Sac Ky Long Hieu Nang Cao Hplc - SlideShare

Trang chủ » Slide Sắc Ký Lỏng Hiệu Năng Cao » Sac Ky Long Hieu Nang Cao Hplc - SlideShare

Có thể bạn quan tâm

Sac ky long hieu nang cao hplc•4 likes•1,077 viewsNguyen Thanh Tu CollectionNguyen Thanh Tu CollectionFollow

SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO HPLC (High Performance Liquid Chromatography)Read less

Read more1 of 141SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO- HPLC (High Performance Liquid Chromatography) SẮC KÝ 2 MỤC TIÊU HỌC TẬP 1. Giải thích được nguyên tắc hoạt động của máy HPLC 2. Trình bày được cấu tạo của máy HPLC 3. Mô tả được các kỹ thuật của HPLC: sắc ký phân bố, sắc ký hấp thụ, sắc ký trao đổi ion, sắc ký trên gel, sắc ký ái lực và sắc ký huỳnh quang. 4. Vận dụng tính toán các chỉ số trong điều kiện chạy HPLC. 3 Sắc ký được ĐN là pp tách một hỗn hợp các chất thành các chất riêng. Kỹ thuật này dựa trên sự khác nhau về tốc độ di chuyển các chất của hỗn hợp qua pha tĩnh dưới ảnh hưởng của một số dung môi hoặc khí (pha động). 4 SẮC KÝ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO • Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ra đời năm 1967-1968 trên cơ sở phát triển và cải tiến từ PP sắc ký cột cổ điển. • HPLC là một PP chia tách trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã được biến bằng LKHH với các nhóm chức HC 5 6 Carbohydrates 1. fructose 2. Glucose 3. Saccharose 4. Palatinose 5. Trehalulose 6. isomaltose Zorbax NH2 (4.6 x 250 mm) 70/30 Acetonitrile/Water 1 mL/min Detect=Refractive Index 1 2 3 4 5 mAU time 6 7 Separations Separation in based upon differential migration between the stationary and mobile phases. Stationary Phase - the phase which remains fixed in the column, e.g. C18, Silica Mobile Phase - carries the sample through the stationary phase as it moves through the column. Injector Detector Column Solvents Mixer Pumps High Performance Liquid Chromatograph Waste 8 Separations Injector Detector Column Solvents Mixer Pumps Chromatogram Start Injection mAU time High Performance Liquid Chromatograph 9 Separations Injector Detector Column Solvents Mixer Pumps Chromatogram Start Injection mAU time 10 Separations Injector Detector Column Solvents Pumps Mixer Chromatogram Start Injection mAU time 11 Separations Injector Detector Column Solvents Pumps Mixer Chromatogram Start Injection mAU time 12 Separations Injector Detector Column Solvents Pumps Mixer Chromatogram Start Injection mAU time 13 Separations Injector Detector Column Solvents Pumps Mixer Chromatogram Start Injection mAU time 14 Separations Injector Detector Column Solvents Pumps Mixer Chromatogram Start Injection mAU time 15 Separations Injector Detector Column Solvents Pumps Mixer Chromatogram Start Injection mAU time 16 Separations Injector Detector Column Solvents Pumps Mixer Chromatogram Start Injection mAU time 17 Separations Injector Detector Column Solvents Pumps Mixer Chromatogram Start Injection mAU time 18 Separations Injector Detector Column Solvents Pumps Mixer Chromatogram Start Injection mAU time 19 Separations Injector Detector Column Solvents Pumps Mixer Chromatogram Start Injection mAU time 20 Separations Injector Detector Column Solvents Pumps Mixer Chromatogram Start Injection mAU time 21 Separations Injector Detector Column Solvents Pumps Mixer Chromatogram Start Injection mAU time 22 Separations Injector Detector Column Solvents Pumps Mixer Chromatogram Start Injection mAU time 23 Separations Tiêm Detector Cột Dung môi Bơm Bắt đầu tiêm mẫu mAU Thời gian 24 The Chromatogram Tiêm to tR mAU Thời gian tR Vùng diện tích (chiều cao) để định lượng Tại sao lại dùng HPLC • Phân tích đồng thời • Độ phân giải cao • Độ nhạy cao • Tính lặp lại tốt • Điều kiện phân tích trung bình • Dễ phân đoạn và tinh khiết • Không độc hại 25 • Trọng lượng phân tử của chất tan • Độ tan trong nước của chất tan • Sự phân cực của chất tan • Tính chất ion hóa, tính chất không ion của chất tan 26 Các loại HPLC phụ thuộc vào: 2. PHÂN LOẠI HPLC 2. PHÂN LOẠI HPLC Dựa vào sự khác nhau về cơ chế tách chiết sử dụng trong HPLC, người ta chia HPLC thành các loại: 1. SK phân bố 2. SK trao đổi ion hiệu năng cao. 3. SK lỏng hiệu năng cao trên gel 4. SK hấp phụ (sắc ký lỏng rắn) 5. SK ái lực 6. SK đồng phân quang học 27 2. PHÂN LOẠI HPLC 28 • Pha tĩnh là yếu tố quan trọng quyết định bản chất quá trình sắc ký. 29 Pha tĩnh Loại sắc ký Chất hấp phụ SK hấp phụ pha thuận hoặc pha đảo Chất trao đổi ion SK trao đổi ion Chất lỏng SK phân bố (SK chiết) Gel SK gel hoặc rây phân tử 2. PHÂN LOẠI HPLC • Các loại HPLC: 1. Sắc ký phân bố 2. Sắc ký trao đổi ion 3. Sắc ký lỏng trên gel 4. Sắc ký hấp phụ (sắc ký lỏng rắn) 5. Sắc ký ái lực 6. Sắc ký đồng phân quang học 30 2. PHÂN LOẠI HPLC • Các loại HPLC: 1. Sắc ký phân bố 2. Sắc ký trao đổi ion. 3. Sắc ký lỏng trên gel 4. Sắc ký hấp phụ (sắc ký lỏng rắn) 5. Sắc ký ái lực 6. Sắc ký đồng phân quang học 31 2. PHÂN LOẠI HPLC 1. Sắc ký phân bố (partition chromatography) SK phân bố được ứng dụng nhiều nhất vì có thể phân tích được những hợp chất từ không phân cực đến những hợp chất rất phân cực, hợp chất ion có khối lượng phân tử không quá lớn (<3000). 