Xemtailieu Tải về Phân lập và nghiên cứu một số đặc tính sinh học của vi khuẩn aeromonas hydrophila gây bệnh xuất huyết trên cá chép và biện pháp điều trị
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM PHẠM TUẤN ANH PHÂN LẬP VÀ NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VI KHUẨN AEROMONAS HYDROPHILA GÂY BỆNH XUẤT HUYẾT TRÊN CÁ CHÉP VÀ BIỆN PHÁP ĐIỀU TRỊ LUẬN VĂN THẠC SĨ THÚ Y THÁI NGUYÊN - 2016 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM PHẠM TUẤN ANH PHÂN LẬP VÀ NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VI KHUẨN AEROMONAS HYDROPHILA GÂY BỆNH XUẤT HUYẾT TRÊN CÁ CHÉP VÀ BIỆN PHÁP ĐIỀU TRỊ Chuyên ngành: Thú y Mã số: 60 64 01 01 LUẬN VĂN THẠC SĨ THÚ Y Người hướng dẫn khoa học: 1. GS.TS. NGUYỄN QUANG TUYÊN 2. PGS.TS. PHẠM THỊ TÂM THÁI NGUYÊN - 2016 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan rằng, số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là hoàn toàn trung thực và chưa từng được sử dụng để bảo vệ một học vị nào. Tôi xin cam đoan rằng, mọi sự giúp đỡ cho việc hoàn thành luận văn này đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong bài luận văn đều được ghi rõ nguồn gốc. Thái Nguyên, tháng 9 năm 2016 Tác giả Phạm Tuấn Anh Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn ii LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập và hoàn thành luận văn, với sự nỗ lực của bản thân, tôi đã nhận được sự giúp đỡ, hướng dẫn tận tình của nhiều cá nhân và tập thể. Tôi xin được đặc biệt bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và cảm ơn chân thành tới: Giảng viên hướng dẫn khoa học: GS.TS. Nguyễn Quang Tuyên, Đại học Nông Lâm Thái Nguyên và PGS.TS. Phạm Thị Tâm, Viện Đại học Mở Hà Nội đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tôi hết sức tận tình trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành Luận văn của mình. Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo, Ban chủ nhiệm khoa và các thầy cô giáo Khoa Chăn nuôi Thú y - Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy, cô giáo công tác tại Viện Đại học Mở Hà Nội và Viện Khoa học sự sống - Đại học Thái Nguyên đã giúp đỡ hoàn thành Luận văn này. Tôi cũng xin trân trọng cảm ơn lãnh đạo và cán bộ nhân viên các trạm Thú y Văn Quan, Cao Lộc và Đình Lập thuộc Chi cục Thú y tỉnh Lạng Sơn, đã giúp tôi trong quá trình thực hiện đề tài. Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc về sự ủng hộ, động viên, giúp đỡ của gia đình, bạn bè và đồng nghiệp trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành tốt luận văn này. Trong quá trình thực hiện luận văn không tránh khỏi thiếu sót. Kính mong được sự góp ý nhận xét của quý thầy cô để giúp Tôi có nhiều kinh nghiệm bổ ích cho công việc và cuộc sống sau này. Thái Nguyên, tháng 9 năm 2016 Tác giả Phạm Tuấn Anh Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ......................................................................................... i LỜI CẢM ƠN ............................................................................................. ii MỤC LỤC ................................................................................................. iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ............................................................. vi DANH MỤC CÁC BẢNG ......................................................................... vii DANH MỤC CÁC HÌNH, BIỂU ĐỒ ........................................................ viii MỞ ĐẦU.................................................................................................... 1 1. Tính cấp thiết của đề tài ........................................................................ 1 2. Mục đích của để tài ............................................................................... 2 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài .............................................. 3 Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................ 4 1.1. Tình hình bệnh do vi khuẩn A.hydrophila ......................................... 