Sắc Ký Khí Ghép Nối Khối Phổ (Phần 1) - BioMedia Vietnam Group

BioMedia

Sắc ký khí: >>> chi tiết xem tại đây Sắc ký khí

Phổ khối lượng >>>Phương pháp khối phổ (MS)

ICP-MS: Khái niệm, Cấu tạo, Ưu điểm và Ứng dụng

Sắc ký khí ghép nối khối phổ (Phần 2)

Nhu cầu xác định chính xác các thành phần trong các hỗn hợp phức tạp là động lực để phát triển các kỹ thuật ghép nối (tandem) các thiết bị khác nhau, trong đó có một phương pháp được sử dụng rộng rãi và thành công (với các chất dễ bay hơi) là kỹ thuật sắc ký khí ghép nối khối phổ (GC-MS).

GC-MS là sự kết hợp thành công của 2 kỹ thuật GC (sắc ký khí) và MS (khối phổ) vì các hợp chất thích hợp để phân tích bằng phương pháp GC (khối lượng phân tử thấp, độ phân cực trung bình hoặc thấp, ở nồng độ ppb – ppm) cũng tương thích với các yêu cầu của phương pháp MS và đều thực hiện quá trình phân tích ở pha hơi (cùng trạng thái).

Điểm “mâu thuẫn” duy nhất giữa GC và MS là áp suất làm việc khác nhau, áp suất ở lối ra cột GC là áp suất khí quyển còn áp suất trong buồng ion hóa lại là áp suất thấp (10-5 – 10-6 Torr) . Nhược điểm này đã được khắc phục bằng kỹ thuật sử dụng bơm chân không hiệu suất cao vào và các cột sắc ký mao quản (đường kính trong từ 0.18 tới 0.32mm) được đặt trực tiếp vào buồng nguyên tử hóa của đầu dò khối phổ.

Sơ đồ máy GCMS điển hình – nguồn: www.chromacademy.com

Phương pháp sắc ký khí ghép nối khối phổ

1. Các chế độ ion hóa

Bản chất của phương pháp đo khối phổ là quá trình ion hóa phân tử, có hay không có sự phân mảnh hay phân tách tiếp theo. Các cơ chế ion hóa – phân tách: bớt hay thêm một electron, một proton, thêm hay bớt ái lực điện tử âm hay dương và tạo nhóm cũng như hướng tới tạo thành các ion khác. Ion hóa một phân tử là một quá trình tiêu hao năng lượng, năng lượng này có thể được cung cấp bằng các electron gia tốc hay gia nhiệt (va chạm electron hay bắt giữ electron), bằng các photon (dưới tác động của bức xạ điện từ, chùm tia laze, hay quá trình phóng điện tích corona), bằng các nguyên tử hay các ion được gia tốc bằng việc biến đổi trường tĩnh điện cao hoặc va chạm nhiệt.

Nhiều phương pháp đã được phát triển để cung cấp năng lượng cho quá trình ion hóa các phân tử phân cực hoặc không phân cực, có thể bị phân hủy bởi nhiệt, có khối lượng phân tử cao hoặc thấp trong pha khí (ion hóa hóa học – CI, ion hóa bằng photon – PI, ion hóa bằng từ trường, điện trường – FI, tác động điện tử – EI) hoặc pha ngưng tụ (giải phóng điện trường, từ trường – FD, ion hóa bằng chùm tia laser – LD, bắn phá nhanh nguyên tử – FAB, ion hóa bằng plasma – PD, máy khối phổ ion thứ cấp – SIMS, ion hóa bằng bổ trợ nền và năng lượng laze MALDI).

Việc ion hóa các phân tử trung hòa với sự hình thành các phân mảnh hoặc ion hóa phân ly, ở đó, các ion tạo thành có thể được phân tách với các mức độ chính xác khác nhau tùy thuộc vào máy phân tích được sử dụng. Thu được phổ khối là sự cân bằng năng lượng tự thân (sui generis) bao gồm các mức năng lượng khác nhau từ năng lượng kích thích điện tử của một phân tử (phổ UV-VIS) tới năng lượng nguyên tử hóa phân tử đó (phổ hấp thụ hoặc phát xạ nguyên tử).

