặc giá trị r > |-0,990|

Nếu hiệu suất phản ứng đơn cho một hoặc nhiều mục tiêu không đáp ứng các tiêu chí trên, hãy tiến hành tối ưu hóa lại từng phản ứng theo cách tối ưu hóa phản ứng Real-time PCR truyền thống. Hãy tham khảo hướng dẫn thao tác qPCR tốt nhất của chúng tôi.

4. Đánh giá phản ứng multiplex

Các phản ứng đơn đã qua kiểm tra sẽ được gộp chung vào một phản ứng multiplex. Bước tiếp theo của quá trình tối ưu hóa phản ứng Real-time PCR này là thực hiện phản ứng multiplex để xác nhận khoảng động học và hiệu suất phản ứng vẫn được giữ nguyên như trong phản ứng singleplex.

- Chạy đồng thời phản ứng multiplex và các phản ứng singleplex trong một mẻ thí nghiệm.

- Tính giá trị ΔCq của từng mục tiêu từ giá trị Cq của phản ứng multiplex và singleplex.

(ΔCq = Cqmultiplex – Cqsingleplex)

- Nếu ΔCq < 1: không có sự thay đổi đáng kể về hiệu suất giữa phản ứng singleplex và multiplex. Xét nghiệm multiplex này có thể sử dụng được rồi!

- Nếu ΔCq > 1: có sự khác biệt đáng kể giữa phản ứng singleplex và multiplex. Bạn cần tiếp tục tối ưu hóa phản ứng multiplex (xem bước 5).

5. Tối ưu hóa phản ứng Real-time PCR multiplex (nếu cần)

Các mục tiêu trong cùng phản ứng multiplex RT-qPCR có thể cạnh tranh với nhau về hóa chất phản ứng như DNA polymerase hay dNTP. Những hoá chất này có nồng độ xác định và sẽ cạn kiệt dần sau từng chu kỳ PCR. Hiện tượng cạnh tranh có thể làm giảm khả năng phát hiện các mục tiêu có nồng độ thấp hoặc các mục tiêu không được nhân bản hiệu quả. Trong quá trình tối ưu hóa phản ứng Real-time PCR, việc tối ưu hóa nồng độ các thành phần phản ứng sẽ giúp giải quyết vấn đề này:

- Giảm nồng độ mồi của mục tiêu chiếm tỷ lệ cao trong mẫu để ép quá trình nhân bản mục tiêu này sớm đạt pha ổn định do cạn kiệt mồi.

- Tăng lượng DNA polymerase: một phản ứng multiplex thông thường cần một lượng enzyme tối thiểu gấp hai lần lượng sử dụng cho một phản ứng singleplex.

- Tăng lượng dNTP: việc nhân bản nhiều mục tiêu trong cùng phản ứng cần nhiều dNTP hơn.

- Tăng lượng ion Mg2+: lượng RNA, mồi, mẫu dò và dNTP xuất hiện nhiều hơn trong một phản ứng multiplex sẽ làm giảm nồng độ ion Mg2+ có trong dung dịch.

- Sử dụng loại supermix phù hợp cho phản ứng One-Step Multiplex RT-qPCR như Reliance One-Step Multiplex Supermix