4 1.1.1. Tình hình trên thế giới ..................................................................... 4 1.1.2. Tình hình trong nước....................................................................... 4 1.2. Một số đặc điểm về vi khuẩn A. hydrophila, gây bệnh xuất huyết trên cá chép........................................................................................... 5 1.2.1. Đặc điểm vi khuẩn A. hydrophila ................................................... 5 1.2.2. Cơ chế gây bệnh .............................................................................. 8 1.3. Yếu tố độc tố và gen gây bệnh ........................................................... 9 1.4. Biểu hiện bệnh.................................................................................. 10 1.6. Mùa vụ xuất hiện bệnh ..................................................................... 13 1.7. Cơ chế tạo vacin phòng bệnh cho cá ................................................ 13 1.8. Điều trị bệnh xuất huyết ở cá do vi khuẩn A. hydrophila gây ra .... 13 1.8.1. Điều trị bằng kháng sinh ............................................................... 14 1.8.2. Sử dụng chất kích thích miễn dịch ................................................ 15 Chương 2: ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1. Đối tượng nghiên cứu....................................................................... 16 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn iv 2.2. Địa điểm nghiên cứu ........................................................................ 16 2.3. Thời gian thực hiện .......................................................................... 16 2.4. Nội dung ........................................................................................... 16 2.5. Vật liệu ............................................................................................. 16 2.5.1. Thiết bị và dụng cụ phòng thí nghiệm .......................................... 16 2.5.2.Môi trường và hóa chất .................................................................. 17 2.6. Phương pháp nghiên cứu .................................................................. 19 2.6.1. Phương pháp nghiên cứu dịch tễ ................................................... 19 2.6.2. Phân lập vi khuẩn A.hydrophila .................................................... 19 2.6.3. Phương pháp xác định một số đặc điểm sinh vật học của các chủng A.hydrophila phân lập được ........................................................ 21 2.6.4. Xác định các yếu tố của gây bệnh của các chủng vi khuẩn A. hydrophila phân lập được ........................................................... 24 2.6.5. Phương pháp xác định độc lực và khả năng gây bệnh của các chủng vi khuẩn A. hydrophila phân lập được ........................................ 26 2.6.6. Phương pháp tách độc tố ............................................................... 27 2.6.7. Phương pháp xác định khả năng mẫn cảm với kháng sinh của các chủng vi khuẩn A. hydrophila phân lập được ............................. 28 2.6.8. Phương pháp xử lí số liệu ............................................................. 28 Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ....................... 29 3.1. Kết quả điều tra tình hình dịch tễ bệnh xuất huyết trên cá chép tại 1 số điểm nuôi cá ở 1 số huyện của tỉnh Lạng Sơn ....................... 29 3.2. Kết quả phân lập vi khuẩn Aeromonas spp. gây bệnh trên cá chép 31 3.3. Kết quả xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp và khả năng gây dung huyết của vi khuẩn A. hydrophila ............................................... 38 3.3.1. Nhiệt độ và thời gian nuôi cấy ...................................................... 38 3.3.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian đến khả năng gây dung huyết thạch máu của vi khuẩn A. hydrophila ....................................... 41 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn v 3.3.3. Ảnh hưởng của độ pH đến khả sinh trưởng của vi khuẩn A. hydrophila ................................................................................................ 