32 PHÂN LOẠI HPLC 33 Pha tĩnh là những hợp chất hữu cơ được gắn lên chất mang rắn silica hoặc cấu thành từ silica theo hai kiểu: • Pha tĩnh được giữ lại trên chất mang rắn bằng cơ chế hấp phụ vật lý → sắc ký lỏng-lỏng (liquid-liquid chromatography). • Pha tĩnh liên kết hóa học với chất nền → sắc ký pha liên kết 2.1. Sắc ký phân bố • Trong quá trình sử dụng, người ta nhận thấy sắc ký pha liên kết có nhiều ưu điểm hơn sắc ký pha lỏng-lỏng do: – Pha tĩnh trong hệ sắc ký lỏng-lỏng dễ bị hòa tan bởi pha động nên dễ bị mất mát pha tĩnh trong thời gian sử dụng và gây nhiễm đối với hợp chất phân tích. – Do pha tĩnh của sắc ký lỏng-lỏng dễ tan trong pha động nên người ta không thể ứng dụng phương pháp rửa giải gradient dung môi. 34 2.1. Sắc ký phân bố Pha tĩnh • Hay dùng: dẫn chất siloxan • Tính chất phân cực phụ thuộc vào các nhóm thế: - Pha tĩnh ko phân cực: nhóm thế là các gốc hydrocarbon no hoặc thơm. - Pha tĩnh phân cực: có các nhóm thế phân cực như amino, nhóm –OH, nhóm cyano (-CN). Chú ý: Thường chỉ bên pH từ 2-8. (các pH >8 thì chuyển sang cột polymer) 35 2.1. Sắc ký phân bố 36 Ảnh hưởng của pha tĩnh 37 37 C18 (ODS) Mạnh C8 MẪU MẪU MẪU C4 Trung bình Yếu 2.1. Sắc ký phân bố Dựa trên độ phân cực tương đối giữa pha tĩnh và pha động, Sk phân bố được chia 2 loại : + Sắc ký pha thường (SK pha thuận): Pha tĩnh phân cực > Pha động + Sắc ký pha đảo: Pha tĩnh phân cực < pha động. 38 2.1. Sắc ký phân bố • SKPĐ là thuật ngữ để chỉ một loại SK trong đó pha tĩnh ít phân cực hơn pha động. PP này dùng phân tích các HC từ ko phân cực đến phân cực. • Hầu hết các HCHC có mạch carbon dài (ít phân cực) rất thích hợp cho phân tích bằng SKPĐ. Dung môi sử dụng trong SKPĐ là các DM phân cực, trong đó nước đóng vai trò quan trọng, rẻ tiền. Do đó, SKPĐ được ứng dụng nhiều và phổ biến hơn SKPT. 39 2.1. Sắc ký phân bố Đặc điểm: - Sắc ký pha thuận: Chất ít phân cực nhất được rửa giải đầu tiên → khi tăng độ phân cực của pha động, thời gian lưu giảm. - Sắc ký pha đảo: Ngược lại, các chất phân cực được rửa giải đâu tiên → khi tăng độ phân cực của pha động thì thời gian lưu tăng lên. 40 2.1. Sắc ký phân bố Mối quan hệ giữa độ phân cực và thởi gian lưu 41 2.1. Sắc ký phân bố Nguyên tắc chọn pha tĩnh, pha động Chọn pha tĩnh và pha động dựa vào độ phân cực của các thành phần tham gia theo nguyên tắc: 1. Độ p/cực của chất PT hợp với độ p/cực của pha tĩnh, và khác xa độ p/cực của pha động. 2. Độ p/cực của chất PT hợp với độ p/cực của pha động và khác nhiều độ p/cực của pha tĩnh. 42 2.1. Sắc ký phân bố 2.1. Sắc ký phân bố Pha tĩnh của SK pha đảo 43 Ứng dụng: chủ yếu SK pha đảo 44 2.1. Sắc ký phân bố Lĩnh vực Đối tượng phân tích Dược Kháng sinh, giảm đau, an thần, steroid Hóa sinh Aminoacid, protein, lipid, carbonhydrat Thực phẩm Chất làm ngọt, phụ gia, chất chống oxy hóa.. Hóa CN HC thơm, chất màu, chất hđ bề mặt Môi trường Các chất trừ sâu diệt cỏ, dẫn chất phenol Hóa pháp lý Các chất độc, thuốc ngủ Y học lâm sàng Acid mật, các chất chuyển hóa của thuốc • Các loại HPLC: 1. Sắc ký phân bố 2. Sắc ký trao đổi ion 3. Sắc ký lỏng trên gel 4. Sắc ký hấp phụ (sắc ký lỏng rắn) 5. Sắc ký ái lực 6. Sắc ký đồng phân quang học 45 2. PHÂN LOẠI HPLC 2.2. Sắc ký trao đổi ion • Dựa vào lực hút của ion chất tan và vị trí mang điện tích trên pha tĩnh. • Chất trao đổi anion có nhóm mang điện tích (+) trên pha tĩnh hút anion chất tan. • Chất trao đổi cation có nhóm mang điện tích (-) trên pha tĩnh hút cation chất tan. • Chất trao đổi ion là polymer không tan trong nước mang các nhóm trao đổi ion. 46 47 2.2. Sắc ký trao đổi ion 48 2.2. Sắc ký trao đổi ion Có 2 loại nhựa trao đổi ion: - Nhựa trao đổi cation: loại acid mạnh mang nhóm acid sulfonic, loại yếu mang nhóm acid carboxylic. - Nhựa trao đổi anion: có nhóm base amin liên kết với phân tử polymer. Chất trao đổi base mạnh có nhóm amin bậc 4, dạng base yếu có nhóm amin bậc 2 hoặc bậc 3. 