Những ứng Dụng Của Kỹ Thuật Giải Trình Tự DNA Thế Hệ Mới Trên Máy ...

Giải trình tự DNA (DNA sequencing) hay giải trình tự Sanger là một phương pháp sinh học phân tử quan trọng nhất trong nghiên cứu các hệ thống sinh học hiện nay. Gần đây, kỹ thuật sequencing đã trở thành kỹ thuật pyrosequencing thế hệ mới với nhiều ưu thế nổi bật [15]. Kỹ thuật pyrosequencing được dựa trên nguyên tắc "giải trình tự chuỗi nucleotide bằng sự tổng hợp" (sequencing by synthesis) và được phát triển tại Viện Công nghệ Hoàng gia ( Stockholm, Thụy Điển) từ năm 1985 đến năm 1996. Kỹ thuật này phù hợp để phân tích trình tự DNA kích thước đến 200 bp, dựa vào việc đo các tín hiệu ánh sáng phát quang sinh học (bioluminescence) được tạo ra bởi sự giải phóng pyrophosphate (PPi) trong quá trình tổng hợp DNA theo một mẫu trình tự với sự tham gia của các deoxyribonucleotide triphosphate (dNTPs), mồi ủ (primer), sử dụng 4 enzyme đặc hiệu như DNA polymerase I, ATP sulfurylase, luciferase, apyrase và các cơ chất như adenosine 5’ phosphosulfate (APS), D-luciferin. Các tín hiệu ánh sáng phát ra khi sợi bổ sung mới được tổng hợp theo mẫu DNA được ghi lại bởi một hệ thống ghi hình (camera) hoặc bộ nhân quang (photomultiplier) [15]. Trình tự các nucleotide của mẫu DNA có thể được tách ra từ một chuỗi DNA mới được tổng hợp dựa trên nguyên tắc bắt cặp base của Watson- Crick, theo đó G nucleotide sẽ bắt cặp với C và T sẽ bắt cặp với A. Để phân tích sự methyl hóa của DNA (DNA methylation), pyrosequencing được thực hiện sau sự thay đổi bisulfit trước đó, trong đó chuyển đổi tất cả các dinucleotide CpG không bị methyl hóa (unmethylated CpG) cho TpG, trong khi các dinucleotide CpG bị methyl hóa vẫn không bị thay đổi [8] (xin xem hình 1).

Hình 1. Nguyên tắc của pyrosequencing và biểu đồ thể hiện. Vị trí T không xuất hiện trên biểu đồ chứng tỏ T bị xóa, chiều cao gấp đôi của đỉnh cho thấy có 2 nucleotid đi liền nhau

