Phương Pháp Sắc Ký Lỏng Hiệu Năng Cao (HPLC) Trong Kiểm Nghiệm

Vấn đề kiểm tra, đảm bảo chất lượng của thuốc, thực phẩm chức năng ngày càng được coi trọng và luôn luôn được đặt lên hàng đầu. Một trong những phương pháp đắc lực, phổ biến để kiểm nghiệm dược phẩm được nhiều nhà khoa học sử dụng và áp dụng trên thế giới là “Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao” (High Performance Liquid Chromatography – HPLC). Sau đây, chúng tôi xin cung cấp cho quý độc giả những kiến thức về HPLC và những vai trò của phương pháp này trong việc kiểm nghiệm dược phẩm.

Lịch sử hình thành của phương pháp HPLC

Phương pháp sắc ký được nghiên cứu và tìm ra bởi một nhà thực vật học người Nga là Tswett từ đầu thế kỷ XX. Ông là người phát hiện ra có thể tách các chất có màu trong thành phần của dược liệu bằng cách rửa một mẫu bằng một dung môi thích hợp qua một ống thủy tinh có chứa chất hấp phụ.

Pha tĩnh được sử dụng trong thí nghiệm của ông là phấn bột và aluminia, pha động là một loại dung môi. Ông đưa pha tĩnh vào cột thủy tinh dài và đổ hỗn hợp bột màu thực vật, dung môi lên trên cột. Sau đó, ông tiếp tục đổ thêm dung môi vào cột cho đến khi các mẫu được rửa giải ở đáy cột. Kết quả là các dải màu khác nhau đã di chuyển với những tốc độ khác nhau và có thể thu thập các chất tinh khiết trong dược liệu ở đầu ra với dải màu tương ứng. Phương pháp phổ biến nhất là sắc ký cột với pha tĩnh là chất rắn có độ xốp cao được cho vào trong cột hình trụ còn pha động là chất lỏng, chất khí hoặc chất lỏng siêu tới hạn.

Đến những năm 60 của thế kỷ XX, phương pháp HPLC được xây dựng và phát triển dựa trên phương pháp sắc ký cột. Phương pháp này được đưa ra bởi một giáo sư người Mỹ – Csaba Horvath. Với sự vận dụng, nghiên cứu, cải tiến và phát triển liên tục của khoa học – kỹ thuật, HPLC ngày càng có đóng góp to lớn và được sử dụng rộng rãi trong phân tích dược phẩm.

Cơ chế hoạt động của phương pháp HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao còn được gọi với cái tên sắc ký lỏng áp suất cao (High – Pressure). Cơ chế hoạt động của phương pháp là dựa trên sự phân tách của các chất trong hai pha dưới áp suất cao: pha động và pha tĩnh. Dưới áp suất cao, pha động được dịch chuyển qua pha tĩnh và mang theo các thành phần hỗn hợp cần phân tách.

Pha tĩnh

Pha tĩnh được nhồi trong cột, thực hiện quá trình tách các chất phân tích.

Pha tĩnh là các chất rắn dưới dạng tiểu phân hoặc chất lỏng kết hợp với chất rắn.

Pha động

Pha động là chất lỏng hoặc chất khí thích hợp đảm bảo được yêu cầu phân tách. Yêu cầu quan trọng đối với pha động là cần phải trơ với pha tĩnh và bền vững trong quá trình chạy sắc ký. Đồng thời pha động phải có độ tinh khiết cao, hòa tan được mẫu cần phân tích, độ nhớt thấp và phù hợp với Detector.

Pha động bao gồm 2 loại: có độ phân cực cao và có độ phân cực thấp.

• Pha động có độ phân cực cao: chủ yếu là nước và kết hợp thêm các dung môi kém phân cực hơn để giảm độ phân cực như hỗn hợp Nước – Methanol, Nước – Acetonitrile….
• Pha động có độ phân cực thấp: bao gồm các dung môi hữu cơ ít phân cực như n-Hexan, Xiclopentan, 2-Clopropan, Toluen, Diclometan…. Người ta thường phối hợp nhiều loại dung môi để tăng khả năng rửa giải và phù hợp với quá trình phân tích. Đôi khi cũng có thể thay đổi thành phần pha động theo thời gian để tách các hỗn hợp phức tạp, gọi là rửa giải gradient nồng độ.

Phân loại phương pháp HPLC

Dựa vào cấu tạo của pha rắn, có thể chia HPLC thành 4 loại chính:

• Sắc ký hấp phụ hiệu năng cao. Sắc ký hấp phụ gồm 2 loại là pha thường (NP-HPLC) và pha đảo (RP-HPLC).
• Sắc ký trao đổi ion hiệu năng cao (IPE-HPLC) và cặp ion (IP-HPLC)
• Sắc ký phân bố hiệu năng cao (PC-HPLC).
• Sắc ký rây phân tử hiệu năng cao (GEL-HPLC hoặc F-HPLC).

