Polymerasa Chain Reaction (PCR) Và Các Thành Phần Của Phản ...

Lượt xem: 4.643

Polymerase Chain Reaction (PCR) là gì? Các bước của phản ứng PCR.

Phản ứng PCR hay còn gọi là “phản ứng khuếch đại gene”, là kỹ thuật phổ biến trong sinh học phân tử nhằm khuếch đại (tạo ra nhiều bản sao) từ một đoạn DNA mà không cần sử dụng các sinh vật sống.

• Phân tử DNA gồm 2 mạch đơn, được cấu thành bởi các nucleotide A, T, G, C và nối bằng các liên kết cộng hóa trị; 2 mạch đơn được bổ sung theo cấu trúc đối song song.
• PCR để nhận biết và phát hiện một đoạn gene cụ thể trong bộ gen (người, động vật, thực vật, vi khuẩn…)

Nồi hấp tiệt trùng – Thiết bị cần thiết trong phòng thí nghiệm

Phản ứng PCR bao gồm 3 bước chủ đạo:

• Biến tính (Denature DNA): DNA mạch đôi tách thành mạch đơn ( 94 – 96oC).
• Bắt cặp (Anneal primer): Nhiệt độ hạ xuống (50 – 65oC), các primer bám vào phân tử DNA, bản chất của primer là những đoạn DNA mạch đơn có chiều dài từ 15 – 30 nucleotide.
• Kéo dài (Extend primer): Nhiệt độ tối ưu để enzyme tổng hợp DNA mạch mới hoạt động (70 – 72oC) – Giai đoạn tối ưu để tổng hợp DNA mạch mới hoạt động.

Thành phần phản ứng PCR:

1. H2O (nuclear free water): Môi trường hoạt động cho các thành phần còn lại.

2. Dung dịch đệm (Buffer): Ổn định môi trường DNA polymerase, DNA và các nu.

• Chứa các loại muối:

+ 500mM KCl.

+ 100mM Tris-HCl, pH 8.3

+ Triton X-100/ Tween.

• Môi trường có lực ion giúp ổn định sự hoạt động của enzyme, cấu trúc DNA và các nucleotide.

3. Mạch khuôn DNA (DNA template):

• Chứa vùng gene cần nhân bản.
• Bất cứ loại DNA nào (có nguồn gốc từ động vật, thực vật, vi khuẩn…).
• Có thể được tinh sạch (thường là trong trường học) hoặc không. Đặc biệt với vi khuẩn: đun sôi dịch vi khuẩn để tế bào vỡ ra, DNA được giải phóng sau đó thực hiện PCR.
• Lưu ý: Dịch DNA đem PCR không nên chứa chất ức chế hoạt động của enzyme.

4. Primer (reverse, forward):

• Đặc hiệu cho 2 đầu đoạn gene cần khuếch đại.
• Nhiệt độ nóng chảy: phụ thuộc vào chiều dài mồi, thành phần G – C…
• Chiều dài: 15 – 30nt.

5. Nucleotide (nNTP: dATP, dTTP, dGTP, dCTP):

• Được lắp ráp trong quá trình kéo dài.
• Trữ ở 10mM, pH 7.0
• Nồng độ: 20 – 200uM.

6. Ion Mg2+ (Magnesium):

• Là Co-factor quan trọng của DNA polymerase -> Cần có ion này, enzyme mới hoạt động được.
• Lưu ý: + Nếu quá ít Mg2+: Enzyme không hoạt động; Nếu quá nhiều Mg2+: Phản ứng kém đặc hiệu.
• Nồng độ: 0,5 -> 3,5mM.

7. Enzyme DNA polymerase:

• Enzyme chịu nhiệt – Tổng hợp mạch DNA mới dựa trên mạch khuôn & primer. Taq hoặc tương tự Taq.
• Nồng độ: 1unit/1PƯ.
• Khi nhiệt độ tăng lên đến 95oC để tách mạch thì enzyme này vẫn giữ được hoạt tính. Thông thường, bản chất enzyme là protein, protein sẽ bị mất cấu trúc khi ở nhiệt độ quá cao; tuy nhiên đối với Taq và một số enzyme chịu nhiệt khác thì cấu trúc vẫn đảm bảo.
• Nhiệt độ hoạt động tối ưu (Khi Taq lắp ghép những nucleotide tự do ở môi trường vào mạch mới): 72o
• Chiều tổng hợp: 5’->3’.

Trộn các thành phần phản ứng PCR lại với nhau:

Cách 1: Trộn từng chất theo công thức (tổng V: 25 – 50ul)

• H2O, buffer, MgCl2, dNTP, Taq, Primer, DNA khuôn.

Cách 2: Mua thành phần được trộn sẵn Master Mix trộn với một số thành phần còn lại:

• Master Mix, Primer, H2O, DNA khuôn.

*Lưu ý: – DNA khuôn được cho vào cuối cùng khi mix các thành phần.

– Số lượng phản ứng nhiều thì Mix với số lượng lớn (nhân thể tích từng thành phần lên) trong các tube hay ống falcon sau đó chia nhỏ ra và cho DNA khuôn vào.

Để được tư vấn chi tiết về PCR cũng như các thành phần trong phản ứng PCR, quý anh chị vui lòng gửi thông tin về địa chỉ mail: info@visitech.vn hoặc liên hệ trực tiếp với chúng tôi qua hotline của Công ty TNHH Khoa Học Kỹ Thuật Việt Sinh.