PyroMark Q24 sử dụng công nghệ pyrocequencing với nhiều cải tiến về kỹ thuật, phần mềm, hóa chất Qiagen kits, …cho phép phân tích các trình tự DNA có chiều dài từ ngắn đến trung bình, có khả năng phân tích 1-24 mẫu trong khoảng 15 đến 45 phút tùy thuộc chiều dài của đoạn gen, giúp phát hiện và định lượng trình tự tức thời (real time) sự bất thường các chuối nucleotide khác nhau, đặc biệt là sự methyl hóa ở các vị trí CpG và CpN, các loại đột biến thay thế nucleotide (substitution), xóa (deletion), chèn (insertion), dịch khung (franmeshifts), số bản copy của gen, có khả năng phát hiện nhiều loại virus, vi khuẩn và định type kháng thuốc. Kỹ thuật pyrosequencing có thể được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực sinh học như: phân tích các đột biến gen trong ung thư, bệnh di truyền, phân tích tính đa dạng gen, xác định type vi khuẩn, virus, nấm, nghiên cứu phát triển thuốc, đánh giá chất lượng nước và môi trường, pháp y, vệ sinh thực phẩm, ... Trong khuôn khổ bài báo này, để có thể phần nào giúp các thày thuốc ứng dụng pyrosequencing trong thực tế lâm sàng, chúng tôi chỉ xin trình bày những ứng dụng của kỹ thuật này trong y học lâm sàng, gồm: 1. Phát hiện các đột biến DNA trong ung thư Ung thư là một bệnh gây ra bởi những đột biến DNA dẫn đến sự tăng sinh tế bào một cách bất thường, cơ thể không thể kiểm soát được. Việc phát hiện các đột biến có liên quan đến ung thư cho phép đánh giá nguy cơ ung thư hoặc làm tăng hiệu quả của điều trị đích (target therapies) đối với ung thư. Hiện nay, kỹ thuật pyrosequencing cho phép phát hiện hàng ngàn đột biến ở các gen ung thư như: ALK, BRAF, EGFR, IDH1, IDH2, JAK2, KRAS, NPM1, NRAS, PIK3CA, MGMT, UGT1A1, BCR-ABL1, RUNX1-RUXN1T1, ETV6-RUNX1, CBFB-MYH11, MPL W515L/K, BAALC, CLLU1, MN1, RT, PML-RARA bcr1, PML-RARA bcr2, PML-RARA bcr3, WT1, …[1, 2, 3, 4, 9, 14, 16]. Đột biến gen BRAF có thể được phát hiện ở bệnh nhân bị ung thư tuyến giáp thể nhú (45%), bị u hắc tố (60-80%), bệnh bạch cầu tế bào tóc (100%), ung thư đại trực tràng (5-22%) hoặc bị ung thư phổi tế bào không nhỏ (1-3%). Đột biến gen BRAF cũng liên quan đến sự kháng đối với điều trị đích chống EGFR (anti-EGFR therapy) [1, 9]. Đột biến gen KRAS có thể được phát hiện ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng (40-50%) hoặc bị ung thư phổi tế bào không nhỏ (15-25%). Đột biến gen KRAS cũng liên quan đến sự kháng đối với điều trị đích chống EGFR [3]. Các đột biến gen BRAF và KRAS có thể được phát hiện ở bệnh nhân ung thư kháng với việc điều trị bằng các thuốc ức chế EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor). Đột biến gen EGFR có thể được phát hiện ở bệnh nhân ung thư phổi tế bào không nhỏ (35-50%), ung thư đại trực tràng (12%) hoặc ung thư thực quản (11%) [4]. Đột biến gen JAK2 có thể được phát hiện ở bệnh nhân bị chứng đa hồng cầu nguyên phát (Polycythemia vera, 65-97%), tăng tiểu cầu bản chất (Essential thrombocythemia, 35-57%) hoặc bị xơ hóa tủy xương (Myelofibrosis, 35-57%). Đột biến gen PIK3CA có thể được phát hiện ở bệnh nhân bị ung thư vú (18-40%), ung thư đại trực tràng (13-32%), ung thư dạ dày (7-25%), ung thư não (27%), ung thư phổi (1-3%) hoặc ung thư buồng trứng (9%). Đột biến gen PIK3CA cũng liên quan đến sự kháng đối với điều trị đích chống EGFR: đột biến trên exon 20 làm mất tác dụng của thuốc cetoximab. Đột biến gen NPM1 có thể được phát hiện ở bệnh nhân bị bệnh bạch cầu tủy bào cấp (Acute myeloid leukemia, 15%). Các đột biến gen BCRA1 và BCRA2 có thể giúp sàng lọc nguy cơ phát triển ung thư vú hoặc ung thư buồng trứng [11]. 2. Chẩn đoán bệnh não và thần kinh Thoái hóa thần kinh được đặc trưng bởi sự rối loạn chức năng và sự chết của các tế bào của hệ thần kinh. Điều này dẫn đến suy giảm chức năng vận động và mất trí nhớ. Bệnh thoái hóa thần kinh bao gồm bệnh prion (nhiễm các tiểu phần prion của bò điên), bệnh Parkinson, bệnh Huntington, teo cơ Lateral Sclerosis và các loại bệnh mất trí nhớ, trong đó bệnh Alzheimer là phổ biến nhất. Một số đột biến gen được xác nhận có liên quan đến bệnh Alzheimer, nhiều kiểu gen và biểu hiện gen đang được nghiên cứu nhằm làm sáng tỏ nguyên nhân, giúp chẩn đoán và phát triển các loại thuốc có hiệu lực. Một số nghiên cứu gần đây cho thấy bệnh Alzheimer có thể liên quan đến sự đột biến xảy ra ở một trong số 3 gen: APP, PSEN 1 và PSEN 2. Hiện nay, một số đột biến DNA khác có liên quan đến bệnh lý thần kinh cũng đã được phát hiện, chẳng hạn, các đột biến gen IDH1 và IDH2 có thể được phát hiện ở bệnh nhân bị các bệnh não như u thần kinh đệm (Gliomas, 70-76%) hoặc bị bệnh bạch. cầu tủy bào cấp (Acute myeloid leukemia, 6-23%) [2]. 3. Chẩn đoán bệnh di truyền Các rối loạn di truyền là khá hiếm. Một rối loạn di truyền có thể hoặc không thể thừa kế. Một số rối loạn di truyền được truyền từ gen của cha mẹ, nhưng các rối loạn khác hầu như luôn gây nên bởi các đột biến mới hoặc do những thay đổi của DNA. Hiện nay, kỹ thuật pyrosequencing cho phép phát hiện nhiều bệnh di truyền, chẳng hạn, có thể phát hiện các đột biến điểm (point mutations) của DNA ty thể (mtDNA) trong các bệnh di truyền sau: bệnh thần kinh quang di truyền Leber (Leber's hereditary optical neuropathy: LHON) với các đột biến G3460A, G11778A và T14484C; bệnh não cơ ty thể với sự nhiễm acid lactic và các cơn giống đột quỵ (mitochondrial encephalopathy with lactic acidosis and stroke-like episodes: MELAS) với đột biến A3243G; động kinh rung giật cơ với các sợi đỏ (myoclonus epilepsy with ragged red fibers MERRF) với đột biến A8344G và bệnh yếu cơ thần kinh, mất điều hòa và viêm võng mạc sắc tố (neurogenic muscle weakness, ataxia, and retinitis pigmentosa: NARP)/ Leighs với đột biến đột biến T8993G/C, ...[17].