Bước đầu tiên là ion hóa phân tử, cho biết về khối lượng phân tử và thành phần nguyên tố chính xác khi ion phân tử tạo thành được phát hiện. Mặt khác, một số phân tử đã ion hóa cần phân ly hay phân mảnh, cho biết các nhóm thành phần cấu thành nên phân tử và chúng được kết hợp với nhau như thế nào.

Ion hóa điện tử (EI) là kỹ thuật ion hóa phân tử hữu cơ đầu tiên; đây là kỹ thuật phổ biến nhất và có số lượng ứng dụng nhiều nhất, ví dụ như GC-MS. Gọi là “va chạm điện tử” không chính xác lắm vì kích thước và năng lượng của điện tử, so với một phân tử hữu cơ 150-500 Da không thực sự cho phép điện tử tác động lên phân tử đó. Chính xác quá trình tương tác xảy ra khi bắn phá một electron với electron của phân tử.

Tương tác của một electron được gia tốc với một phân tử dẫn đến sự kích thích các electron của phân tử và một ion phân tử, M+, sẽ được tạo thành nếu năng lượng truyền đến đủ lớn. Khối lượng phân tử của ion được tạo ra bằng về mặt “số lượng” so với khối lượng của phân tử bởi vì khối lượng của một điện tử là không đáng kể.

Các electron là các tác nhân tuyệt vời để ion hóa các phân tử hữu cơ.

• Thứ nhất, có thể dễ dàng thu nhận chúng: chỉ cần cho một dòng điện đi qua một dây vonfram hoặc reni (dây tóc hoặc điện cực âm).
• Thứ hai, năng lượng của chúng có thể điều chỉnh với nguồn điện được đặt giữa cực âm và cực dương, ở đó năng lượng tiêu chuẩn trung bình là 70eV. Đối với hầu hết các phân tử hữu cơ, hiệu suất ion hóa tối đa đã đạt được bằng các electron bắn phá với nguồn điện 50-60 eV. Các phổ khối tiêu chuẩn thực hiện ở 70eV bởi vì chúng có thể đạt được độ lặp lại và độ tái lặp lại cao nhất. Các thư viện phổ khối cũng được tạo ra với các phổ thu được ở mức năng lượng ion hóa là 70 eV. Tất cả những điều này tạo điều kiện thuận lợi để so sánh các phổ thực hiện trên các máy quang phổ khác nhau với các cơ sở dữ liệu và các công cụ khác. Năng lượng của electron bắn phá là 70 eV lớn hơn rất nhiều so với năng lượng cần thiết để ion hóa các phân tử hữu cơ. Các mức năng lượng ion hóa các phân tử hữu cơ nằm trong khoảng từ 6 đến 13 eV và phụ thuộc vào cấu trúc phân tử của chúng.

Sơ đồ tạo ion dương bằng nguồn ESI – nguồn: case.vn

Năng lượng ion hóa của một phân tử hữu cơ giảm khi có các electron π (liên kết không no, vòng thơm) hay các nguyên tử khác loại (N, O, S) và theo đó, quá trình ion hóa tạo mảnh của phân tử tăng lên. Các phân tử nhỏ như H2O, HCN, CO hay CO2 có năng lượng ion hóa khá cao, cụ thể, lần lượt là 12.6, 13.9, 14.0, and 13.3 eV (và do đó nhiệt tạo thành chúng cũng tăng lên). Khi các phân tử hữu cơ bị ion hóa khi mất đi 18 (H2O), 27 (HCN), 28 (CO) hay 44 (CO2) đơn vị khối lượng thì những loại phân tử nhỏ này thực tế không bao giờ được ghi nhận là các ion trong phổ khối của chúng, chính xác là do thế năng ion hóa cao hơn so với các ion phân mảnh khác, như (M – H2O)+•, (M-HCN)+•, (M– CO)+• hoặc (M– CO2)+•. Nếu ion phân tử không được ghi lại trong phổ khối của các chất phân tích dễ bay hơi và các chất bền nhiệt thì điều này có thể được giải thích là do tính không bền và tuổi thọ ngắn (<10-6 s) của chúng, cũng như thiếu tính ổn định trong phân tử của các nguyên tố cấu tạo (liên kết đôi, vòng thơm, dị tố) để giúp ổn định hóa bằng các cơ chế khác nhau, thông qua việc tách loại điện tích có hiệu quả. Ion phân tử sẽ không thể phân biệt được trong phổ bằng cách giảm năng lượng các electron bắn phá. Nếu chúng không được ghi ở năng lượng electron 70 eV thì chúng cũng không được phát hiện ở điện thế với các mức năng lượng electron thấp hơn (10 – 30 eV). Đó là do độ nhạy của phương pháp giảm đáng kể, tức là số lượng các ion phân tử hoặc ion mảnh giảm khi năng lượng điện tử giảm.

