Nhuộm Gram: Nguyên Lý Phương Pháp, Thủ Tục Thực Hiện Và Kết Quả

Mục lục

Toggle

• Nguyên lý của phương pháp nhuộm Gram.
• Dụng cụ, thiết bị cần thiết.
• Vật liệu, hoá chất nhuộm Gram.
• Các bước tiến hành nhuộm Gram.
  • Bước 1, Dàn tiêu bản và cố định tiêu bản:
  • Bước 2, Nhuộm màu:
  • Bước 3, Đọc kết quả:
• Giải thích tính bắt màu Gram của vi khuẩn.
• Những sai lầm gặp trong phương pháp nhuộm Gram.
• Các câu hỏi thường gặp về nhuộm gram.

Phương pháp nhuộm Gram (Gram Stain) là một xét nghiệm quan trọng nhất trong Vi sinh vật, được phát triển bởi bác sĩ Đan Mạch Hans Christian Gram năm 1884.

Nhuộm Gram vẫn là nền tảng của việc xác định & phân loại hầu hết các vi khuẩn. Trong các bệnh viện và phòng mạch lớn, xét nghiệm nhuộm gram thường áp dụng để chẩn đoán một số bệnh lây truyền qua đường tình dục và bệnh hoa liễu do vi khuẩn gây ra. Nội dung được tư vấn bởi bác sĩ Phòng khám Phú Cường.

Nguyên lý của phương pháp nhuộm Gram.

Dựa trên sự khác nhau về cấu trúc của vách tế bào vi khuẩn.

+ Vi khuẩn Gram dương (lớp dày peptidoglycan-90% thành tế bào) sẽ giữ được phức hợp tím gentians-iod không bị tẩy màu bởi alcohol.

+ Vi khuẩn Gram âm (lớp mỏng peptidoglycan-10% thành tế bào và hàm lượng lipit cao) không giữ được phức hợp tím gentians-iod.

Do vậy, kết quả sau khi nhuộm là vi khuẩn Gram dương vẫn giữ được màu tím của gentians, còn vi khuẩn Gram âm bắt màu hồng của fucshin.

Dụng cụ, thiết bị cần thiết.

Kính hiển vi, que cấy đầu tròn, đèn cồn, diêm, phiến kính (slide), chậu rửa, bình xịt nước cất và các dụng cụ cần thiết.

Vật liệu, hoá chất nhuộm Gram.

1. Bệnh phẩm hoặc hỗn dịch các vi khuẩn: Vi khuẩn Gram âm: vi khuẩn lậu, E.coli, Salmonella,..; Gram dương: S. aureus, Bacillus cereus; dịch cơ thể hoặc mẫu sinh thiết bị nghi ngờ nhiễm khuẩn.
2. Dung dịch tím gentians.
3. Dung dịch Lugol.
4. Dung dịch alcohol 90%.
5. Dung dịch fucshin kiềm.

Các bước tiến hành nhuộm Gram.

Bước 1, Dàn tiêu bản và cố định tiêu bản:

Dùng que cấy vô trùng lấy một ít vi khuẩn từ ống giống thạch nghiêng (hoặc dịch cơ thể, mẫu sinh thiết bị nghi ngờ nhiễm khuẩn) hoà vào 1 giọt nước muối sinh lý ở giữa phiến kính, để khô trong phòng thí nghiệm.

Cố định tiêu bản bằng cách hơ nhanh trên ngọn lửa đèn cồn 2-3 lần để gắn chặt vi khuẩn vào phiến kính.

Việc cố định nhằm 3 mục đích: giết chết vi khuẩn, gắn chặt vi khuẩn vào phiến kính và làm vết bôi bắt màu tốt hơn vì các tế bào chết bắt màu tốt hơn các tế bào sống.

