Phân Biệt Các Kĩ Thuật Xét Nghiệm PCR: RT-PCR, QPCR Và Những ...

PCR (hay là phản ứng tổng hợp chuỗi polymerase) là một kĩ thuật hiện đại, được ứng dụng rộng rãi trong Y khoa, như trong chuẩn đoán bệnh di truyền, bệnh do vi khuẩn, virus, ADN “dấu vân tay”, xác định huyết thống...

Nguyên lý hoạt động của PCR là tạo ra một lượng lớn các bản sao ADN từ một đoạn ADN chọn lọc, ở môi trường in vitro tương tự như trong quá trình phân bào, trong một thời gian ngắn. Lượng lớn ADN tạo thành được so sánh, đối chiếu với các mẫu chuẩn tại các ngân hàng dữ liệu ADN, các thông số, các đặc điểm chuẩn đã có sẵn để đưa ra kết quả.

Vậy, trong trường hợp vật chất di truyền không phải là ADN thì sao? Với những virus có vật chất di truyền là ARN, liệu có sử dụng được PRC không?

Để hiểu rõ vấn đề này chúng ta cần phân biệt được 2 kiểu phản ứng PCR:

• Phản ứng tổng hợp chuỗi polymerase thời gian thực (Real-time PCR), còn gọi là qPCR.
• Phản ứng tổng hợp chuỗi polymerase sao chép ngược (Reverse transcription PCR), gọi tắt là RT-PCR

1. Phản ứng tổng hợp chuỗi polymerase thời gian thực (qPCR)

qPCR là quá trình khuếch đại (sao chép) một đoạn ADN xác định lên hàng trăm nghìn lần, đủ để phân tích. Trước đó, các mẫu xét nghiệm được xử lý bằng hóa chất để tách chiết ADN từ mẫu đó.

qPCR, ngoài là "PCR định lượng", còn có nhiều các ứng dụng khác, tiêu biểu như:

• Phát hiện gene mục tiêu (Định tính). Kết quả có thể là Âm/Dương
• Xác định kiểu gene (genotype, týp) của gene mục tiêu. Kết quả trả ra là genotype A, B, C, v.v…,

Một số phản ứng khuếch đại ADN có bản chất là PCR, chúng đẳng nhiệt, nghĩa là chúng chạy ở một nhiệt độ không đổi. Và tiêu biểu nhất là khuếch đại phụ thuộc vào enzyme Helicase – một loại enzyme tháo xoắn - tương tự như PCR truyền thống, nhưng sử dụng nhiệt độ không đổi thay vì qua các bước tách chuỗi đôi ADN và phối hợp/mở rộng chuỗi bởi biến đổi nhiệt.

Hai phương pháp phổ biến để phát hiện các sản phẩm trong qPCR là sử dụng:

• Thuốc nhuộm huỳnh quang không đặc hiệu xen kẽ với bất kỳ ADN sợi kép.
• Đầu dò đặc hiệu gồm oligonucleotide được dán nhãn bằng máy phóng huỳnh quang.

2. Phản ứng tổng hợp chuỗi polymerase sao chép ngược (RT-PCR)

RT-PCR hiểu đơn giản là: đầu tiên cần sử dụng quá trình phiên mã ngược (tức chuyển ARN thành ADN lấy từ mẫu virus hay vi khuẩn có vật chất di truyền là ARN) để thu được ADN, sau đó dùng qPCR để khuếch đại ADN đó, đủ để phân tích. Quy trình RT-PCR thường cần khoảng 3h hoặc hơn.

Hình 1. RT-PCR và qPCR

RT-PCR có thể được tiến hành theo phương thức một bước và hai bước.

* RT-qPCR một bước, giai đoạn tổng hợp ADN (phiên mã ngược) và qPCR được tiến hành trong cùng một ống phản ứng bằng cùng một enzym. Phương thức này chỉ có thể sử dụng mồi đặc hiệu.

* RT-qPCR hai bước, giai đoạn tổng hợp ADN và qPCR được tiến hành trong hai ống phản ứng riêng biệt với enzym, đệm, thành phần và điều kiện phản ứng được tối ưu cho mỗi giai đoạn.

Hình 2. Sao chép ngược (RT-PCR) và tổng hợp ADN (qPCR)

Khuôn của RT-PCR là ARN, ARN này có thể nằm trong hỗn hợp ARN tổng số hoặc chỉ riêng mARN. Tách chiết ARN tổng số cần ít bước thực hiện hơn, giúp cho hiệu suất tách chiết cao hơn đồng thời thuận lợi hơn khi định mức lượng tế bào đầu vào. Ngoài ra, do không có bước làm giàu riêng mARN, sử dụng ARN tổng số không gây khác biệt trong hiệu suất tách chiết các loại mARN khác nhau. Những ưu thế trên đã giúp cho ARN tổng số được ưu tiên chọn làm vật liệu khởi đầu phù hợp cho RT-PCR hơn là mARN tinh sạch chỉ giúp phản ứng có độ nhạy cao hơn một chút.