Đối với các phân tử dễ bay hơi, bền nhiệt nhưng không ổn định và không có ion phân tử nào được ghi trong các phổ khối, khi đó các phương pháp ion hóa “nhẹ nhàng” có thể sử dụng thay thế, ví dụ như ion hóa hóa học (CI) hoặc trong một số trường hợp, quá trình tạo dẫn xuất hóa học là một giải pháp hiệu quả.

Quá trình ion hóa dùng electron xảy ra ở áp suất giảm (chân không) từ 10-5 – 10-6 Torr. Quá trình này thu nhiệt khi tạo thành các ion M+ và phân ly đơn phân tử. Tuy nhiên, phân mảnh không phải là một quá trình ngẫu nhiên. Sự xuất hiện của các ion phân mảnh nhất định là sự phản ánh của (1) cấu trúc phân tử, (2) năng lượng của chùm ion bắn phá, và (3) nội năng dư thừa mà phân tử ion hóa thu nhận. Số lượng các ion (dòng ion) được phát hiện có thể chịu ảnh hưởng của áp suất trong hệ thống, nhiễm tạp ở nguồn ion hoặc do bề mặt dynode của ống nhân điện tử bị lão hóa hoặc giảm chất lượng.

Các phương pháp ion hóa có nhiều lựa chọn hơn và cũng phức tạp hơn khi phân tích với các chất có khối lượng phân tử cao (như protein, nucleotit, poly sacarit), các phân tử phân cực lớn (amino axit, đường, glycosit, vitamin, hay thuốc trừ sâu…), hoặc các chất không bền nhiệt. Ion hóa các phân tử nặng hay phân cực, thường xảy ra song song hoặc ngay sau khi được giải phóng ra từ bề mặt phân bố hai chiều trong dung môi rất ít bay hơi.

Việc giải phóng khỏi bề mặt và quá trình ion hóa diễn ra gần như đồng thời: tạo ra các ion chính và ion thứ cấp bởi các nguyên tử được gia tốc (FAB), các ion được gia tốc (SIMS), hay các photon năng lượng cao (một kiểu của phương pháp MALDI).

Các kỹ thuật ion hóa đặc biệt được dùng trong thiết lập các hệ thống kết nối liên tục, như: ghép nối sắc ký khí lỏng (LC) với khối phổ (MS) tạo thành hệ LC-MS, trong hệ thống này mẫu lỏng có thể được phun sương tại một trong các bộ phận kết nối với khối phổ khác nhau có sẵn, có thể dưới sự hỗ trợ bởi tác động nhiệt và điện thế cao; như phương pháp ion hóa phun nhiệt (TSI), phun điện (ESI), hoặc các phương pháp ion hóa học ở áp suất khí quyển (APCI).

APCI là kỹ thuật ion hóa thường được sử dụng để phân tích những hợp chất có độ phân cực trung bình, có phân tử lượng nhỏ, dễ bay hơi.

Trong APCI, ion đươc hình thành như sau: mẫu hợp chất cần phân tích, hòa tan trong pha động, sau khi ra khỏi cột sắc ký, được cho đi ngang qua ống mao quản đốt nóng. Khi ra khỏi ống, nhờ khí N2, dung dịch được phun thành dạng sương từ đầu ra của nguồn APCI. Các giọt sương nhỏ được một dòng khí dẫn đến một ống thạch anh đun nóng, gọi là buồng dung môi hóa khí. Hợp chất đi theo luồng khí nóng ra khỏi ống để đến một vùng có áp suất khí quyển, nơi đây sẽ xảy ra sự ion hóa hóa học nhờ vào que phóng điện corona, tại đây có sự trao đổi proton để biến thành ion dương (MH)+ và trao đổi electron hoặc proton để biến thành ion âm (M H)-. Sau đó, các ion sẽ được đưa vào bộ phân tích khối.

