QUANG PHỔ HẤP THỤ PHÂN TỬ (UVVIS) - Tài Liệu Text - 123doc

Tải bản đầy đủ (.pdf) (29 trang)

1. Trang chủ
>>
2. Giáo án - Bài giảng
>>
3. Hóa học

QUANG PHỔ HẤP THỤ PHÂN TỬ (UVVIS)

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.47 MB, 29 trang )

QUANG PHỔ HẤP THỤ PHÂN TỬ (UV-VIS)I.-MỤC TIÊU HỌC TẬPTrình bày được khái niệm về quang phổ hấp thụ phân tử UV-VIS và địnhluật Lamber- Beer-Nêu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng hấp thụ UV-VIS , giải thích ảnhhưởng của các yếu tố này đến phổ của 1 chất-Trình bày các phương pháp định lượng bằng phổ UV-VIS-Nêu được các thành phần cấu tạo chính máy quang phổ UV-VIS-Ứng dụng của phổ UV-VIS: Đọc phổCác phương pháp phổ được ứng dụng rộng rãi để nghiên cứu các hợp chất hóahọc, quá trình phản ứng, ứng dụng trong kiểm nghiệm môi trường, trắc quan, kiểmnghiệm dược phẩm…Cơ sở của phương pháp phổ là quá trình tương tác của cácbức xạ điện từ đối với các phân tử vật chất. Khi tương tác với các bức xạ điện từ,các phân tử có cấu trúc khác nhau sẽ hấp thụ và phát xạ khác nhau. Kết quả của sựhấp thụ và phát xạ năng lượng này chính là phổ, từ phổ chúng ta có thể xác địnhngược lại cấu trúc phân tử.Có phương pháp phổ: Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử:+ Phổ hồng ngoại+ Phổ Raman+ Electron UV – VIS Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR Phương pháp phổ khối lượng1. Quang phổ hấp thụ tử ngoại khả kiển (UV-VIS)11.1. Vùng tử ngoại khả kiến (UV-VIS)- Vùng UV là vùng tử ngoại, có 2 loại:+ Vùng tử ngoại xa, bước sóng  < 200nm+ Vùng tử ngoại gần,  = 200 - 400nm- Vùng VIS là vùng ánh sáng mà ta nhìn thấy được,  = 400 - 800nm1.2. Sự xuất hiện của phổ hấp thụ phân tử UV-VIS- Phân tử, nhóm phân tử của các chất đều được cấu tạo từ các nguyên tử theo kiểuliên kết hoá học nhất định của các điện tử (electron) hoá trị của các nguyên tố. Cácelectron hoá trị khi đi vào phân tử hình thành liên kết  liên kết  và liên kếtphối trí. Nếu trong phân tử các chất có chứa dị tố (O, S, N) thì các nguyên tửnguyên tố này còn chứa 1, 2 đôi điện tử hoá trị chưa tham gia liên kết, ký hiệu làcặp electron n. Những đôi electron n này có thể cho phân tử cảu chất khác khitham gia phản ứng với chất cần đôi điện tử tạo ra liên kết bền.- Các phân tử, nhóm phân tử các chất khi ở điều kiện thường tồn tại ở trạng thái cơbản, trạng thái bền và nghèo năng lượng nhất (Eo). Khi bị kích thích các electronhoá trị trong các liên kết  và đôi điện tử n chuyển từ các obitan liên kết hoặckhông liên kết lên các obitan phản liên kết có mức năng lượng cao hơn EmBước chuyển dời năng lượng (nm)Năng lượng kích thích E (kcal/mol)→120230→160184n→180162n→28082-Hiệu 2 mức năng lượng cơ bản Eo và kích thích Em mà năng lượng phân tửhấp thụ từ nguồn sáng∆E (e) = Em - Eo = hc / 2EnSơ đồ dịch chuyển mức năng lượng của các electron-Ngoài năng lượng của sự di chuyển của đám mây e, người