42 3.3.4. Ảnh hưởng của độ mặn (NaCl) đến khả sinh trưởng của vi khuẩn A. hydrophila ..................................................................................... 44 3.3.5. Kết quả xác định độc lực của các chủng A. hydrophila phân lập được trên động vật thí nghiệm ............................................................... 45 3.4. Kết quả xác định các gen độc tố của các chủng A. hydrophila gây bệnh cho cá chép .................................................................................... 47 3.5. Khả năng gây bệnh cho cá chép của chủng vi khuẩn phân lập ........ 48 3.5.1. Kết quả gây nhiễm cá bằng độc tố Aerolysin ............................... 49 3.5.2. Gây nhiễm bằng vi khuẩn ............................................................. 50 3.6. Kết quả xác định tính mẫn cảm với kháng sinh của các chủng vi khuẩn A. hydrophila phân lập được ........................................... 51 3.7. Kết quả điều trị thử nghiệm điều trị bằng kháng sinh...................... 54 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................. 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................... 59 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn vi DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT (-) : Âm tính (+) : Dương tính A. hydrophila : Aeromonas hydrophila ATC : Aerolysin Cytotoxic enterrotoxin BHI : Brain Heart Infusion BXH : Bệnh xuất huyết KIA : Kligler Iron Agar LB : Lysogeny Broth LPS : Lipopolysacharide Môi trường LB : Môi trường Luria-Bertani Môi trường TSA : Môi trường tryptone casein soy agar MRS : DE MAN, ROGOSA, SHARPE NF - Kb : Nuclear Factor-kappa B PBS : Phosphate buffer saline PCA : Plate count agar PCR : Polymerase Chain Reaction PE : Polyethylene TTSS : Type III secretion system VAC : Vườn ao chuồng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn vii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1. Điều tra tình hình cá mắc bệnh xuất huyết tại các ao nuôi ..... 30 Bảng 3.2. Kết quả phân lập vi khuẩn A. Hydrophila .............................. 33 Bảng 3.3. Một số đặc tính sinh vật học điển hình của vi khuẩn A. hydrophila phân lập được trên cá chép ................................. 35 Bảng 3.4: Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian đến khả năng sinh trưởng của vi khuẩn A. hydrophila chủng C5 .................................. 39 Bảng 3.5: Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian đến khả năng sinh trưởng của vi khuẩn A. hydrophila chủng C8 .................................. 40 Bảng 3.6. Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian đến khả năng gây dung huyết thạch máu của vi khuẩn A. hydrophila C5 và C8 ....... 41 Bảng 3.7. Ảnh hưởng của pH lên khả năng sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn ................................................................................. 43 Bảng 3.8. Ảnh hưởng của nồng độ muối lên khả năng sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn A. hydrophila........................................... 45 Bảng 3.9: Kết quả xác định độc lực của một số chủng vi khuẩn A. hydrophila trên chuột bạch ................................................... 46 Bảng 3.10. Đặc điểm hai cặp mồi sử dụng phát hiện các gen độc tố của vi khuẩn A. hydrophila gây bệnh trên cá chép.......................... 47 Bảng 3.11. Kết quả gây nhiễm vi khuẩn A. hydrophila Chủng …. (số cá gây nhiễm 30 con/một thí nghiệm về nồng độ ..................... 51 Bảng 3.12: Kết quả xác định tính mẫn cảm với kháng sinh của các chủng vi khuẩn A. hydrophila phân lập được .................................. 52 Bảng 3.13: Kết quả thực nghiệm phác đồ điều trị .................................. 54 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn viii DANH MỤC CÁC HÌNH, BIỂU ĐỒ Hình Hình 3.1: Mổ khám cá chép nghi nhiểm vi khuẩn A. hydrophila ......... 