49 2.2. Sắc ký trao đổi ion 50 copolymer styren - divinyl benzen 2.2. Sắc ký trao đổi ion Một số nhóm hoạt động của nhựa trao đổi ion 51 Loại Viết tắt Tên Cấu tạo 1. Trao đổi cation - Acid mạnh -Acid trung bình - Acid yếu P SE P CM Sulfopropyl Sulfoethyl Phosphat Carboxymethyl -O(CH2)3- SO3H -O(CH2)2-SO3H -OPO3H -OCH2-COOH 2. Trao đổi anion - Base mạnh Base trung bình - Base yếu TEAE QAE DEAE PAB Trimethylaminpethyl Diethyl (2- hydroxypropylquartern aryamino Diethylaminoethyl P-amino benzyl -O(CH2)N+(CH2CH3)3 -O(CH2)2N+(CH2CH3)2 CH2CH(OH)-CH3 -O(CH2)2N(CH2CH3)2 -O-CH2-C6H4-NH2 Ứng dụng: 52 2.2. Sắc ký trao đổi ion - Dùng cân bằng trao đổi ion để tinh chế nguyên liệu loại tạp chất. Ví dụ các ion kim loại M2+ và anion X- để điều chế nước tinh khiết (nước khử ion) -Dùng nhựa trao đổi ion để tăng nồng độ của các thành phần vi lượng trong dung dịch đủ cho phân tích. - Áp dụng cho sắc ký 53 2.2. Sắc ký trao đổi ion Ứng dụng: • Các loại HPLC: 1. Sắc ký phân bố 2. Sắc ký trao đổi ion 3. Sắc ký lỏng trên gel 4. Sắc ký hấp phụ (sắc ký lỏng rắn) 5. Sắc ký ái lực 6. Sắc ký đồng phân quang học 54 2. PHÂN LOẠI HPLC • Nguyên lý: Tách riêng các chất dựa vào KT phân tử. • Ko có liên kết hoặc tương tác hấp phụ với pha tĩnh. • Các gel có vai trò như các sàng phân tử các chất có KTPT khác nhau được tách riêng ra. Có các loại: - SK thấm gel: dùng gel để tách các polymer hòa tan/dung môi. Pha động kỵ nước. - Sắc ký lọc gel: dùng gel để tách các polymer sinh học. Pha động ưa nước 55 2.3. Sắc ký lỏng trên gel 56 2.3. Sắc ký lỏng trên gel 57 2.3. Sắc ký lỏng trên gel 58 2.3. Sắc ký lỏng trên gel 59 Pha tĩnh (có các lỗ xốp): • Các loại gel mềm hay dùng: cellulose, dextran, agarose hoặc poly acrylamid. • Các gel cứng bán cứng: polystyren, alkyl dextran trong môi trường không chứa nước. 60 2.3. Sắc ký lỏng trên gel 61 2.3. Sắc ký lỏng trên gel 62 • Các loại HPLC: 1. Sắc ký phân bố 2. Sắc ký trao đổi ion 3. Sắc ký lỏng trên gel 4. Sắc ký hấp phụ (sắc ký lỏng rắn) 5. Sắc ký ái lực 6. Sắc ký đồng phân quang học 63 2. PHÂN LOẠI HPLC • Nguyên tắc tách là sự hấp phụ của chất phân tích trên bề mặt pha rắn. • Pha tĩnh là chất rắn phân cực. Chất phân tích tranh chấp với pha động ở các vị trí hấp phụ trên bề mặt pha tĩnh. 64 2.4. Sắc ký hấp phụ (sắc ký lỏng rắn) 65 Sự khác nhau giữa SK phân bố và SK hấp phụ 66 Pha tĩnh Tương tác mạnh Tương tác yếu Mobile Phase 2 1 2.4. Sắc ký hấp phụ (sắc ký lỏng rắn) • Pha tĩnh: - Slica: hay dùng/ SK pha thuận. Bề mặt có nhiều nhóm silanol dạng tự do. Hấp phụ mạnh, pH ổn định 2-8. - Alumina: pH ổn định 2-12. Tách các base hữu cơ. - Titan oxyd và zirconi oxyd: pH ổn định rộng. * Pha động: Sử dụng các dung môi hữu cơ thông dụng 67 2.4. Sắc ký hấp phụ (sắc ký lỏng rắn) 68 69 2.4. Sắc ký hấp phụ (sắc ký lỏng rắn) 70 2.4. Sắc ký hấp phụ (sắc ký lỏng rắn) 71 • Ứng dụng: - Thường tách các chất phân tích có M dưới 5000, ít tan /nước hoặc trong hh nước-dmhc không thích hợp với SK pha đảo. - Tách các đồng phân vị trí các HCHC. - Phân tích các chế phẩm dầu mỏ, thực phẩm, dược phẩm. 2.4. Sắc ký hấp phụ (sắc ký lỏng rắn) • Các loại HPLC: 1. Sắc ký phân bố 2. Sắc ký trao đổi ion 3. Sắc ký lỏng trên gel 4. Sắc ký hấp phụ (sắc ký lỏng rắn) 5. Sắc ký ái lực 6. Sắc ký đồng phân quang học 72 2. PHÂN LOẠI HPLC 2.5. Sắc ký ái lực (affinity chromography) Dùng TT liên kết đặc biệt để làm sạch hoặc phân tích các thành phần trong hỗn hợp. Lưu giữ chất phân tích là do tương tác thuận nghịch và chọn lọc các cặp có trong cơ thể sống như: Kháng nguyên – kháng thể, enzym –cơ chất, hormon – receptor… 73 74 2.5. Sắc ký ái lực 75 • Cố định một thành phần của cặp trên một chất mang rắn làm pha tĩnh đưa vào cột. Mẫu phân tích có thành phần thứ 2 đưa vào cột nhờ pha động (y/cầu pH, dd đệm). Khi mẫu phân tích qua cột, các thành phần khác khuếch tán dễ dàng nên được rửa giải vào pic các chất ko lưu giữ. • Tương tác đặc hiệu giữa phần chọn lọc và phối tử ái lực trong cột. • Nhờ dd đệm rửa giải phá vỡ liên kết và đưa thành phần chọn lọc ra cột. 76 2.5. Sắc ký ái lực (affinity chromography) 77 2.5. Sắc ký ái lực 78 2.5. Sắc ký ái lực (affinity chromography) 79 2.5. Sắc ký ái lực (affinity chromography) • Phối tử ái lực: yêu cầu đặc hiệu cao. Một số phối tử hay dùng: 80 Phối tử Chất liên kết 1. Phối tử nguồn gốc sinh học - Kháng thể - Chất ức chế, cơ chất, coenzyme - Protein A/ Protein G - Kháng nguyên - Enzym - Đường, glucoprotein, glucolipid - Kháng thể 2. Phối tử hóa học - Boronat - Chất màu triazin - Phức càng cua kim loại - Đường, glucoprotein, các hc diol - Protein có liên kết nucleosid, các enzym - Acid amin, peptid, protein 2.5. Sắc ký ái lực (affinity chromography) • Các loại hình sắc ký ái lực: - SK ái lực sinh học: chủ yếu tinh chế enzym - SK ái lực miễn dịch: Phối tử là kháng nguyên hoặc kháng thể, chủ yếu tinh chế và PT các chất có nguồn gốc sinh học. - SKAL phối tử phẩm màu: dùng triazin hoặc triphenylmethan làm phối tử ái lực để tinh chế enzym, hoặc các PT sinh học khác. 81 2.5. Sắc ký ái lực (affinity chromography) 82 2.5. Sắc ký ái lực (affinity chromography) • Các loại HPLC: 1. Sắc ký phân bố 2. Sắc ký trao đổi ion 3. Sắc ký lỏng trên gel 4. Sắc ký hấp phụ (sắc ký lỏng rắn) 5. Sắc ký ái lực 6. Sắc ký đồng phân quang học 