ta còn thấy có 2chuyển động nữa là sự quay (Eq) và dao động ( Ed)Tổng năng lượng: Et = Ee + Eq + EdEt: Lượng năng lượng mà các chất hấp thụ để tạo ra phổ hấp thụ phân tử.Vì chỉ có Ee được lượng tử hoá nghĩa là tạo ra mức năng lượng nhất định củaelectron trong phân tử và Ee >> Ed >>Eq nên người ta coi Et ≈ EeVậy: Phổ hấp thụ phân tử của chất trong vùng UV-VIS không phải là phổvạch, đơn bước sóng (1  ), không đơn sắc như phổ phát xạ, phhỏ AAS. Đặc điểmcủa phổ hấp thụ phân tử UV-VIS là phổ băng, phổ đám có cực đại và cực tiểu hấpthụ tuỳ thuộc vào chất cần phân tích.Kết luận: Phổ hấp thụ phân tử UV-VIS là phổ do sự tương tác giữa các điện tửhoá trị trong các liên kết  và đôi điện tử n ở trong phân tử hay nhóm phân tửcủa các chất với chùm tia sáng kích thích thích hợp ( vùng UV-VIS) tạo ra. Phổphân tử UV-VIS là phổ đám có các cực đại và cực tiểu của phổ nằm ở những bướcsóng xác định thuỳ thuộc vào cấu trúc và loại liên kết trong phân tử hay nhómnguyên tử. Vùng sóng 200nm – 800nmHình dáng phổ31.3. Định luật hấp thụ quang - Định luật Lamber beer Độ truyền qua TKhi chiếu 1 chùm sáng có cường độ ban đầu I o vào cuvet dung dịch chứa mẫucó độ dày L có 3 hiện tượng xảy ra-1 phần cường độ chùm sáng đi qua cuvet-Ih1 phần cường độ chùm sáng bị phản xa,Ifxtán xạ Ifx, Itx-dd mauItttx1 phần cường độ chùm sáng bị chất mẫuhấp thụ IhTa có: Io = It + Itx + Ifx + IhSau khi dung dịch hấp thụ, cường độ chùm sáng còn lại là IĐộ truyền qua T được xác địnhT = ( I / Io ) * 100%* Độ hấp thụ quang A, mật độ quang D, độ tắt EA = lg 1/T = lg Io / IA phụ thuộc vào bề dày L của cuvet ( lớp dung dịch), bước sóng của tia sángvà nồng độ mol C của chất. A = f (, L, C )Trong đó , L không đổi nên A phụ thuộc vào nồng độ chất CA = LCb (  là hệ số hấp thụ quang )4A = kCb ( k = L )Khi b = 1 thi D = LC-Ý nghĩa: A = kCbVới mỗi 1 chất luôn có giá trị Co+ Nếu Cx < Co : b = 1. Quan hệ giữa A và Cx là tuyến tính và có dạng y = ax+ Nếu Cx > Co : b < 1. Quan hệ giữa A và Cx là không tuyến tínhHình ảnh:C'xACxCoOC1.4. Phân loại dải hấp thụ: Sự dịch chuyển điện tử trong các hợp chất hữu cơ Chuyển mức + Các hợp chất đồng phân với etylen chứa liên kết đôi trong phân tử có khả nănghấp thụ mạnh trong khoảng bước sóng 170nm+ Vị trí hấp thụ phụ thuộc vào sự hiện diện của nhóm thế+ Những hợp chất không màu thường có phổ hấp thụ ở vùng tử ngoại. Khi chúnghấp thụ bức xạ chúng sẽ chuyển lên mức năng lương cao hơn Chuyển mức n - +Quá trình thường xảy ra trong phân tử có một nguyên tử chứa điện tử không liênkết ( ví dụ phân tử chứa nhóm cacbonyl CO ) và bước sóng hấp thu từ 270nm –295nm. Cường độ hấp thu thấp Chuyển mức + Sự chuyển vị của các e trong lien kết  của các hợp chất hữu cơ từ obital lienkết lên obita phản liên kết5+ Sự chuyển vị này đòi hỏi một năng lượng khá lớn, vì vậy quá trình chuyển vị nàynằm trong vùng tử ngoại xa UV Chuyển mức n -+ Sự chuyển vị