Trong các phương pháp trên, phương pháp sắc ký lỏng phân bố là kỹ thuật được sử dụng nhiều nhất trong kiểm nghiệm Dược phẩm do có thể phân tách được nhiều hợp chất, từ không phân cực đến phân cực và cả những hợp chất ion có khối lượng phân tử nhỏ hơn 3000.

Đặc điểm	Sắc ký hấp phụ		Sắc ký ion	Sắc ký phân bố	Sắc ký rây phân tử
	Pha thường	Pha đảo
Pha tĩnh	phân cực, ái nước	không/ít phân cực	cấu tạo ion và bề mặt phân cực	Lỏng, không/ít phân cực	Cấu  tạo loại NP-HPLC và RP-HPLC
Pha động	dung môi không/ít phân cực, kị nước	dung môi phân cực và nước	nước, đệm pH, chất tạo phức	dung môi không/ít phân cực	dung môi hữu cơ
Cơ chế	hấp phụ		trao đổi ion	phân bố	sự rây theo độ lớn phân tử
Phạm vi	chất ít và không phân cực Thường là chất hữu cơ.	chất không phân cực và phân cực. Chất vô cơ, hữu cơ…	các dạng ion, phân ly thành ion. Chất vô cơ, hữu cơ	chất không phân cực, phân cực. Chất vô cơ, hữu cơ…	Các chất phân tử lớn, >1000 đvC Lĩnh vực polime
Ưu/ Nhược điểm	ảnh hưởng bởi độ ẩm	độ ổn định, lặp lại cao	độ ổn định, lặp lại tốt	độ ổn định, lặp lại kém

Bảng: So sánh các phương pháp sắc ký

Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình kiểm nghiệm bằng HPLC

Trong quá trình chạy sắc ký, có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả và độ chính xác của quá trình kiểm nghiệm. Các yếu tố ảnh hưởng cần được khảo sát và lựa chọn ra điều kiện phù hợp khi kiểm nghiệm bằng HPLC. Sau đây là một số yếu tố quan trọng như sau:

Ảnh hưởng của pha tĩnh, pha động

Pha tĩnh, pha động đóng vị trí quan trọng nhất trong quá trình sắc ký. Quá trình sắc ký có đảm bảo được diễn ra thuận lợi hay không phụ thuộc vào việc lựa chọn 2 pha thích hợp, phù hợp với chất cần phân tích. Sự ảnh hưởng của pha tĩnh, pha động đã được trình bày ở trên.

Ảnh hưởng của lực tương tác

Trong quá trình chạy sắc ký, xuất hiện 3 tương tác: chất phân tích – pha tĩnh, chất phân tích – pha động, pha tĩnh – pha động. Tổng các lực tương tác xuất hiện ở đây sẽ quyết định thời gian rửa giải và tách ra khỏi nhau của mỗi chất có trong mẫu cần phân tích:

• Chất có tổng lực tương tác nhỏ nhất sẽ được tách ra đầu tiên.
• Ngược lại, chất có tổng lực tương tác lớn nhất sẽ tách ra sau cùng.
• Những chất trong mẫu phân tích nếu có tổng lực tương tác bằng nhau hoặc xấp xỉ nhau thì không tách khỏi nhau được.

Ảnh hưởng mẫu phân tích

Thời gian lưu của một chất phụ thuộc rất nhiều vào cấu trúc của mẫu như loại cấu trúc, nhóm thế, độ lớn nhóm thế; cấu trúc, vị trí nhóm thế, số nhóm thế, các dị tố của phân tử chất tan.

Ảnh hưởng của thể tích nạp mẫu

Mẫu vào cột với thể tích nhỏ hơn thể tích giới hạn: lượng mẫu được nạp vào cột tăng thì chiều cao cột cũng tăng theo sự tuyến tính.

Mẫu nạp vào cột lớn hơn thể tích giới hạn:

• Chiều cao và lượng mẫu không có sự tuyến tính.
• Có thể ảnh hưởng tới độ phân giải và thời gian lưu.
• Chiều cao của đĩa H bị thay đổi.

Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nhiệt độ cũng ảnh hưởng đáng kể đến quá trình sắc ký tách các chất. Nếu tăng nhiệt độ trong một giới hạn nhất định thường tạo điều kiện tốt hơn cho quá trình sắc ký như:

• Tạo điều kiện có lợi cho hiệu lực cột nhờ làm giảm độ nhớt pha động.
• Thay đổi khả năng hấp phụ của pha tĩnh.
• Tăng độ tan của chất, ảnh hưởng đến quá trình chọn lọc của hệ.

Tuy nhiên không phải bất kỳ trường hợp nào khi tăng nhiệt độ mà tăng hiệu quả của quá trình sắc ký. Do đó cần khảo sát một nhiệt độ phù hợp.

Những ứng dụng của phương pháp HPLC trong kiểm nghiệm

Ứng dụng trong định tính, kiểm tra sự có mặt của một chất trong mẫu thử

HPLC được sử dụng để tách các thành phần để thực hiện quá trình phân tích sau đó.

Dựa vào hình ảnh sắc ký đồ, thời gian lưu trong cùng điều kiện sắc ký có thể xác định được sự có mặt của một chất trong mẫu phân tích

Ứng dụng để phân tích các chất trong mẫu

HPLC được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực để phân tích các thành phần có trong mẫu như:

• Phân tích các chất đa lượng là các chất độc hại, phụ gia, chất bảo quản, các vitamin, kháng sinh…. có trong thực phẩm, hóa chất, dược liệu,….
• Phân tích các chất vi lượng có trong thức ăn, đồ uống…
• Phân tích các độc tố sinh học, các mẫu sinh học.
• Phân tích các tạp chất, độc tố trong dược phẩm.
• Phân tích các chất gây ô nhiễm môi trường.

Ứng dụng trong điều chế, sản xuất

HPLC thường được áp dụng để tách chất và điều chế các chất có trong dược liệu.

Sử dụng để tách các tạp chất ra khỏi thuốc hoặc có thể tách protein ra khỏi các thành phần nội sinh trong các vật liệu sinh học.

Những lý do phương pháp HPLC được sử dụng rộng rãi trong kiểm nghiệm

Có khả năng phân tách được nhiều loại chất khác nhau, áp dụng được rộng rãi trong nhiều ngành và nhiều lĩnh vực.

Độ chọn lọc, độ nhạy, khả năng định lượng rất tốt với độ chính xác cao.

Tiện lợi, dễ sử dụng.

Thích hợp sử dụng với nhiều chất, đặc biết các chất có khả năng bay hơi kém hay các chất bị phân hủy ở nhiệt độ cao.

Cấu tạo của thiết bị HPLC

Cấu tạo chung của một thiết bị HPLC bao gồm 7 bộ phận:

Bình chứa dung môi pha động

Bình được làm bằng chất liệu trơ, thường là thủy tinh, có nắp bảo vệ và có lỗ hở. Ống dẫn dung môi từ bình vào bộ phận sắc ký..

Bơm cao áp

Bơm pha động đi qua pha tĩnh với vận tốc không đổi trong suất quá trình phân tách và tạo dòng chảy liên tục.

Áp suất: khoảng 3000-6000 PSI hoặc 250 đến -500at.

Lưu lượng: 0,1-9,999 ml/phút.

Bộ phận tiêm mẫu

Dùng để nạp thể tích mẫu tiêm vào trong cột.

Có 2 phương pháp để nạp mẫu là tiêm thủ công và tiêm mẫu tự động. Hiện nay, với sự phát triển hiện đại của khoa học công nghệ và máy móc nên phổ biến là hệ thống tiêm mẫu tự động được lập trình sẵn với thời gian và dung tích mẫu.

Cột sắc ký

Được chế tạo từ thép không gỉ, chiều dài từ 10 đến 30cm, đường kính từ 2 đến 5mm, hạt chất nạp khoảng 5-10m.

Chất nạp: silica gel, silica gel được bao trong lớp hữu cơ, nhôm oxyd, polime xốp, nhựa trao đổi ion…

Detector

Giúp phát hiện và đo các tín hiệu khi chất được phân tách ra khỏi cột và được thể hiện dưới dạng sắc ký đồ.

Một số loại Detector:

• Đầu dò hấp thu tia tử ngoại.
• Đầu dò mạng diode quang.
• Đầu dò phát huỳnh quang.
• Đầu dò chỉ số khúc xạ.
• Đầu dò đo độ dẫn điện.
• Đầu dò ampe kế.
• Đầu dò LC-IR.
• Đầu dò LC-MS.

Bộ phận ghi tín hiệu

Sử dụng để ghi các tín hiệu do Detector truyền sang. Có thể hiện và lưu tất cả các thông số như khối phổ, tính đối xứng, phân giải, thời gian lưu, diện tích Peak, chiều cao…

Bình thải

Chứa đựng nước được thải ra.

Tài liệu tham khảo

Bộ Y tế (2018), Dược Thư Quốc Gia Việt Nam, Nxb Y học, Hà Nội.

Bộ Y tế (2005), Kiểm nghiệm Dược phẩm, Nxb Y học, Hà Nội.

Jared L.Aderson et al (2015), Analytical Separation Science, 5 Volume Set.

High Performance Liquid Chromatography, Ngày đăng: 12 tháng 9 năm 2018. Truy cập ngày 22 tháng 12 năm 2021.