29 Hình 3.2. Hình thái khuẩn lạc vi khuẩn A. hydrophila mọc trên môi trường thạch máu .............................................................................. 33 Hình 3.3. Hình dạng vi khuẩn A. hydrophila ở vật kính 100X ............... 36 Hình 3.4. Kết quả phản ứng KIA trên thạch nghiêng của vi khuẩn A. hydrophila phân lập được .................................................. 37 Hình 3.5. Kết quả phản ứng sinh Indol của vi khuẩn A. hydrophila phân lập được................................................................................. 37 Hình 3.6: PCR phát hiện hai gen độc tố Aer và Hyl của vi khuẩn A. hydrophila 48 Hình 3.7: Hình ảnh kết tinh độc tố .......................................................... 49 Hình 3.8. Kết quả đánh giá tính mẫn cảm kháng sinh của vi khuẩn A. hydrophila phân lập từ cá chép bệnh ................................ 53 Biểu đồ Biểu đồ 3.1: Tỉ Lệ các ao có cá mắc bệnh tại 3 huyện của tỉnh Lạng Sơn .................................................................................... 31 Biểu đồ 3.2: Tỉ lệ phân lập vi khuẩn A. hydrophila từ các mẫu bệnh phẩm lấy tại Lạng Sơn ................................................................ 34 Biểu đồ 3.3: Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian đến khả năng sinh trưởng của vi khuẩn A. hydrophila chủng C5 .............................. 39 Biểu đồ 3.4: Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian đến khả năng sinh trưởng của vi khuẩn A. hydrophila chủng C8 .............................. 39 Biểu đồ 3.5. Ảnh hưởng của pH lên khả năng sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn A. hydrophila ..................................................... 43 Biều đồ 3.6. Ảnh hưởng của nồng độ muối lên khả năng sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn A. hydrophila............................... 44 Biểu đồ 3.7: Hiệu quả một số phác đồ điều trị bệnh xuất huyết trên cá chép nuôi tại tỉnh Lạng Sơn ...................................................... 56 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Ngành thủy sản Việt Nam được xem là một trong những ngành kinh tế mũi nhọn là ngành sản xuất hàng hóa lớn đi đầu trong hội nhập kinh tế quốc tế với kim ngạch xuất khẩu năm 2015 đạt 6,72 tỷ USD (Theo báo cáo tổng kết năm 2015 của Tổng cục Thủy sản). Với sự tăng trưởng nhanh và hiệu quả, thủy sản đã đóng góp tích cực trong chuyển đổi cơ cấu kinh tế nông nghiệp, nông thôn, đóng góp hiệu quả cho công cuộc xóa đói, giảm nghèo, giải quyết việc làm cho trên 4 triệu lao động, nâng cao đời sống cho cộng đồng dân cư khắp các vùng nông thôn, ven biển, đồng bằng, trung du, miền núi…, đồng thời góp phần quan trọng trong bảo vệ an ninh quốc phòng trên vùng biển đảo của Tổ quốc. Ở nước ta nghề nuôi trồng thuỷ sản nước ngọt đã có từ lâu đời, với nhiều đối tượng nuôi truyền thống được nuôi phổ biến như: cá trắm, cá trôi, cá mè, cá chép, cá rô phi,… cá chép là đối tượng nuôi quan trọng trong ao hồ, đầm, ruộng, lồng bè, là loài cá cho giá trị kinh tế cao, thịt cá thơm ngon được nhiều người nuôi và người tiêu dùng ưa thích. Cá có thể nuôi đơn hoặc nuôi ghép đều cho năng suất và hiệu quả rất cao. Người dân chủ yếu nuôi xen ghép các đối tượng này theo mô hình VAC hoặc nuôi lồng theo quy mô nhỏ để cung cấp nguồn thực phẩm trong gia đình hay trong một vùng nhỏ. Lạng Sơn có diện tích mặt nước tự nhiên là 8.545ha, trong đó có 1300 ha có thể sử dụng đưa vào nuôi trồng thủy sản. Có 03 hệ thống sông chính là: sông Kỳ Cùng, sông Thương, sông Ngắn Quảng Ninh; hệ thống các hồ đập được quan tâm đầu tư hiện trên địa bàn có 271 hồ chứa, 692 đập, 96 trạm bơm điện, bơm thủy luân và có khoảng 2.340 công trình tiểu thủy. Nghề nuôi trồng thủy sản của Lạng Sơn cũng nhờ đó mà ngày càng phát triển, theo số liệu của trung tâm thủy sản Lạng Sơn từ năm 2006 đến nay, diện tích nuôi trồng thủy sản được mở rộng, duy trì từ 900ha lên 1191ha, sản lượng thủy sản liên tục tăng, năm sau lớn hơn năm trước: năm 2006 là 1151 tấn; năm 2008 là 1136 tấn, năm 2013 là 1300 tấn, Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 2 năm 2015 là 1500 tấn. Giá