Bước 2, Nhuộm màu:

– Thứ nhất, nhuộm bằng dung dịch tím gentians trong 30 giây đến 1 phút, rửa nước;

– Thứ hai, nhuộm thêm dung dịch lugol và giữ trong 1 phút, rửa nước;

– Thứ ba, khử màu: nhỏ dung dịch alcohol 90%, giữ khoảng 30 giây (cho đến khi vừa thấy mất màu), rửa nước;

– Thứ tư, nhuộm tiếp bằng dung dịch Fucshin trong 1 phút, rửa nước, để khô.

Bước 3, Đọc kết quả:

Quan sát ở vật kính dầu 100x. Nếu nhuộm đúng vi khuẩn Gram dương bắt màu tím, Gram âm bắt màu hồng.

Giải thích tính bắt màu Gram của vi khuẩn.

Vi khuẩn Gram dương có vách tế bào dày từ 15 đến 50 nm, dạng lưới, cấu tạo bởi peptidoglycan. Chất này có khả năng giữ phức hợp tím gentians – iod.

Trong khi đó, lớp vách tế bào peptidoglycan của các vi khuẩn Gram âm thì mỏng hơn và thường có thêm lớp màng lipopolysaccharde (LPS) bên ngoài.

Sơ đồ minh họa vách tế bào vi khuẩn Gram dương (trái) và Gram âm (phải) Sau khi nhuộm với phức hợp gentians – iod, mẫu được xử lí tiếp với hỗn hợp khử màu, làm mất nước của các lớp peptidoglycan trong vách tế bào Gram dương, từ đó làm giảm khoảng trống giữa các phân tử và khiến vách tế bào bắt giữ phức hợp gentians – iod bên trong tế bào.

Đối với vi khuẩn Gram âm, dung dịch alcohol 90% đóng vai trò là chất hoà tan lipit và làm tan màng ngoài của vách tế bào. Lớp peptidoglycan mỏng (chỉ khoảng 10 nm) không thể giữ lại phức hợp gentians – iod và tế bào Gram âm bị khử màu và bắt màu thuốc nhuộm bổ sung.

Những sai lầm gặp trong phương pháp nhuộm Gram.

– Có những sai lầm trong phương pháp nhuộm Gram làm cho vi khuẩn Gram dương nhuộm thành màu hồng của vi khuẩn Gram âm, đó là:

+ Phết vi khuẩn ở lứa cấy quá già (trên 24h), cấu trúc vách vi khuẩn gram dương không còn bền chặt như ở lứa cấy trẻ, do vậy mất khả năng ngăn cản sự tẩy màu của alcohol.

+ Dung dịch lugol không còn tốt, do đã pha quá lâu và mất đi iod. Trường hợp này nhận biết khi dung dịch lugol không còn sậm màu.

+ Tẩy màu bằng alcohol quá lâu đã làm cho vi khuẩn Gram dương cũng bị tẩy màu.

– Có những sai lầm trong phương pháp nhuộm Gram làm cho vi khuẩn Gram âm nhuộm thành màu tím của vi khuẩn Gram dương, đó là:

+ Phết vi khuẩn quá dầy làm cho alcohol không thể tẩy màu toàn bộ vi khuẩn trong phết nhuộm.

+ Tẩy màu bằng alcohol quá ngắn hay dung dịch alcohol bị pha quá loãng làm cho màu Gram không được tẩy khỏi tế bào vi khuẩn.

Các câu hỏi thường gặp về nhuộm gram.

Tại sao vi khuẩn không bắt màu đúng như theo lý thuyết?

Có nhiều nguyên nhân như kỹ thuật của các bước nhuộm làm chưa chính xác, chất lượng thuốc nhuộm kém, kính hiển vi bị mờ,…

Tại sao nhuộm xong vi khuẩn rất ít?

Có thể do bạn pha quá loãng. Hoặc do cố định tiêu bản chưa tốt, khiến vi khuẩn không dính vào tiêu bản, và dễ bị rửa trôi.

5/5 - (4 bình chọn) Bài viết có hữu ích cho bạn không?CóKhông