của các điện tử từ obital n lên các obital trong các nguyên tửnhư O, N, S+ Xảy ra ở vùng phổ tử ngoại gần có cường độ không lớn. Sự dịch chuyển này daođộng ở 180nm cho ancol, dẫn xuất halogen là 19nm. Đối với các amin là 220 nmVí dụ: Ete có bước sóng max là 190nm ; methanol có bước sóng lớn nhất là183nm ; etylamin có bước sóng lớn nhất là 210nm Chuyển mức d – d+ Sự chuyển mức này xảy ra ở các obital d, nhất là ở các kim loại vùng chuyểntiếp+ Các phối tử có cặp điện tử tự do tham gia lai hóa với nhứng obital này chuyểnđiện tử vào các obital này gây ra sự chuyển mức+ Màu tạo ra của các phức làm cho phức có khả nưng hấp thụ những bước sóng ởvùng khả kiến2. Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng hấp thụ quang UV-VIS.Có nhiều yếu tố ảnh hưởng, ta xét 1 số yếu tố ảnh hưởng.6Ta biết A = f(, L, C) phụ thuộc vào bước sóng ánh sáng, bề dày dung dịch,nồng độ của chất. Các nguyên nhân tác động khách quan gây ra những ảnh hưởngcác yếu tố đến A chính là yếu tố môi trường+ Bước sóng Ánh sáng chiếu vào cuvet không hoàn toàn đơn sắc ( kính lọc không tốt )+ Bề dày dung dịch, cuvet LCuvet có bề dày không đồng nhất, không trong suốt gây hiện tượng quang họcphụ như tán xạ, hấp thụ, phản xạ...+ Nồng độ CẢnh hưởng của pH, khi pH không thích hợp sẽ kéo theo sự thay đổi cấu trúcphân tử, làm sai lệch bước sóng của chấtDung môi: Chọn dung môi không thích jợp có bước sóng khả năng hấp thụcao, ảnh hưởng đến phổ chất mẫu. ( dường nền )Loại liên kết trong phân tử chất tanSự tồn tại lượng dư nhiều hay ít của thuốc thử tạo phức, các ion kim loại khác,chất lạ,..Nhiệt độ môi trường và dung dịch không tồn tại cố định trong quá trình đo2.1. Cấu trúc phân tử của chất tan. ( Hiệu ứng nhóm thế, hiệu ứng lập thể )Nguyên nhân sinh ra quang phổ hấp thụ phân tử là do sự kích thích của tia sángthích hợp, các điện tử trong liên kết hoá học  liên hợp và đôi điện tử rự do ncủa các dị tố trong phân tử quyết định sinh ra phổ UV-VISC = C, C = C - C = C , C = O, N = N, C = N....Chất có nhiều liên kết , liên kết liên hợp  và đôi điện tử tự do n thì sựhấp thụ quang càng mạnh.Đồng phân cis của hợp chất có mạch liên hợp dài có khả năng xuất hiện thêmmột cực đại hấp thụ ở phía sóng ngắn hơn.Ví dụ: trans--caroten: 460nm , cis--caroten: 340nmNhư vậy phụ thuộc vào: + Loại liên kết và bản chất liên kết trong phân tử7+ Số liên kết  liên hợp+ Số nguyên tố dị tố+ Số nhóm thế, bản chất và cấu trúc của nhóm thế+ Cấu trúc lớp vỏ e của ion kim loại trung tâm tạophức và nhóm mang màu, nhóm tăng màu+ Ảnh hưởng của vị trí không gian, hiệu ứng lập thể.1.5. Sự liên hợp của các nhóm mang màuCác chất có màu trong hữu cơ do phân tử có chứa các nhóm nối đôi hay nối baVD: C = C ; C = O; C = N ; N = N , C ≡ C ; N ≡ N ; NO2 ; ...Khi nhiều nhóm mang liên hợp với nhau thì màu của chúng càng đậm. Các hợpchất có chứa nhiều nhóm liên hợp có màu đậm thì cực đại hấp thụ chuyển dịch vềphái sóng dàiCác kiểu liên hợp Liên hợp : Khi trong hợp chất có chứa các nôi đôi liên hợp, các cực đạihấp thụ chuyển dịch mạnh về phía sóng dài, cường độ hấp thụ tăng khi sốnối đôi liên hợp tăngE2E1E3→max=175nmCH2 = CH2→max = 217nmCH2 = CH – CH = CH2→max = 175nmCH2 = CH2∆ E1 = ∆ E2 > ∆ E3Nguyên nhân : Do sự liên hợp giữa các liên kết làm thay đổi mức năng lượngcủa các obital, rút ngắn hiệu số năng lượng của bước chuyển electron (Dải K) Liên hợp  - p: Đây là sự liên hợp của nối đôi và cặp electron tự do ở các dịtố trong các liên kết đôi C = Z ( Z = O, N, S..) và C – X ( X = Cl, Br, I,..)tương ứng với bước bước chuyển electron n → * . Sự liên hợp này dẫn8đến sự chuyển dịh cực đại về phái sóng dài nhưng cường độ hấp thụ khôngtăng.Khi mạch liên hợp  tăng lên thì bước chuyển n → * cũng rút ngắn, do đócực đại hấp thụ chuyển dịch về phái sóng dài ( dải R có cực đại hấp thụ nằm vềphái sóng dài hơn dải K nhưng cường độ hấp thụ luôn nhỏ hơn )Giải thích cho trường hợp liên hợp C = C – C = O n  C=CC = C C -= OC=O Liên hợp Nhóm ankyl thế ở liên kết  gây ra hiệu ứng siêu liên hợp,các electron trong phân tử chuyển dịchCCCCC CC CCHiệu ứng này làm cực đại hấp thụ chuyển dịch về phía sóng dài 1 ít. Ảnh hưởngđến cực đại hấp thụVí dụ: UV của C6H6 ở dạng hơi9Ảnh hưởng của nhóm chức+ Nhóm chức là những nhóm nhỏ được tạo thành từ nhiều nguyên tử, quyết địnhtính chất của hợp chất hữu cơ+ Tịa vị trí các nhóm chức trong phân tử các dịch chuyển điện tử xảy ra, nên phổđồ của phân tử hữu cơ liên quan tới các nhóm chức trong phân tử+ Người ta đã tìm ra được các bước sóng hấp thụ cực đại cho từng nhóm chức. Từđó có thể dự đoán sự tồn tại của nhóm chức thông qua độ hấp thụ của nó2.2. Các yếu tố về môi trườngNhiệt độ môi trường và dung dịch đo phổ trong cuvet không hằng định trongsuốt thời gian đo. Nhiệt độ có thể tăng hoặc giảm do đó chất bị tan chảy hoặc phânhủy2.3. Ảnh hưởng của dung môiTùy theo bản chất phân cực của dung môi và chất tan mà phổ tử ngoại của chấttan thay đổi theo các cách khác nhau. Khi tăng độ phân cực của dung môi thì dải Kchuyển dịch về phía sóng dài còn dải R (n→ ) lại chuyển dịch về phía songngắn.+ Bước sóng hấp thụ và cường độ hấp thụ của các hợp chất chịu ảnh hưởng củadung môi10+ Sự tác động của những dung môi khác nhau lên các phân tử làm thay đổi mứcnăng lượng giữa các phân tử làm thay đổi mức năng lượng giữa các trạng thái cơbản và kích thích+ Sự tác động của dung môi lên phân tử làm sinh ra chuyển dịch xanh và chuyểndịch đỏ+ Chuyển dịch xanhLà hiện tượng hấp thụ bức xạ của các hợp chất hữu cơ có bước sóng ngắn hơntrong những dung môi có tính phân cực caoHiện tượng tìm thấy ở quá trình chuyển dịch n - của nhóm cacbonylNguyên nhân là do sự làm bền trạng thái n của dung môi+ Chuyển dịch đỏLà hiện tượng các hợp chất hữu cơ có xu hướng hấp thụ những bức xạ có bướcsóng dài hơn trong những dung