83 2. PHÂN LOẠI HPLC 2.6. Sắc ký đồng phân quang học • Mục đích: Tách các đồng phân quang học. • Pha tĩnh thường dùng là slica có gắn cyclodextrin có khả năng liên kết với các đồng phân đối quang ở các mức năng lượng khác nhau. 84 85 2.6. Sắc ký đồng phân quang học 86 2.6. Sắc ký đồng phân quang học 87 2.6. Sắc ký đồng phân quang học 88 2.6. Sắc ký đồng phân quang học Tóm lại: Cơ chế của các loại HPLC 89 SK hấp phụ SK phân bố SK đồng phân quang học SK trao đổi ion SK ái lực SK trên gel 90 3. HỆ THỐNG MÁY HPLC 3. HỆ THỐNG MÁY HPLC • Bao gồm các bộ phận: - Hệ thống cấp pha động - Bơm sắc ký lỏng - Bộ phận tiêm mẫu - Cột và pha tĩnh - Detector - Hệ thu nhận và xử lý dữ liệu 91 92 System Controller UV detector Auto sampler Column Oven Pump Unit Reservior Tray Degassing Unit Low pressure gradient device 3. HỆ THỐNG MÁY HPLC 3. HỆ THỐNG MÁY HPLC • Bao gồm các bộ phận: - Hệ thống cấp pha động - Hệ thống bơm - Bộ phận tiêm mẫu - Cột và pha tĩnh - Detector 93 3.1. Hệ thống cấp pha động Pha động thường là 2 dung môi hòa tan vào nhau để tách với độ phân giải phù hợp. Có 2 cách dùng pha động rửa giải: • Đẳng dòng: thành phần ko thay đổi/ qt sắc ký • Gradient: Tỷ lệ dung môi thay đổi theo chương trình đã định. 94 3. HỆ THỐNG MÁY HPLC 95 95 Long Time Analysis MeOH / H2O = 6 / 4 ( Column : ODS ) Bad Separation MeOH / H2O = 8 / 2 Đẳng dòng Đẳng dòng MeOH% Time Gradient 3. HỆ THỐNG MÁY HPLC 96 96 Isocratic System Simple system with one pump and one solvent reservoir. If more than one solvent is used, solvents should be premixed. Data processor Pump Injector Column Oven Detector Mobile Phase 97 High-pressure Gradient System Data processor pump pump pump A B C Injector Column Oven Detector Mixer • Excellent gradient accuracy. • 2-3 pumps required - one pump per solvent used. • Một vài loại khí tan /DMHC, khi áp suất cao được bơm, sự hình thành bong bóng khí tăng làm ảnh hưởng đến qt tách, giảm hiệu lực cột, nhiễu đường nền và hình dạng của đỉnh. • Do đó việc loại khí là rất quan trọng và nó có thể được thực hiện bằng nhiều cách khác nhau: chạy siêu âm, sục khí trơ heli… 98 3.1. Hệ thống cấp pha động • Lọc chân không: không phải là luôn luôn đáng tin cậy và đầy đủ. • Đưa khí Heli: cho khi heli vào dung môi, rất hiệu quả nhưng Heli rất đắt. • Siêu âm: sử dụng siêu âm làm chuyển đổi tần số cực cao thành rung động cơ học 99 3.1. Hệ thống cấp pha động 3. HỆ THỐNG MÁY HPLC • Bao gồm các bộ phận: - Hệ thống cấp pha động - Hệ thống bơm - Bộ phận tiêm mẫu - Cột và pha tĩnh - Detector 100 101 3.2. Hệ thống bơm • Tạo áp suất khoảng 5000 psi trở lên • Các vật liệu trong bơm chịu được tác động của các dmôi (ko bị ăn mòn). Bơm, van mẫu, cột… được chế từ kim loại titan (tránh ảnh hưởng đến mẫu sinh học) • Đảm bảo tốc độ dòng chảy dao động từ 0,01 -10 ml / phút • Bơm phải có khả năng lấy dmôi từ một bình chứa hoặc nhiều bình chứa có chứa dmôi khác nhau cùng một lúc. 102 3.2. Hệ thống bơm 103 Các loại bơm trong HPLC Bơm đẩy một piston Bơm đầy nhanh Bơm kéo đẩy 3.2. Hệ thống bơm 104 • Nhược điểm: dòng chảy xuất hiện xung dòng, gây nhiễu detector, giảm độ nhạy. Bơm đẩy một pistong 3.2. Hệ thống bơm 105 105 motor and cam plunger plunger seal check valve pump head 5 - 50µL out in Mobile phase check valve Bơm đẩy một pistong 106 106 106 motor and cam plunger plunger seal check valve pump head 5 - 50µL out in Mobile phase check valve Bơm đẩy một pistong • Dung môi được bơm qua lại bằng một động cơ piston • Hai van kiểm tra mở và đóng kiểm soát lưu lượng • Piston tiếp xúc trực tiếp với dung môi • Thể tích nội bộ nhỏ 35- 400μL • Áp suất ra cao đến 10.000 psi • Khả năng thích ứng tạo hệ dung môi gradient và tốc độ dòng chảy liên tục 107 Bơm đẩy một pistong Bơm làm đầy nhanh 108 Hay dùng Rẻ 3.2. Hệ thống bơm Bơm kéo đẩy kéo Kết nối hai bơm một pistong 109 3.2. Hệ thống bơm 3. HỆ THỐNG MÁY HPLC • Bao gồm các bộ phận: - Hệ thống cấp pha động - Hệ thống bơm - Bộ phận tiêm mẫu - Cột và pha tĩnh - Detector 110 3.3. Hệ tiêm mẫu 111 3.3. Hệ tiêm mẫu • Dung dịch được tiêm thẳng vào pha động cao áp ngay ở đầu cột mà ko cần dừng dòng bằng một van tiêm có vòng chứa mẫu. • Van tiêm tự động hóa, máy tính điều khiển, kiểm soát hệ bơm mẫu tự động 112 3. HỆ THỐNG MÁY HPLC • Bao gồm các bộ phận: - Hệ thống cấp pha động - Hệ thống bơm - Bộ phận tiêm mẫu - Cột và pha tĩnh - Detector 113 3.4. Cột và pha tĩnh 114 3.4. Cột và pha tĩnh 115 Đầu vào Cột bảo vệ Vỏ bảo vệ bằng nhôm Đầu ra Cột chính 3.4. Cột và pha tĩnh 116 Cột chế tạo bằng thép không gỉ, thủy tinh, chất dẻo - Dài 10-30cm, đường kính trong 4-10 mm. - Cột nhồi có cỡ hạt 5-10micromet - Chất nhồi cột: silic dioxyd, các hạt gel, nhôm oxyd, polymer xốp, nhựa trao đổi ion… tùy thuộc vào sắc ký. • Đặt trước cột sắc ký • Bảo vệ và kéo dài tuổi thọ của