Hình 3. Một số loại mồi dùng trong RT-PCR.

Mồi (Primer) phổ biến hay dùng trong RT-PCR là oligo dT và mồi ngẫu nhiên, nó sẽ liên kết bổ sung với khuôn ARN và làm điểm bắt đầu cho phản ứng tổng hợp ADN.

Enzym phiên mã ngược tiến hành phản ứng tổng hợp ADNc từ khuôn ARN. Một số enzym có hoạt tính RNAse cho phép phân hủy khuôn ARN sau khi đã tổng hợp ADN. Nếu enzym không có hoạt tính này, có thể cần bổ sung RNAse nhằm tăng hiệu quả của qPCR. Loại enzym phiên mã ngược thường dùng là enzym phiên mã ngược của virus ung thư bạch cầu chuột moloney (M-MLV) và virus cúm gia cầm (AMV). Tiêu chuẩn của một enzym phiên mã ngược lý tưởng cho phản ứng RT-PCR là có độ bền nhiệt tốt, cho phép tổng hợp hiệu quả ADN ở nhiệt độ cao trên những khuôn ARN có nhiều vùng cấu trúc bậc hai.

Cặp mồi lý tưởng cho phản ứng qPCR trong RT-PCR thường được thiết kế nằm trùm qua vị trí nối giữa hai exon. Một trong hai mồi sẽ nằm vắt ngang vị trí nối giữa 2 exon này, khiến cho mồi chỉ bắt cặp đặc hiệu với ADN mà không thể liên kết với ADN tổng số do ở ADN tổng số chứa intron nằm xen giữa các exon. Thiết kế này giúp loại bỏ nguy cơ khuếch đại nhầm ADN tổng số.

Nếu không thể thiết kế mồi chùm qua vị trí nối giữa exon hoặc nằm trên 2 exon được ngăn cách bới intron dài, cần phải xử lý mẫu ARN với enzyme RNAse-free ADNase I hoặc ds-ADNase để loại bỏ ADN tổng số.

Hình 4. Thiết kế đoạn mồi trong RT-PCR

Khác với các phương pháp PCR thông thường hay qPCR chỉ khuếch đại được ADN thì RT-PCR cho phép chúng ta xác định được cả những loại virus, vi khuẩn mang vật chất di truyền là ARN cũng như xác định được trình tự của một đoạn ARN bất kì nào đó một cách dễ dàng hơn.

Đây cũng là một trong những phương pháp được áp dụng nhiều nhất song song với test kháng thể (antibodies) để phục vụ cho truy vết và xét nghiệm một sô loại virus như Zika, HIV, sởi,... nói chung cũng như SARS-CoV-2 đang hoành hành gần đây nói riêng.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. ThS. BS. Vũ Thị Thúy Chi, Xét nghiệm PCR có những ưu – nhược điểm gì? Trung tâm Xét nghiệm, Bệnh viện Đa khoa MEDLATEC, 2019

2. Công ty TNHH Hamesco Việt Nam, Kĩ thuật Real-time PCR là gì? 2019.

3. RT-qPCR – Các nguyên lý cơ bản, Sinh học phân tử, Công nghệ sinh học, Dịch và tổng hợp từ Thermo ScientificBioMedia VN.

4. Nguyễn Thành Khôi, 4 Sự thật gây mất lòng về real-time PCR! Sinh học phân tử.

5. Xét Nghiệm SARS-CoV-2 / COVID-19, Bệnh viện Nguyễn Tri Phương.

6. Kỹ thuật Realtime PCR – đếm tải lượng virus, vi khuẩn, BioMedia, 2015.

7. TS.BS Trần Bá Thoại, Uỷ viên BCH Hội Nội tiết Việt Nam, Xét nghiệm PCR trong chẩn đoán Y khoa, Đại học Phan Châu Trinh

Người viết bài: SV. Vũ Hoài Hương Giang SV. Hoàng Quốc Cường

Hiệu đính: TS.DS. Ngô Thiện

=====

Để nhận tư vấn về sản phẩm và đặt hàng, vui lòng liên hệ: CÔNG TY CỔ PHẦN DƯỢC PHẨM FYKOFA Hotline: 1800 234 555 (Miễn phí) Email: info@fykofa.com Website: www.fykofa.com Fanpage: www.fb.com/duocphamFYKOFA