môi có độ phân cực cao hơnHiện tượng được tìm thấy ở các phân tử hữu cơ mà trong cấu trúc phân tử của nócó sự liên hợpNguyên nhân của hiện tượng này do khi mạch C càng dài thì hiệu ứng liên hợpcàng tăng, dẫn tới độ lệch năng lượng giữa hai trạng thái giảm. Trong phan tử hữucơ có hiệu ứng liên hợp càng dài thì bước sóng hấp thụ càng lớn11Ảnh hưởng của pHẢnh hưởng của độ bền phứcẢnh hưởng đến sự tạo phứcẢnh hưởng dạng tồn tại122.4. Các yếu tố thuộc về thiết bịThấu kính, lăng kính, cách tử, hệ gương không đồng nhất, bẩn, tuổi thọcao,...khả năng tạo chùm sáng đơn sắc kém.3. Màu sắc của sự hấp thụKhi chúng ta đo phổ hấp thụ của dung dịch KMnO4 màu tím, K2Cr2O7 màu dacam, CuSO4 màu xanh lam. Sở dĩ có màu như vậy là do các chùm sáng trong vùngkhả kiến chiếu vào các chất đó, chúng đã hấp thụ những tia sáng nhất định trongnhững vùng sóng nhất định. Những tia sáng còn lại hợp thành màu sắc ta nhìnthấy.Như vậy màu của vật chất và khả năng hấp thụ tia sáng của chúng có liên quanchặt ché tới nhau. → Sự bù màu của chùm sáng.Vậy màu sắc của vật chất mà ta nhìn thấy là kết quả của sự tương tác hấp thụánh sáng của vật chất.Bảng bù màu của ánh sang13400480490450chamchamlucluc cham 500timluctia750do625dacamluc anhvang560vang5905754. Cấu tạo của máy quang phổ hấp thụ phân tử UV-VISGồm các bộ phân chính: Nguồn sáng, bộ phận đơn sắc (hệ quang), buồng chứamẫu (cuvet), detector (thu nhận và xử lý số liệu), bộ phận ghi kết quả.cach tuNguon sangcuvetdetectorbo phan ghiket quaa, Nguồn sáng:- Cung cấp ánh sáng trong máy quang phổ UV-VIS là các đèn. Tuỳ theo mụcđích mà chọn đèn có bức xạ khác nhau.- Đèn Đ2-lam: Chùm sáng đèn này được sing ra do sự phóng điện hồ quanggiữa 2 điện cực trơ Pt trong môi trường khí hydro nặng Đ2. Đèn này dùng cho14vùng tử ngoại ( UV = 190 - 400nm), độ bền 500-800h. Đèn làm việc tốt nhất trongvùng phổ từ 210nm đến 360nm- Đèn W-halid: Vùng phổ 400-900nmNguyên tắc làm việc: Sự phát sáng của dây tóc điểm được đốt nóng trong môitrường chân không để tạo ra sự páht sáng trong phổ vùng VIS.Bền, cường độ sáng cao, vì thế một số vùng người ta phải dùng kính lọc đểgiảm bớt cường độ sang của nó.-Đèn xenon: Vùng phổ cả tử ngoại và khả kiến 260-600nmNguyên tắc: Phóng điện của hồ quang giữa 2 cực trơ Pt trong môi trường khíXe.-Đèn hơi Hg: Chỉ cho 1 vài tia nhất định thích hợp với từng chất.Nguyên tắc: Phóng điện hồ quang trong môi trường hơi Hg kim loại để tạo racác vạch phổ phát xạ của hơi HgPhổ biến hay dùng: Đ2, Wb, Bộ phận đơn sắc hoáTuỳ theo mục đích sử dụng mà chọn các loại kính lọc khác nhau.