cột tách. • Ngắn hơn cột sắc ký, được nhồi hạt cùng loại nhưng có kích thước hạt lớn hơn 117 Cột bảo vệ (guard column) 3.4. Cột và pha tĩnh Điều nhiệt cột • Để có được sắc ký đồ tốt hơn và có thể lặp lại được, cần duy trì nhiệt độ cột ổn định. • Thường trong sắc ký lỏng, vận hành ở RT ko cần điều nhiệt cột (sắc ký khí phải có). Các máy HPLC hiện đại thường có thêm hệ thống điều nhiệt cột có thể lên đến 150oC 118 3.4. Cột và pha tĩnh 3. HỆ THỐNG MÁY HPLC • Bao gồm các bộ phận: - Hệ thống cấp pha động - Hệ thống bơm - Bộ phận tiêm mẫu - Cột và pha tĩnh - Detector 119 3.4. Detector • Phát hiện các chất phân tích có thể dựa vào: • Đáp ứng chọn lọc với chất phân tích khi detector hấp thụ bức xạ UV hoặc huỳnh quang. • Tính chất chung của chất phân tích trong pha động, như detector chỉ số khúc xạ, độ dẫn điện 120 Hiện nay có nhiều loại detector, thường dùng 6 loại thuộc 2 nhóm quang học và điện hóa: 1. Detector hấp thụ UV-VIS 2. Detector huỳnh quang 3. Detector chỉ số khúc xạ 4. Detector tán xạ bay hơi 5. Detector đo dòng 6. Detector hấp thụ UV-VIS 121 3.4. Detector • Detector hấp thụ UV-VIS - Phổ biến nhất, dựa trên sự hấp thụ bức xạ UV-VIS Ba cấu hình của detector hấp thụ UV-VIS: + Detector có bước sóng cố định + Detector đo ở bước sóng thay đổi: có bộ thay đổi bước sóng + Detector mảng diod 122 3.4. Detector 123 124 Spectra Absorbance Chromatogram 125 • Detector chỉ số khúc xạ 126 Sample Reference Photodiode W Lamp Refraction 3.4. Detector 127 • Detector huỳnh quang: Rất nhạy, chọn lọc. Dùng trong phân tích vết. 128 128 3.4. Detector • Ưu điểm: - Độ nhạy cao hơn máy dò UV-Vis - Tính chọn lọc cao vì ít chất có huỳnh quang • Nhược điểm: - Khó đoán được huỳnh quang - Bị ảnh hưởng lớn bởi môi trường: Dung môi, pH, nhiệt độ, độ nhớt, cường độ ion, khí tan 129 129 Detector tán xạ bay hơi: Là detector vạn năng đ/ứng với bất kỳ chất ptích nào kém bay hơi hơn so với pha động của sk lỏng 130 3.4. Detector Detector điện hóa: Phát hiện chất ptích dựa vào độ dẫn điện của pha động có mặt các chất ptích ion hoặc dòng điện tạo thành do p/ứ oxy hóa khử ở điện thế xác định Có 2 loại: - Detector độ dẫn: Thích hợp sk ion, chất phân tích là ion mang điện. - Detector đo dòng: Loại này nhạy nhất, điện cực dễ bị nhiễm bẩn 131 3.4. Detector 4. CÁC ĐẠI LƯỢNG ĐẶC TRƯNG 4.1. Hằng số cân bằng K Là tỉ lệ phân bố giữa 2 pha được tính như sau: Với CS: nồng độ cấu tử trong pha tĩnh. CM: nồng độ cấu tử trong pha động. Hệ số K tùy thuộc vào bản chất pha tĩnh, pha động và chất phân tích. 132 4.2. Thời gian lưu tR : thời gian lưu của một cấu tử từ khi vào cột đến detector. tO : thời gian để cho chất nào đó không có ái lực với pha tĩnh đi qua cột; cũng là thời gian pha động đi từ đầu cột đến cuối cột (còn gọi là thời gian lưu chết). tR' : thời gian lưu thật của một cấu tử. 133 4. CÁC ĐẠI LƯỢNG ĐẶC TRƯNG 134 4.3. Hệ số dung lương k’ Với VS : thể tích pha tĩnh VM : thể tích pha động Nếu k’~ 0, tR~ tM: chất ra rất nhanh, cột không có khả năng giữ chất lại. Nếu k’ càng lớn (tR càng lớn): chất ở trong cột càng lâu, thời gian phân tích càng lâu, mũi có khả năng bị tù. Khoảng k’ lý tưởng là 2-5, nhưng khi phân tích một hỗn hợp phức tạp, k’ có thể chấp nhận từ 1-20. 4. CÁC ĐẠI LƯỢNG ĐẶC TRƯNG 4.4. Số đĩa lý thuyết N đặc trưng cho khả năng tách mũi sắc ký của các cấu tử trên cột. N càng lớn, hiệu năng tách càng cao. Với: W1/2 là chiều rộng mũi sắc ký ở vị trí ½ chiều cao mũi W: chiều rộng mũi sắc ký ở vị trí đáy mũi 135 4. CÁC ĐẠI LƯỢNG ĐẶC TRƯNG 4.5. Độ chọn lọc Đặc trưng cho khả năng tách hai chất của cột. Thông thường, α dao động 1,05-2 là tốt. Nếu α càng lớn thì thời gian chạy sắc ký sẽ kéo dài. 136 4. CÁC ĐẠI LƯỢNG ĐẶC TRƯNG 4.6. Độ phân giải Là đại lượng biểu thị rõ cả ba khả năng của cột sắc ký: sự giải hấp phụ, sự chọn lọc và hiệu quả tách. Nó được xác định qua phương trình sau: 137 4. CÁC ĐẠI LƯỢNG ĐẶC TRƯNG Bài 1. Khi chạy sắc ký một hỗn hợp 2 chất A và B thu được thời gian lưu lần lượt là 10,8 phút và 11,7 phút, chiều dài của cột là 40 cm. Một chất không lưu giữ qua cột ở 1,7 phút. Chiều rộng đáy pic của A và B tương ứng là 1,51 phút và 1,65 phút. Tính: a. Tính số đĩa trung bình? b. Hệ số chọn lọc cho A và B? c. Độ phân giải? 138 Tên chất tR (phút) W1/2 (phút) Chất không lưu giữ 1,9 - A 10,1 0,77 B 10,4 0,83 C 13,5 1,07 139 Bài 2. Dữ kiện sau thu được bằng sắc ký trên cột dài 40 cm Tính: a. Số đĩa lý thuyết trung bình của cột? b. Chiều cao của đĩa? c. Độ phân giải giữa: B và A, A và C. 140 141

More Related Content

Sac ky long hieu nang cao hplc

  • 1. SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO- HPLC (High Performance Liquid Chromatography)
  • 2. SẮC KÝ 2