4. Xác định type và các allel kháng nguyên bạch cầu người HLA có liên quan đến bệnh Hệ thống kháng nguyên bạch cầu người (human leukocyte dantigen: HLA) là tên vị trí (locus) của các gen mã hóa cho phức hợp hòa hợp mô chủ yếu (major histocompatibility complex: MHC) ở người. Hệ thống HLA gồm vài trăm gen nằm ở nhiễm sắc thể số 6, mã hóa cho nhiều protein quan trọng của hệ thống miễn dịch. Hệ thống kháng nguyên HLA xác định các tế bào của một cá thể (của bản thân: self), phân biệt với các cá thể khác có HLA khác (không phải của bản thân: non-self). Hai nhóm HLA chính là kháng nguyện loại I và loại II, có các vai trò miễn dịch khác nhau. HLA loại I có trên bề mặt của hầu hết các tế bào có nhân của cơ thể, chúng gắn với các peptide được cắt ra từ các kháng nguyên được tạo ra trong tế bào, các kháng nguyên này có thể là các protein của cơ thể hoặc của các virus hay vi khuẩn nội bào. Ba gene HLA-A, -B và -C mỗi gene mã hóa một chuỗi α của MHC loại I (tương ứng với các phân tử HLA-A, -B và -C). HLA loại II chỉ có trên một số loại tế bào của hệ miễn dịch như các tế bào trình diện kháng nguyên chuyên nghiệp (đại thực bào, …) hoặc các lympho B, đã hoạt hóa. Các tế bào này thực bào các kháng nguyên, "chế biến" chúng thành các đoạn peptide trước khi gắn với HLA loại II rồi thể hiện trên màng tế bào. Các gene HLA-D mã hóa cho các chuỗi α và β của HLA loại II. Cấu trúc của HLA-D đa dạng hơn của các gene thuộc HLA loại I, gồm các locus HLA-DR, -DQ, -DP. Cho đến nay, người ta đã phát hiện hơn 500 bệnh có liên quan đến hệ kháng nguyên HLA, trong đó khoảng 50 bệnh có liên quan chặt chẽ với các allele của hệ kháng nguyên HLA. Hiện nay, pyrosequencing cho phép xác định chính xác type và các allele của các kháng nguyên HLA có liên quan đến nhiều bệnh lý của người [6].

5. Chẩn đoán nhiễm virus, vi khuẩn và nấm

Kỹ thuật pyrosequencing có thể giúp phát hiện để chẩn đoán nhiễm các loại virus như: phát hiện các đột biến kháng thuốc của virus viêm gan B (HBV) [18], xác định genotype (genotyping) virus viêm gan C (HCV) [5], xác đinh type HIV (human immunodeficiency virus)[13], nhiễm cúm A, cúm A H5, nhiễm Chlamedia trachomatis, nhiễm HPV (human papillomavirus) [7], SARS (severe acute respiratory syndrome), EBV, thủy đậu (VZV: varicella zoster virus), CMV (cytomegalovirus), HSV (herpes simplex virus), phát hiện nhiễm vi khuẩn Helicobacter pylori (Hp) [12], sự kháng thuốc của vi khuẩn lao [10], ký sinh trùng sốt rét, phát hiện nhiễm các loại nấm C. albicans, C. glabrata, C. tropicalis, …[8].