trị sản xuất thủy sản hàng năm đều tăng: năm 2006 đạt 23.973 triệu đồng, 2007 đạt 27.506 triệu đồng, năm 2010 đạt 37.316 triệu đồng, năm 2013 đạt 43.340 triệu đồng, năm 2015 đạt 47.688 triệu đồng. Với các loại cá được nuôi chủ yếu là trắm cỏ, rô phi, chép lai… Cùng với sự tăng trưởng của ngành nuôi trồng thuỷ sản và nghề nuôi cá nước ngọt nói riêng, dịch bệnh trên cá ngày một gia tăng, ảnh hưởng lớn đến hiệu quả kinh tế, gây ô nhiễm môi trường, ảnh hưởng xấu tới sức khoẻ của người tiêu dùng. Có rất nhiều nguyên nhân gây bệnh trên cá, có thể do virut, vi khuẩn, ký sinh trùng. Trong đó, vi khuẩn là một trong những tác nhân gây bệnh khá quan trọng, là trở lực chủ yếu kìm hãm sự phát triển và mở rộng sản xuất trong nuôi trồng thủy sản. Hầu hết các vi khuẩn gây bệnh là một phần của hệ vi sinh vật bình thường trong môi trường (nước biển, ao , hồ, sông rạch) và nói chung các vi khuẩn này được xem là tác nhân gây bệnh thứ cấp hoặc tác nhân gây bệnh cơ hội. Trong các nghiên cứu về dịch bệnh trên cá, xác định được vi khuẩn gây bệnh chủ yếu là những vi khuẩn Gram âm như: A. hydrophila, A. sobria, Pseudomonas, Vibrio,… Vi khuẩn A. hydrophila là tác nhân gây bệnh xuất huyết đốm đỏ trên hầu hết các loài cá nuôi ở nước mặn, ngọt và lợ với tỷ lệ chết cao. Vấn đề đặt ra là, cần có sự hiểu biết về các đặc tính sinh học của vi khuẩn này để đưa ra các biện pháp ngăn ngừa tác hại của bệnh, vì vậy, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Phân lập và nghiên cứu một số đặc tính sinh học của vi khuẩn Aeromonas hydrophila gây bệnh xuất huyết trên cá chép và biện pháp điều trị” 2. Mục đích của để tài - Nắm được tình hình dịch tễ của bệnh xuất huyết trên cá chép do vi khuẩn A. hydrophila tại Lạng Sơn - Xác định một số đặc tính sinh học của vi khuẩn A. hydrophila gây bệnh trên cá chép Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 3 - Xây dựng biện pháp điều trị bệnh góp phần nâng cao hiệu quả nghề nuôi cá 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 3.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài - Bổ sung những hiểu biết khoa học cơ bản về đặc điểm dịch tễ học của bệnh xuất huyết trên cá chép. - Kết quả nghiên cứu của đề tài bổ sung thêm nguồn tư liệu cho những nghiên cứu về A. hydrophila trên cá chép nói riêng và trên thủy sản nói chung 3.2. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài - Kết quả là cơ sơ khoa học cho việc xây dựng các biện pháp phòng và điều trị bệnh xuất huyết trên cá chép. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 4 Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tình hình bệnh do vi khuẩn A.hydrophila 1.1.1. Tình hình trên thế giới Dịch bệnh do vi khuẩn Aeromonas spp di động đã xuất hiện rộng rãi và khá phổ biến vào thế kỷ XIX. Năm 1891, Sanarelli đã có nghiên cứu đầu tiên về sự bùng nổ dịch bệnh này ở cá chình. Ban đầu, nguyên nhân gây bệnh được phỏng đoán do các vi sinh vật gây ra hoặc do vi khuẩn Vibrio anguillarum. Sau đó, Schaperclaus (1929) [79] đã mô tả bệnh này xuất hiện ở cá chép với dấu hiệu bệnh lý là chứng sưng lên của bụng và ông phân lập được loài vi khuẩn gây bệnh là Bacterium punctatum. Trong khi đó, Toranzo và cs. (1989) [87] đã tìm thấy A. sobria khi dịch bệnh này bùng nổ trên cá Mòi dầu hay cá Hồi nước ngọt. Vào lúc đó, một hướng nghiên cứu khác đưa ra nguyên nhân chủ yếu gây bệnh phù trên cá chép được xem là do virus và vi khuẩn A. hydrophila (trước đây là B. punctatum) là tác nhân thứ cấp gây ra bệnh (Phạm Công Hoạt, 2012)[12]. 