-Kính lọc: Vúng áp dụng VIS-Lăng kính: Dựa trên hiện tượng tán sắc sáng, thường chế tạo bằng thạchanh-Cách tử: Sử dụng nhiều nhất là cách tử phản xạ. Trên bề mặt cách tử có rấtnhiều vạch sát nhau. Khi chiếu tia trên bề mặt của nó, các tia sẽ bị phản xạ theocác phương khác nhau.Khe sáng: Tác dụng tăng giảm cường độ chùm sáng đi vào buồng chứa mẫu.15Phân loại cách tử: có hai loạiCách tử truyền suốt: Được làm bằng thủy tinhCách tử phản xạ: Làm bằng nhômc, Detector, thu nhận và xử lý số liệuDetector là bộ phận ghi nhận và xử lý tín hiệu quang thành tín hiệu điện.Thiết bị nhận biết (detecters)16+ Có tác dụng cảm nhận bức xạ điện từ sau khi bị hấp thụ và chuyển lượng bức xạnày thành dòng điện+ Cường độ dòng điện thu được tỷ lệ thuận với cường độ bức xạ đập vào bề mặtcatotTế bào quang điện hay ống nhân quang điện là những thiết bị hữu dụng trong việcđo xác địnhỐng nhân quang điện: Có chức năng tổ hợp các tín hiệu chuyển đổi qua vài giaiđoạn khuyếch đại trong than của ống.Các loại detector: + Tế bào quang điện: đơn giản, độ nhạy thấp (trước đâydùng)+ Ống nhân quang: Độ nhạy cao, tính chọn lọc cao. Độ khuyeechs đại khoảng106 lần+ Mảng diot: Thích hợp đo đồng thời nhiều cấu tử với nhiều bước sóng khácnhau, độ chọn lọc và độ nhạy khá cao, bền. Loại này rất hay sử dụng.c, Buồng đo (cuvet)17- Buồng đo chứa cuvet mẫu- Buồng đo thường có 2 phần. 1 phần chứa mẫu blank, 1buồng chứa dung dịchcần đo ( buồng 2 chùm tia)- Cuvet: Nhựa, thạch anh, trong suốtMáy đo quang18Máy một chùm tia:Ưu điểm: Giá thành thấp, thông lượng bức xạ đi qua cao và như vậy độ nhạy caoNhược điểm: Có khoảng lệch thời gian khi tiến hành đo giữa các chuẩn cũng nhưmẫu xác định, vì vậy có thể có vấn đê với độ trôi. Điều này đã xảy ra với nhữngthiết bị cũ, những thiết bị hiện đại với tính năng cao và ổn định đã khắc phục đượcnhược điểm này. Vì vậy máy quang phổ một chùm tia vẫn ó những ứng dụng caotrong phòng thí nghiệm1920Ưu điểm của 2 chùm tia: Cho độ chính xác cao vì mẫu đo và mẫu đối chứng đocùng một lúcNhược điểm: Giái thành cao, độ nhạy thấp do cấu trúc quang học phức tạp hơn, độtin cạy thấp hơn5. Nguyên tắc phép đo phổ- Chuẩn bị dung dịch đo phổ21+ Nếu chất phân tích có phổ UV-VIS, ta phải hoà tan nó trong môi trườngthích hợp tạo dung dịch đồng thể.+ Chất không có phổ hấp thụ quang, phải tạo phức bền.+ Với chất khí, cuvet phải đóng kín.-Chiếu vào cuvet có dung dịch mẫu cần phân tích 1 chùm sáng có nănglương thích hợp-Thu chùm sáng đi quan cuvet, chọn tia sáng có  ở vị trí hấp thụ cực đạicủa băng phổ.-Ghi giá trị độ hấp thụ quang A6. Ứng dụngPhân tích định tính, định lượng các cấu trúc phân tử, các mẫu chất. Nguyên tắccủa phân tích định lượng là dựa vào mối quan hệ giữa mật độ quang và nồng độdung dịch theo định luật Lambert – Beer. Ngoài ra, nó cũng còn được sử dụng đểxác định hằng số cân bằng , hằng số phân li và nghiên cứu động Ưu điểm: Đơn giản, dễ thực hiện, máy móc không đắt lắm. Phù hợp chophân tích định lượng nhiều chất có hàm lượng nhỏ. Ví dụ:+ Xác định các chất: Phân tích các hợp chất hữu cơPhân tích thuốc, dược phẩm, sản phẩm nông nghiệpPhân tích ion kim loại trong các đối tượng mẫu khác nhau+ Xác định thành phần phức, độ phân ly, hằng số phân