  • 3. MỤC TIÊU HỌC TẬP 1. Giải thích được nguyên tắc hoạt động của máy HPLC 2. Trình bày được cấu tạo của máy HPLC 3. Mô tả được các kỹ thuật của HPLC: sắc ký phân bố, sắc ký hấp thụ, sắc ký trao đổi ion, sắc ký trên gel, sắc ký ái lực và sắc ký huỳnh quang. 4. Vận dụng tính toán các chỉ số trong điều kiện chạy HPLC. 3
  • 4. Sắc ký được ĐN là pp tách một hỗn hợp các chất thành các chất riêng. Kỹ thuật này dựa trên sự khác nhau về tốc độ di chuyển các chất của hỗn hợp qua pha tĩnh dưới ảnh hưởng của một số dung môi hoặc khí (pha động). 4 SẮC KÝ
  • 5. SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO • Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ra đời năm 1967-1968 trên cơ sở phát triển và cải tiến từ PP sắc ký cột cổ điển. • HPLC là một PP chia tách trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã được biến bằng LKHH với các nhóm chức HC 5
  • 6. 6 Carbohydrates 1. fructose 2. Glucose 3. Saccharose 4. Palatinose 5. Trehalulose 6. isomaltose Zorbax NH2 (4.6 x 250 mm) 70/30 Acetonitrile/Water 1 mL/min Detect=Refractive Index 1 2 3 4 5 mAU time 6
  • 7. 7 Separations Separation in based upon differential migration between the stationary and mobile phases. Stationary Phase - the phase which remains fixed in the column, e.g. C18, Silica Mobile Phase - carries the sample through the stationary phase as it moves through the column. Injector Detector Column Solvents Mixer Pumps High Performance Liquid Chromatograph Waste
  • 8. 8 Separations Injector Detector Column Solvents Mixer Pumps Chromatogram Start Injection mAU time High Performance Liquid Chromatograph
  • 9. 9 Separations Injector Detector Column Solvents Mixer Pumps Chromatogram Start Injection mAU time
  • 10. 10 Separations Injector Detector Column Solvents Pumps Mixer Chromatogram Start Injection mAU time
  • 11. 11 Separations Injector Detector Column Solvents Pumps Mixer Chromatogram Start Injection mAU time
  • 12. 12 Separations Injector Detector Column Solvents Pumps Mixer Chromatogram Start Injection mAU time
  • 13. 13 Separations Injector Detector Column Solvents Pumps Mixer Chromatogram Start Injection mAU time
  • 14. 14 Separations Injector Detector Column Solvents Pumps Mixer Chromatogram Start Injection mAU time
  • 15. 15 Separations Injector Detector Column Solvents Pumps Mixer Chromatogram Start Injection mAU time
  • 16. 16 Separations Injector Detector Column Solvents Pumps Mixer Chromatogram Start Injection mAU time
  • 17. 17 Separations Injector Detector Column Solvents Pumps Mixer Chromatogram Start Injection mAU time
  • 18. 18 Separations Injector Detector Column Solvents Pumps Mixer Chromatogram Start Injection mAU time
  • 19. 19 Separations Injector Detector Column Solvents Pumps Mixer Chromatogram Start Injection mAU time
  • 20. 20 Separations Injector Detector Column Solvents Pumps Mixer Chromatogram Start Injection mAU time
  • 21. 21 Separations Injector Detector Column Solvents Pumps Mixer Chromatogram Start Injection mAU time
  • 22. 22 Separations Injector Detector Column Solvents Pumps Mixer Chromatogram Start Injection mAU time
  • 23. 23 Separations Tiêm Detector Cột Dung môi Bơm Bắt đầu tiêm mẫu mAU Thời gian
  • 24. 24 The Chromatogram Tiêm to tR mAU Thời gian tR Vùng diện tích (chiều cao) để định lượng
  • 25. Tại sao lại dùng HPLC • Phân tích đồng thời • Độ phân giải cao • Độ nhạy cao • Tính lặp lại tốt • Điều kiện phân tích trung bình • Dễ phân đoạn và tinh khiết • Không độc hại 25
  • 26. • Trọng lượng phân tử của chất tan • Độ tan trong nước của chất tan • Sự phân cực của chất tan • Tính chất ion hóa, tính chất không ion của chất tan 26 Các loại HPLC phụ thuộc vào: 2. PHÂN LOẠI HPLC
  • 27. 2. PHÂN LOẠI HPLC Dựa vào sự khác nhau về cơ chế tách chiết sử dụng trong HPLC, người ta chia HPLC thành các loại: 1. SK phân bố 2. SK trao đổi ion hiệu năng cao. 3. SK lỏng hiệu năng cao trên gel 4. SK hấp phụ (sắc ký lỏng rắn) 5. SK ái lực 6. SK đồng phân quang học 27
  • 28. 2. PHÂN LOẠI HPLC 28
  • 29. • Pha tĩnh là yếu tố quan trọng quyết định bản chất quá trình sắc ký. 29 Pha tĩnh Loại sắc ký Chất hấp phụ SK hấp phụ pha thuận hoặc pha đảo Chất trao đổi ion SK trao đổi ion Chất lỏng SK phân bố (SK chiết) Gel SK gel hoặc rây phân tử 2. PHÂN LOẠI HPLC
  • 30. • Các loại HPLC: 1. Sắc ký phân bố 2. Sắc ký trao đổi ion 3. Sắc ký lỏng trên gel 4. Sắc ký hấp phụ (sắc ký lỏng rắn) 5. Sắc ký ái lực 6. Sắc ký đồng phân quang học 30 2. PHÂN LOẠI HPLC
  • 31. • Các loại HPLC: 1. Sắc ký phân bố 2. Sắc ký trao đổi ion. 3. Sắc ký lỏng trên gel 4. Sắc ký hấp phụ (sắc ký lỏng rắn) 5. Sắc ký ái lực 6. Sắc ký đồng phân quang học 31 2. PHÂN LOẠI HPLC
  • 32. 1. Sắc ký phân bố (partition chromatography) SK phân bố được ứng dụng nhiều nhất vì có thể phân tích được những hợp chất từ không phân cực đến những hợp chất rất phân cực, hợp chất ion có khối lượng phân tử không quá lớn (<3000). 32 PHÂN LOẠI HPLC