1.1.2. Tình hình trong nước Năm 972-1973, bệnh lở loét được phát hiện trên cá lóc ở An Giang và Đồng Tháp. Năm 1975, bệnh đốm đỏ đã thấy xuất hiện đầu tiên tại Đồng Bằng sông Cửu Long với mức độ nhẹ nhưng đến năm 1983 bệnh đã bùng nổ thành dịch bệnh lở loét. Dịch bệnh đã lan rộng khắp các vùng sông Tiền, sông Hậu, sông Đồng Nai, sông Sài Gòn với tỷ lệ cá bị nhiễm bệnh từ 60% - 70% (Đỗ Thị Hòa và Nguyễn Thị Muội, 2004) [10]. Từ năm 1986 đến 1997, bệnh xuất huyết đốm đỏ đã xuất hiện và bùng nổ trở thành dịch bệnh cho cá trắm cỏ nuôi lồng. Trong năm 1997, có khoảng 4.000 trong số 5.000 lồng nuôi cá trắm cỏ bị bệnh đốm đỏ gây thiệt hại khoảng 500.000 USD (Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản I., 1998, trích dẫn bởi www.fistenest.gov.vn cập nhật ngày 31/10/2008). Những thiệt hại này không Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 5 những ảnh hưởng trực tiếp đến đời sống của người dân mà còn để lại những hậu quả không nhỏ về kinh tế trong khu vực. Năm 1994 đến 1998, bệnh đã xuất hiện ở hầu hết các ao nuôi cá trắm cỏ bố mẹ, ao nuôi thương phẩm. Năm 1999 đến nay, dịch bệnh vẫn xảy ra hằng năm với mức độ khác nhau trên nhiều địa phương, gây thiệt hại nặng nề cho nghề nuôi cá trắm cỏ (Phạm Công Hoạt, 2012) [12]. Năm 1999-2001 nhóm tác giả Phan Thị Vân, Nguyễn Thị Hà, Kim Văn Vạn, Phạm Thị Yên, Trần Thị Kim Chi [33] thuộc Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản I đã tiến hành nghiên cứu xác định tác nhân gây bệnh đốm đỏ trên cá trắm cỏ với kết quả cho thấy A. hydrophila, A. caviae chính là tác nhân gây bệnh. Trước tình hình thời tiết đầu năm 2009 diễn biến phức tạp: nhiệt độ thấp cộng mưa phùn kéo dài là điều kiện thuận lợi cho nấm, vi khuẩn, một số vi sinh vật có hại ở đáy ao phát triển mạnh và xâm nhập vào mang, da, hệ tiêu hoá của cá để gây ra bệnh xuất huyết làm cá chết hàng loạt, tỷ lệ chết cao đặc biệt nguy hiểm đối với cá chép, cá thịt chiếm 30-70%, cá giống chiếm 100% (Phạm Minh Thành và Nguyễn Văn Kiểm 2009) [28]. 1.2. Một số đặc điểm về vi khuẩn A. hydrophila, gây bệnh xuất huyết trên cá chép * Phân loại vi khuẩn Aeromonas hydrophila: Ngành: Proteobacteria Lớp: Gammaproteobacteria Bộ: Aeromonadales Họ: Aeromonadaceae Giống: Aeromonas Loài: A. hydrophila 1.2.1. Đặc điểm vi khuẩn A. hydrophila A. hydrophila là vi khuẩn gây bệnh xuất huyết trên cá, còn có tên gọi khác là bệnh đốm đỏ, hoặc bệnh lở loét trên cá. Nó thường tìm thấy trong các khu vực có khí hậu ấm, ngoài ra chúng ta còn tìm thấy trong muối tươi, biển và Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 6 nơi cửa sông, được phân lập từ người và động vật. Vi khuẩn này có khả năng gây bệnh trên cá, người và động vật lưỡng cư như ếch, thằn lằn, cá sấu (Trust và cs., 1974) [88]. 1.2.1.1. Đặc điểm hình thái Nhận dạng về đặc điểm hình thái vi khuẩn A. hydrophila là rất cần thiết cho việc chuẩn đoán trong phòng thí nghiệm vì có sự khác biệt trong dịch tễ học, kháng sinh và tính nhạy cảm lâm sàng có thể có ý nghĩa giữa các loài. Ngoài ra đó còn là một điều cần thiết để biết được sự tiến hóa của các loài Aeromonas di động, có ý nghĩa trong quá trình tiến hóa của loài A. hydrophila thuộc nhóm vi khuẩn gram (-), thân thẳng, dạng hình que ngắn và kết thúc bằng hai đầu tròn, di động được nhờ có một tiên mao, không có khả năng hình thành bào tử. Vi khuẩn có kích thước 0,5 x 1- 1,5 μm. Chính nhờ cấu trúc của vi khuẩn như vậy, đã dẫn đến kết quả của những phản ứng sinh hóa, những phản ứng được thực hiện với mục đích giám định vi khuẩn mà ta đã tìm và phân lập được (Von Gravenitz và cs.,1968) [91]. Vi khuẩn A. hydrophila cũng giống như những vi khuẩn khác, trên mỗi môi trường nuôi cấy khác nhau sẽ có hình thái khuẩn lạc khác nhau, thể hiện đặc tính khác nhau (Boulanger và cs., 1977) [42]. Trên môi trường đặc hiệu - môi trường thạch máu có bổ sung kháng sinh ampicilin và máu cừu, khuẩn lạc mọc trên môi trường này có màu trắng đục, kích thước 0,5-1cm, có khả năng gây dung huyết trên thạch máu do cơ chế độc lực của nó, tạo aerolysin Cytotoxic enterrotoxin (ATC) phá hủy các tế bào hồng cầu tạo nên các vòng sáng trắng trên bề mặt thạch (kiểu dung huyết beta) hoặc vòng sáng có ánh xanh (kiểu dung huyết alpha). (Allan và cs., 1981) [37]. Còn trên môi trường Rimsof khuẩn lạc có màu vàng trên nền thạch xanh. Trên môi trường không đặc hiệu TSA, khuẩn lạc có màu vàng đục. Trên môi trường LB khuẩn lạc bóng, trong, có màu nâu nhạt (Baba và cs., 1988) [40]. 