KẾT LUẬN

Kỹ thuật giải trình tự DNA thế hệ mới (pyrosequencing) với nhiều ưu điểm vượt trội, có nhiều ứng dụng trong 5 lĩnh vực y học lâm sàng như sau: - Phát hiện nhiều đột biến DNA có liên quan đến nhiều loại ung thư, từ đó giúp chẩn đoán nguy cơ mắc bệnh, tiên lượng và điều trị đích ung thư. - Chẩn đoán một số bệnh não và thần kinh. - Chẩn đoán nhiều bệnh di truyền. - Xác định type và các allel kháng nguyên bạch cầu người HLA có liên quan đến bệnh lý, góp phần chẩn đoán nguy cơ mắc bệnh, đánh giá và tiên lượng khả năng ghép tạng. - Phát hiện sự nhiễm và định type nhiều loại virus, vi khuẩn, ký sinh trùng và nấm.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1.Borras E, Jurado I, Herman I, et al. Clinical pharmacogenomic testing of KRAS, BRAF and EGFR mutations by high resolution melting analysis and ultra-deep pyrosequencing. BMC Cancer 2011; 11: 406-430. 2.Cykowki MD, Allen RA, Fung KM, et al. Pyrosequencing of IDH1 and IDH2 mutations in brain tumors and non-neoplastic conditions. Diagn Mol Path 2012; 21(4): 214-220. 3.Dobre M, Comanescu M, Arsene D, Iosif C, Bussolati G. K-ras gene mutation status in colorectal cancer: comparative analysis of pyrosequencing and PCR-RFLP. Rom J Morphol Embryol 2013; 54(3): 567-574. 4.Dufort S, Richard MJ, Lantuejoul S, de Fraipont F. Pyrosequencing, a method approved to detect the two major EGFR mutations for anti EGFR therapy in NSCLC. J Exp Clin Cancer 2011; 30: 57-71. 5.Elahi E, Pourmand N, Chaung R, et al. Determination of hepatitis C virus genotype by Pyrosequencing. J Virol Methods 2003; 109(2): 171-176. 6.Entz P, Toliat MR, Hampe J, et al. New strategies for efficient typing of HLA class-II loci DQB1 and DRB1 by using Pyrosequencing. Tissue Antigens 2005; 65(1): 67-80. 7.Gharizadeh B, Kalantari, Garcia CA, et al. Typing of human papillomavirus by pyrosequencing. Lab Invest 2001; 81(5): 673-679. 8.Gharizadeh B, Ghaderi M, and Nyren P. Pyrosequensing technology for short DNA sequencing and whole genome sequencing. Technology 2007: 47: 129-132. 9.Guedes JG, Veiga I, Rocha P, et al. High resolution melting analysis of KRAS, BRAF and PIK3CA in KRAS exon 2 wild-type metastatic colorectal cancer. MBC Cancer 2013; 13: 169-178. 10.Jureen P, Engstrand L, and Hoffner SE. Rapid Detection of Rifampin Resistance inMycobacterium tuberculosis by Pyrosequencing Technology. J Clin Microbiol 2006; 44(6): 1925-1929. 11.Michils G, Hollants S, Dehaspe L, et al. Molecular analysis of the breast cancer genes BRCA1 and BRCA2 using amplicon-based massive parallel pyrosequencing. J Mol Diagn 2012; 14(6): 623-630. 12.Monstein H, Nikpour-Badr S, and Jonasson J. Rapid molecular identification and subtyping of Helicobacter pylori by pyrosequencing of the 16S rDNA variable V1and V3 regions. FEMS Microbiol Lett 2001; 199(1): 103-107. 13.O’Meara D, Wilbe K, Leitner T, et al. Monitoring resistance to human immunodeficiency virus type 1 protease inhibitors by pyrosequencing. J Clin Microbiol 2001; 39(2): 464-473. 14.Quintás-Cardama A, Cortes J. Therapeutic Options Against BCR-ABL1T315I-Positive Chronic Myelogenous Leukemia. Clin Cancer Res 2008; 14(14): 4392-4399. 15.Ronaghi M. Pyrosequencing sheds light on DNA sequencing. Genome Research 2001; 11: 3-11. 16.Saeki M, Saito Y, jinno H, et al. Comprehensive UGT1A1 genotyping in a Japanese population by pyrosequencing. Clinical Chemistry 2003; 49(7): 1182-1185. 17.White HE, Durton VJ, Seller A, et al. Accurate detection and quantitation of heteroplasmic mitochondrial point mutations by pyrosequencing. Genet Test 2005; 9(3): 190-199. 18.Yang ZJ, Tu MZ, Liu J, Wang XL, Jin HZ. Comparison of amplicon-sequencing, pyrosequencing and real-time PCR for detection of YMDD mutants in patients with chronic hepatitis B. World J gastroenterol 2006; 12(44): 7192-7196. * Hiện nay, kỹ thuật giải trình tự DNA thế hệ mới PyroMark Q24 đã được triển khai và sử dụng hàng ngày tại Bệnh viện Đa khoa MEDLATEC.