  • 33. 33 Pha tĩnh là những hợp chất hữu cơ được gắn lên chất mang rắn silica hoặc cấu thành từ silica theo hai kiểu: • Pha tĩnh được giữ lại trên chất mang rắn bằng cơ chế hấp phụ vật lý → sắc ký lỏng-lỏng (liquid-liquid chromatography). • Pha tĩnh liên kết hóa học với chất nền → sắc ký pha liên kết 2.1. Sắc ký phân bố
  • 34. • Trong quá trình sử dụng, người ta nhận thấy sắc ký pha liên kết có nhiều ưu điểm hơn sắc ký pha lỏng-lỏng do: – Pha tĩnh trong hệ sắc ký lỏng-lỏng dễ bị hòa tan bởi pha động nên dễ bị mất mát pha tĩnh trong thời gian sử dụng và gây nhiễm đối với hợp chất phân tích. – Do pha tĩnh của sắc ký lỏng-lỏng dễ tan trong pha động nên người ta không thể ứng dụng phương pháp rửa giải gradient dung môi. 34 2.1. Sắc ký phân bố
  • 35. Pha tĩnh • Hay dùng: dẫn chất siloxan • Tính chất phân cực phụ thuộc vào các nhóm thế: - Pha tĩnh ko phân cực: nhóm thế là các gốc hydrocarbon no hoặc thơm. - Pha tĩnh phân cực: có các nhóm thế phân cực như amino, nhóm –OH, nhóm cyano (-CN). Chú ý: Thường chỉ bên pH từ 2-8. (các pH >8 thì chuyển sang cột polymer) 35 2.1. Sắc ký phân bố
  • 36. 36
  • 37. Ảnh hưởng của pha tĩnh 37 37 C18 (ODS) Mạnh C8 MẪU MẪU MẪU C4 Trung bình Yếu 2.1. Sắc ký phân bố
  • 38. Dựa trên độ phân cực tương đối giữa pha tĩnh và pha động, Sk phân bố được chia 2 loại : + Sắc ký pha thường (SK pha thuận): Pha tĩnh phân cực > Pha động + Sắc ký pha đảo: Pha tĩnh phân cực < pha động. 38 2.1. Sắc ký phân bố
  • 39. • SKPĐ là thuật ngữ để chỉ một loại SK trong đó pha tĩnh ít phân cực hơn pha động. PP này dùng phân tích các HC từ ko phân cực đến phân cực. • Hầu hết các HCHC có mạch carbon dài (ít phân cực) rất thích hợp cho phân tích bằng SKPĐ. Dung môi sử dụng trong SKPĐ là các DM phân cực, trong đó nước đóng vai trò quan trọng, rẻ tiền. Do đó, SKPĐ được ứng dụng nhiều và phổ biến hơn SKPT. 39 2.1. Sắc ký phân bố
  • 40. Đặc điểm: - Sắc ký pha thuận: Chất ít phân cực nhất được rửa giải đầu tiên → khi tăng độ phân cực của pha động, thời gian lưu giảm. - Sắc ký pha đảo: Ngược lại, các chất phân cực được rửa giải đâu tiên → khi tăng độ phân cực của pha động thì thời gian lưu tăng lên. 40 2.1. Sắc ký phân bố
  • 41. Mối quan hệ giữa độ phân cực và thởi gian lưu 41 2.1. Sắc ký phân bố
  • 42. Nguyên tắc chọn pha tĩnh, pha động Chọn pha tĩnh và pha động dựa vào độ phân cực của các thành phần tham gia theo nguyên tắc: 1. Độ p/cực của chất PT hợp với độ p/cực của pha tĩnh, và khác xa độ p/cực của pha động. 2. Độ p/cực của chất PT hợp với độ p/cực của pha động và khác nhiều độ p/cực của pha tĩnh. 42 2.1. Sắc ký phân bố
  • 43. 2.1. Sắc ký phân bố Pha tĩnh của SK pha đảo 43
  • 44. Ứng dụng: chủ yếu SK pha đảo 44 2.1. Sắc ký phân bố Lĩnh vực Đối tượng phân tích Dược Kháng sinh, giảm đau, an thần, steroid Hóa sinh Aminoacid, protein, lipid, carbonhydrat Thực phẩm Chất làm ngọt, phụ gia, chất chống oxy hóa.. Hóa CN HC thơm, chất màu, chất hđ bề mặt Môi trường Các chất trừ sâu diệt cỏ, dẫn chất phenol Hóa pháp lý Các chất độc, thuốc ngủ Y học lâm sàng Acid mật, các chất chuyển hóa của thuốc
  • 45. • Các loại HPLC: 1. Sắc ký phân bố 2. Sắc ký trao đổi ion 3. Sắc ký lỏng trên gel 4. Sắc ký hấp phụ (sắc ký lỏng rắn) 5. Sắc ký ái lực 6. Sắc ký đồng phân quang học 45 2. PHÂN LOẠI HPLC
  • 46. 2.2. Sắc ký trao đổi ion • Dựa vào lực hút của ion chất tan và vị trí mang điện tích trên pha tĩnh. • Chất trao đổi anion có nhóm mang điện tích (+) trên pha tĩnh hút anion chất tan. • Chất trao đổi cation có nhóm mang điện tích (-) trên pha tĩnh hút cation chất tan. • Chất trao đổi ion là polymer không tan trong nước mang các nhóm trao đổi ion. 46
  • 47. 47 2.2. Sắc ký trao đổi ion
  • 48. 48 2.2. Sắc ký trao đổi ion
  • 49. Có 2 loại nhựa trao đổi ion: - Nhựa trao đổi cation: loại acid mạnh mang nhóm acid sulfonic, loại yếu mang nhóm acid carboxylic. - Nhựa trao đổi anion: có nhóm base amin liên kết với phân tử polymer. Chất trao đổi base mạnh có nhóm amin bậc 4, dạng base yếu có nhóm amin bậc 2 hoặc bậc 3. 49 2.2. Sắc ký trao đổi ion
  • 50. 50 copolymer styren - divinyl benzen 2.2. Sắc ký trao đổi ion
  • 51. Một số nhóm hoạt động của nhựa trao đổi ion 51 Loại Viết tắt Tên Cấu tạo 1. Trao đổi cation - Acid mạnh -Acid trung bình - Acid yếu P SE P CM Sulfopropyl Sulfoethyl Phosphat Carboxymethyl -O(CH2)3- SO3H -O(CH2)2-SO3H -OPO3H -OCH2-COOH 2. Trao đổi anion - Base mạnh Base trung bình - Base yếu TEAE QAE DEAE PAB Trimethylaminpethyl Diethyl (2- hydroxypropylquartern aryamino Diethylaminoethyl P-amino benzyl -O(CH2)N+(CH2CH3)3 -O(CH2)2N+(CH2CH3)2 CH2CH(OH)-CH3 -O(CH2)2N(CH2CH3)2 -O-CH2-C6H4-NH2
  • 52. Ứng dụng: 52 2.2. Sắc ký trao đổi ion