1.2.1.2. Đặc điểm sinh học Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 7 A. hydrophila là một trong 6 loài vi khuẩn gây bệnh nguy hiểm nhất trong họ Aeromonas di động, nó có thể tồn tại và phát triển trong bất cứ môi trường nào, dù đó là môi trường hiếu khí hay môi trường kị khí, có thể là môi trường nước ấm, môi trường nước lạnh. Đặc biệt loài này rất khó bị tiêu diệt, nó có thể chịu nhiệt rất cao, lên tới 42ºC. Mặc dù bệnh liên quan tới vi khuẩn A. hydrophila được nghiên cứu trong phòng thí nghiệm với những loài cá nuôi theo mô hình thâm canh trên quy mô công nghiệp, nhưng nó cũng có thể ảnh hưởng đến các loài cá nuôi trong tự nhiên ở các hồ, ao, và nó cư trú trong hệ đường ruột của cá khỏe mạnh (Trust và cs., 1974) [88]. Vi khuẩn này phổ biến hơn trong môi trường nuôi cá nước ngọt. Nó được tìm thấy cả trong tầng nước đứng và lớp trên cùng của lớp trầm tích. A. hydrophila có khả năng thích nghi với môi trường có biên độ về pH rộng, nhiệt độ, độ đục, và độ mặn cao (T. C. Hazen, 1979) [85]… Nhiệt độ tối ưu có thể phụ thuộc vào các chủng đặc trưng đã được nghiên cứu, nhưng thường là vào khoảng 25-35oC (Ventura và cs., 1987) [90]. Theo một số nghiên cứu cho thấy, vi khuẩn A. hydrophila có thể sống và phát triển ở nhiệt độ cao, lên tới 42ºC và ở nhiệt độ thấp như 4ºC nó cũng phát triển. Đây là loại vi khuẩn gây bệnh trên cá nước ngọt nhưng cũng có khả năng gây bệnh trên cá nước mặn và cá nuôi ở vùng nước lợ, do đó mà nó có thể tồn tại trong môi trường có pH 4,5 - 8,5, nồng độ muối là 0,5% - 5%. (Ventura và cs., 1988) [89]. 1.2.1.3. Đặc tính sinh hóa Davis và cs. (1981) [46] nghiên cứu hoạt tính enzym ngoại bào và thấy, chủng A. hydrophila có khả năng thủy phân tinh bột, casein, DNA, gelatin, tế bào máu, huyết thanh,…nhưng không thủy phân xenlulo và pectin. Nghiên cứu về đặc tính sinh hóa và đặc tính enzym của vi khuẩn thuộc họ Aeromonas nói chung và A. hydrophila nói riêng, các tác giả đã tìm ra rất nhiều phương pháp để đánh giá các chỉ tiêu này ví dụ như dùng các phản ứng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 8 sinh hóa có khả năng sử dụng đường, sinh khí hay phân giải protein…Một trong những mục đích của việc làm các phản ứng sinh hóa là để định danh và phân loại vi khuẩn. Các xét nghiệm sinh hóa này nhằm đánh giá khả năng lên men đường. phản ứng carbohydrates được thử nghiệm bao gồm gentobiose, glucamine, glucose1 - phosphat, glucose 6 -phosphate, Inulin, lactulose, Dlyxose, maltotriose, palatinose, se-doheptulose, stachyose, D-tagatose, và xylitol (Zhang và cs., 2000) [95]. 1.2.2. Cơ chế gây bệnh Có một số bằng chứng cho rằng loài vi khuẩn này có khả năng gây bệnh bởi một số protein ngoại bào như: aerolysin, lypase, chitinase, amylase, gelatinase, hemolysins, enterotoxin, caseinase, elastase, lecithinnase, deoxyribonuclease và protease cùng với các chất gây độc cho tế bào, độc tố đường ruột và chất làm tan máu. Khi tấn công vào cơ thể vật chủ, đầu tiên giống vi khuẩn gây bệnh này bám vào các tế bào hồng cầu, theo hệ thống tuần hoàn lây nhiễm trên toàn cơ thể cá. Vi khuẩn gây bệnh sẽ tiết ra enzyme gây rối loạn quá trình trao đổi chất của tế bào vật chủ. Tuy nhiên người ta vẫn chưa biết được cơ chế gây ra bệnh cụ thể. Gần đây, người ta đã đề xuất cơ chế gây bệnh TTSS (Type III secretion system), đã được chứng minh là đóng vai trò quan trọng trong việc gây ra bệnh của A. hydrophila. TTSS như là những chiếc máy chuyên tiết ra các protein độc rồi đưa trực tiếp vào tế bào vật chủ. Các yếu tố này làm phá vỡ tế bào chức năng của vật chủ theo cách có lợi cho sự xâm nhập của chúng. Trái ngược với cách tiết một cách bình thường thì hệ thống TTSS được kích hoạt khi tác nhân gây bệnh tiếp xúc với tế bào vật chủ. Độc tố ADPribosylation được tiết ra bởi một số vi khuẩn gây bệnh rồi di chuyển qua TTSS và đưa vào tế bào vật chủ dẫn đến sự gián đoạn của NK-kB, phá hoại các tế bào chủ chốt, gây hại cho cytoskeletal và apoptosis (Gado và cs., 1998) [54]. Do cấu trúc và đặc tính của vi khuẩn này phức tạp, khi cùng tồn tại với vi sinh vật nào đó hoặc khi xâm nhập vào tế bào vi sinh vật, vi khuẩn này sẽ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 9 gây hại cho vi sinh vật ấy. Khi vào cơ thể vật chủ, đầu tiên nó sẽ đi qua các mạch máu đến cơ quan đích đã xác định trước, như thận, tim, ruột, gan…rồi tiết độc tố aerolysin Cytotoxic enterrotoxin(ATC) có khả năng gây bệnh cho vật chủ. Aerolysin là một chất độc có khả năng gây hư hại tế bào. Vì vậy chúng được coi là tác nhân gây bệnh cơ hội, nghĩa là chúng chỉ lây nhiễm với những phản ứng miễn dịch bị suy yếu (Mishra và cs., 1998) [65]. 