ly của phức và axit yếu+ Xác định nhóm chức trong phân tử chất Nhược điểm: Độ chọn lọc kém, thuốc thử để tạo phức hay hợp chất có cáccực đại hấp thụ gần nhau, chen lấn nhau, trùng nhau không xác định được Phạm vi ứng dụng: Trong y học, dược học, nông nghiệp, thực phẩm, phântích môi trường, nước, công nghiệp hóa học6.1. Phương pháp đo 1 bước sóngĐể phân tích một mẫu có thể thực hiện theo cách đơn giản là đo một mẫuchuẩn và một mẫu phân tích rồi tính toán theo công thức của định luật LambertBeer có thể viết22Dc = cLCcDx = xLCxVới: Dc, Dx là mật độ quang của dung dịch mẫu chuẩn và mẫu phân tíchL là chiều dày lớp mỏng của dung dịchCc, Cx là nồng độ của dung dịch mẫu chuẩn và mẫu phân tích là hệ số hấp thụ quangTừ 2 phương trình trên suy ra: C x Cc DxDcCc là nồng độ mẫu chuẩn được pha chính xác, Dx và Dc là giái trị đo được trênmáy đo. Từ đó tính được nồng độ mẫu phân tích6.2. Phương pháp lập đường chuẩn1. Chọn bước sóng lớn nhất max2. Pha dãy chất chuẩn có nồng độ tăng hoặc giảm dần3. Đo mật độ quang của các mẫu ở bước sóng trên4. Vẽ đồ thị phụ thuộc mật độ quang D vào nồng độ C, đường biểu diễn của đồthị này được gọi là đường chuẩn.5. Pha mẫu phân tích sao cho nồng độ dung dịch mẫu đo nằm trong giới hạntuyến tính của đường chuẩn. Sau khi đo mẫu phân tích nhận giá trị Dx rồi đối chiếutrên đồ thị đọc được giá trị Cx23Độ hấp thụ của 1 chất tại 4 nồng độ khác nhau6.3. Phân giải phổDựa vào bước sóng lớn nhất max có thể biết được loại liên kếtmax < 150nm: chỉ có loại liên kết của hợp chất no.max > 150nm: có liên kết bộimax quanh vùng 200 – 260nm có thể có benzene và benzene thếmax > 280nm: hệ liên hợpmaz càng lớn thì hệ liên hợp càng dài7. Hình dáng phổ và sự chen lấn phổVì phổ hấp thụ quang UV-VIS là phổ phân tử và nhóm phân tử, nó là phổ đámkhông phải là phổ vạch. Các dải phổ thường có độ rộng từ 10-50nm. Nhiềuchất hay hợp chất của nó với một thuốc thử thường có vùng cực đại hấp thụkhông cách xa nhau, có thể trùng cực đại hay nằm sát cạnh nhau. Do đó phổUV-Vis không có tính chọn lọc cao và ảnh hưởng của sự chen lấn phổ của cácchất với nhau là rất lớn. Rất nhiều trường hợp phải tách riêng chất mới đo đượcphổ hấp thhuj của nó chính xác. Nếu không tại 2 bước song của cả 2 chất chỉ24đo được độ hấp thụ quang tổng của các chất mà thôi. Để tách được các chất rakhỏi nhau phải loại trừ các chất có phổ chen lấn ảnh hưởng đến phổ của chấtphân tích. Muốn thế ta phải quét phổ của toàn vùng của từng chất sau đó lồnglên nhau, so sánh chúng với nhau và qua đó chúng ta phát hiện được các vùngphổ kề nhau, chen nhau hay trùng nhau ( có thể: Thêm chất phụ gia, tạo phức,kết tửa, chọn pH, chọn dung môi,…)Ví dụ:Dải phổ của hấp thụ quang phân tửUV-VIS có dạng đường chuẩnGauss. Độ rộng của dải hấp thụquang được xác định bẳng NBW làchiều rộng của dải hấp thụ mẫu ởnửa cực đại hấp thụ (có thể ký hiệulà W1/2 ).Sự chen lấn phổ 1 phần (