Lựa chọn kiểu tạo ion – nguồn: case.vn

Các cơ chế khác nhau dẫn đến việc tạo thành các phần tử được ion hóa bao gồm các phân tử được thêm hoặc bớt nhiều proton, các nhóm.

Kỹ thuật phổ biến nhất để ion hóa các phân tử “nhỏ” (chiếm tỷ lệ 90% các ứng dụng) là tác động va chạm điện tử trong khi ion hóa hóa học ion dương (PICI) hoặc ion hóa hóa học ion âm (NICI) là một phương pháp bổ trợ quan trọng được sử dụng khi các ion phân tử không được ghi lại trong phổ thu được bởi EI. Khi khối lượng phân tử của chất được xác định, rõ ràng nó được suy ra từ phổ CI dựa trên khối lượng của ion phân tử được thêm một proton theo phương pháp PICI, MH+ (hoặc bớt một proton (MH)–, theo phương pháp NICI), cùng với các ion nhóm, thường được tạo ra bằng phản ứng cộng ái lực điện tử dương của các ion thứ cấp từ các khí (metan, amoni, iso butan…) tham gia phản ứng.

Cả hai phương pháp ion hóa điện tử (EI) và ion hóa hóa học (CI) đều được dùng trong kỹ thuật sắc kí khí ghép nối khối phổ GC-MS. Tuy nhiên, việc sử dụng CI đòi hỏi sự thay đổi thể tích ion (buồng ion hóa) do áp suất dư được sử dụng trong CI cao hơn rất nhiều (lên tới 1 mm Hg) so với áp suất sử dụng trong EI (10-5 – 10-7 Torr). Trên thực tế, không đến 10% trong số tất cả các chất trên hành tinh này có thể được ion hóa ở pha hơi bằng EI hoặc CI bởi vì quá trình ion hóa bằng các kỹ thuật này có hạn chế chính là khả năng bay hơi kém hoặc tính không bền nhiệt của nhiều chất hữu cơ. Sự bay hơi là một giai đoạn trước khi ion hóa bằng EI hoặc CI, cả hai quá trình này được tách riêng cả về thời gian và không gian. Việc phân tách các ion trong kỹ thuật sắc ký khí – khối phổ có thể thực hiện với tất cả các bộ phân tích khối lượng, như bẫy ion, (IT), bộ tứ cực (Q), cũng như cấu hình của một số máy phân tích kiểu kết nối liên tục (như hệ QqQ, bộ ba tứ cực triple-quadrupole và ngày này, đối với cấu hình GC x GC, bộ phân tích thời gian bay (TOF).

– Bẫy ion (Ion trap): Có một số công nghệ bẫy ion khác nhau tùy thuộc vào cấu tạo. Nói chung là các ion (sau khi qua nguồn) được dẫn đến một khu vực (gọi là bẫy) tại đây các ion được giữ lại và phân tách dựa vào khối. Theo nguyên tắc, bẫy ion có thể làm được đến khối phổ nhiều lần (MSn) tuy nhiên thường làm đến 3 lần.

– Tứ cực (Quadrupole): Hiện có 2 loại: Single-Quad – Tứ cực đơn (chỉ làm đến MS 1 lần) và Triple-Quad – Ba tứ cực (có thể làm MS/MS gọi là tandem Mass spectrometry. Hiện nay các phương pháp định lượng đều yêu cầu sử dụng máy ba tứ cực như là một phương pháp khẳng định.

– Bộ phân tích độ lệch từ trường Cung từ (Magnetic Sector): Độ phân giải rất cao (khoảng 60.000).

– Thời gian bay (TOF-Time of Flight): Dựa trên thời gian bay khác nhau của các ion có khối lượng khác nhau. Có 2 kiểu TOF gọi là linear-TOF và reflection-TOF . Linear-TOF đường bay của ion là đường thẳng tuyến tính nên độ phân giải khối không cao. Ref-TOF là loại thời gian bay phản xạ độ phân giải cao.

(Còn tiếp)

Nguồn: Book “Advances in Gas Chromatography”, book edited by Xinghua Guo, ISBN 978-953-51-1227-3, Published: February 26, 2014, Chapter 1

Tác giả: Elena Stashenko and Jairo René Martínez

Tổng hợp và dịch: BioMedia Việt Nam