1.3. Yếu tố độc tố và gen gây bệnh Phát hiện các yếu tố độc tố là một phần quan trọng trong việc phát hiện khả năng sinh bệnh của vi khuẩn A. hydrophila. Có một số nghiên cứu cho rằng yếu tố gây bệnh là do các ngoại độc tố như độc tố đường ruột và các enzym ngoại bào như lipase và các protease. Nhưng kết quả phân tích do các phản ứng sinh hóa cho thấy không chính xác (Boulanger và cs., 1977) [42]. Vi khuẩn Aeromonas spp có một số độc tố như aerolysin, haemolytic, độc tố tế bào cytotoxic và độc tố đường ruột enterotoxic. Khi phân tích 15 mẫu cá đã thấy 6 mẫu chứa độc tố là của vi khuẩn A. hydrophila (40%) và được nuôi cấy trên môi trường MRS (Ventura và cs., 1988) [89]. Các phản ứng PCR xác định rõ ràng chủng A. hydrophila có khả năng sản xuất ra gen độc tố aerolysin và có thể đựơc ứng dụng trong các xét nghiệm độc tính đặc trưng cho các loài Aeromonas có khả năng gây dung huyết (T. C. Hazen, 1979) [85]. Gen độc tố aerolysin, được tạo ra bởi A. hydrophila là một protein ngoại bào tan trong nước, có khả năng gây dung huyết. Aerolysin liên kết với thụ thể SPE-cific glycoprotein trên bề mặt tế bào eukaryot. Các độc tố aerolysin hình thành lỗ đi qua màng tế bào vi khuẩn như một preprotoxin có chưa một vài peptit tín hiệu loại bỏ cotraslationally. Do đó protoxin là tiền thân của proaerolysin (là một protoxin không hoạt động), sau đó được kích hoạt bằng cách loại bỏ protein của khoảng 25 amino acid của nhóm cacboxy (Davis và cs., 1981) [46]. Các gen preproaerolysin được nhân đôi nhờ thể truyền E.coli, và từ đó ta xác định được trình tự của các Nucleotide. Mồi có bản chất là một oligonucleotide được sử dụng trong phản ứng PCR-để xác định trình tự Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 10 gen Aer có độ dài 209-bp. Mồi xuôi và mồi ngược được gọi là aerB và aerC. Các đoạn mồi được thiết kế bởi sự phân tích của máy tính, bằng các trình tự của gen Aer đã được công bố. Kết quả của PCR đã cho thấy có sự hoạt động của gen Aer trong chủng A. hydrophila gây dung huyết theo kiểu betahemolytic (Ventura và cs., 1988) [89]. 1.4. Biểu hiện bệnh A. hydrophila được coi là tác nhân thứ cấp gây bệnh xuất huyết. Gần đây Huizinga và cs. (1979) [55] xem xét lại nguyên nhân của bệnh xuất huyết và sự xuất hiện của vi khuẩn A. hydrophila 96% trong số cá bị tổn thương, những tổn thương bắt đầu bởi enzym của vi khuẩn phân giải gelatin. Tùy thuộc vào các yếu tố gây độc cũng như sức đề kháng của cá mà biểu hiện bệnh là khác nhau. Ngoài ra còn phụ thuộc vào sự có mặt hay vắng mặt của yếu tố nhiễm khuẩn hoặc nhiễm trùng huyết. Bệnh xuất hiện dưới hai thể, với các triệu chứng khác nhau: - Thể nhiễm trùng: thường xuất hiện trên cá chép, trắm cỏ, trê, tai tượng, ... Cá bệnh có dấu hiệu ban đầu là bơi không định hướng, tách đàn, kém ăn hoặc bỏ ăn, da cá bị sậm màu, cá bị mất nhớt do hệ enzym gelatinase thủy phân gelatin có trong vẩy cá và trở nên khô (còn gọi là bệnh tuột nhớt). Tỷ lệ chết ở thể nhiễm trùng máu đối với cá thịt từ 30-70% và có thể đến 100% đối với cá giống. - Thể nhiễm trùng toàn thân: các đốm đỏ xuất hiện trên thân cá, gốc vây, quanh miệng rồi biến thành vết loét ăn sâu vào bên trong, vây bị rách và dần dần cụt đi, bụng trướng to, xoang bụng bị viêm, chứa nhiều dịch nhầy có mùi hôi, xuất huyết nặng ở mô mỡ, tuyến sinh dục, ruột, dạ dày và bóng hơi, thuỷ tinh thể bị đục và lòi ra ngoài, túi mật sưng to, gan đổi sang màu xanh tái, ruột bị loét. Cơ quan thường bị ảnh hưởng bởi bệnh này bao gồm các mang, thận, gan, lá lách, tuyến tụy, và xương cơ bắp (Bach và cs., 1978) [41]. 1.5. Nguồn lây bệnh Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Tải về bản full