  • 53. - Dùng cân bằng trao đổi ion để tinh chế nguyên liệu loại tạp chất. Ví dụ các ion kim loại M2+ và anion X- để điều chế nước tinh khiết (nước khử ion) -Dùng nhựa trao đổi ion để tăng nồng độ của các thành phần vi lượng trong dung dịch đủ cho phân tích. - Áp dụng cho sắc ký 53 2.2. Sắc ký trao đổi ion Ứng dụng:
  • 54. • Các loại HPLC: 1. Sắc ký phân bố 2. Sắc ký trao đổi ion 3. Sắc ký lỏng trên gel 4. Sắc ký hấp phụ (sắc ký lỏng rắn) 5. Sắc ký ái lực 6. Sắc ký đồng phân quang học 54 2. PHÂN LOẠI HPLC
  • 55. • Nguyên lý: Tách riêng các chất dựa vào KT phân tử. • Ko có liên kết hoặc tương tác hấp phụ với pha tĩnh. • Các gel có vai trò như các sàng phân tử các chất có KTPT khác nhau được tách riêng ra. Có các loại: - SK thấm gel: dùng gel để tách các polymer hòa tan/dung môi. Pha động kỵ nước. - Sắc ký lọc gel: dùng gel để tách các polymer sinh học. Pha động ưa nước 55 2.3. Sắc ký lỏng trên gel
  • 56. 56 2.3. Sắc ký lỏng trên gel
  • 57. 57 2.3. Sắc ký lỏng trên gel
  • 58. 58 2.3. Sắc ký lỏng trên gel
  • 59. 59
  • 60. Pha tĩnh (có các lỗ xốp): • Các loại gel mềm hay dùng: cellulose, dextran, agarose hoặc poly acrylamid. • Các gel cứng bán cứng: polystyren, alkyl dextran trong môi trường không chứa nước. 60 2.3. Sắc ký lỏng trên gel
  • 61. 61 2.3. Sắc ký lỏng trên gel
  • 62. 62
  • 63. • Các loại HPLC: 1. Sắc ký phân bố 2. Sắc ký trao đổi ion 3. Sắc ký lỏng trên gel 4. Sắc ký hấp phụ (sắc ký lỏng rắn) 5. Sắc ký ái lực 6. Sắc ký đồng phân quang học 63 2. PHÂN LOẠI HPLC
  • 64. • Nguyên tắc tách là sự hấp phụ của chất phân tích trên bề mặt pha rắn. • Pha tĩnh là chất rắn phân cực. Chất phân tích tranh chấp với pha động ở các vị trí hấp phụ trên bề mặt pha tĩnh. 64 2.4. Sắc ký hấp phụ (sắc ký lỏng rắn)
  • 65. 65 Sự khác nhau giữa SK phân bố và SK hấp phụ
  • 66. 66 Pha tĩnh Tương tác mạnh Tương tác yếu Mobile Phase 2 1 2.4. Sắc ký hấp phụ (sắc ký lỏng rắn)
  • 67. • Pha tĩnh: - Slica: hay dùng/ SK pha thuận. Bề mặt có nhiều nhóm silanol dạng tự do. Hấp phụ mạnh, pH ổn định 2-8. - Alumina: pH ổn định 2-12. Tách các base hữu cơ. - Titan oxyd và zirconi oxyd: pH ổn định rộng. * Pha động: Sử dụng các dung môi hữu cơ thông dụng 67 2.4. Sắc ký hấp phụ (sắc ký lỏng rắn)
  • 68. 68
  • 69. 69 2.4. Sắc ký hấp phụ (sắc ký lỏng rắn)
  • 70. 70 2.4. Sắc ký hấp phụ (sắc ký lỏng rắn)
  • 71. 71 • Ứng dụng: - Thường tách các chất phân tích có M dưới 5000, ít tan /nước hoặc trong hh nước-dmhc không thích hợp với SK pha đảo. - Tách các đồng phân vị trí các HCHC. - Phân tích các chế phẩm dầu mỏ, thực phẩm, dược phẩm. 2.4. Sắc ký hấp phụ (sắc ký lỏng rắn)
  • 72. • Các loại HPLC: 1. Sắc ký phân bố 2. Sắc ký trao đổi ion 3. Sắc ký lỏng trên gel 4. Sắc ký hấp phụ (sắc ký lỏng rắn) 5. Sắc ký ái lực 6. Sắc ký đồng phân quang học 72 2. PHÂN LOẠI HPLC
  • 73. 2.5. Sắc ký ái lực (affinity chromography) Dùng TT liên kết đặc biệt để làm sạch hoặc phân tích các thành phần trong hỗn hợp. Lưu giữ chất phân tích là do tương tác thuận nghịch và chọn lọc các cặp có trong cơ thể sống như: Kháng nguyên – kháng thể, enzym –cơ chất, hormon – receptor… 73
  • 74. 74 2.5. Sắc ký ái lực
  • 75. 75
  • 76. • Cố định một thành phần của cặp trên một chất mang rắn làm pha tĩnh đưa vào cột. Mẫu phân tích có thành phần thứ 2 đưa vào cột nhờ pha động (y/cầu pH, dd đệm). Khi mẫu phân tích qua cột, các thành phần khác khuếch tán dễ dàng nên được rửa giải vào pic các chất ko lưu giữ. • Tương tác đặc hiệu giữa phần chọn lọc và phối tử ái lực trong cột. • Nhờ dd đệm rửa giải phá vỡ liên kết và đưa thành phần chọn lọc ra cột. 76 2.5. Sắc ký ái lực (affinity chromography)
  • 77. 77 2.5. Sắc ký ái lực
  • 78. 78 2.5. Sắc ký ái lực (affinity chromography)
  • 79. 79 2.5. Sắc ký ái lực (affinity chromography)
  • 80. • Phối tử ái lực: yêu cầu đặc hiệu cao. Một số phối tử hay dùng: 80 Phối tử Chất liên kết 1. Phối tử nguồn gốc sinh học - Kháng thể - Chất ức chế, cơ chất, coenzyme - Protein A/ Protein G - Kháng nguyên - Enzym - Đường, glucoprotein, glucolipid - Kháng thể 2. Phối tử hóa học - Boronat - Chất màu triazin - Phức càng cua kim loại - Đường, glucoprotein, các hc diol - Protein có liên kết nucleosid, các enzym - Acid amin, peptid, protein 2.5. Sắc ký ái lực (affinity chromography)
  • 81. • Các loại hình sắc ký ái lực: - SK ái lực sinh học: chủ yếu tinh chế enzym - SK ái lực miễn dịch: Phối tử là kháng nguyên hoặc kháng thể, chủ yếu tinh chế và PT các chất có nguồn gốc sinh học. - SKAL phối tử phẩm màu: dùng triazin hoặc triphenylmethan làm phối tử ái lực để tinh chế enzym, hoặc các PT sinh học khác. 81 2.5. Sắc ký ái lực (affinity chromography)
  • 82. 82 2.5. Sắc ký ái lực (affinity chromography)
  • 83. • Các loại HPLC: 1. Sắc ký phân bố 2. Sắc ký trao đổi ion 3. Sắc ký lỏng trên gel 4. Sắc ký hấp phụ (sắc ký lỏng rắn) 5. Sắc ký ái lực 6. Sắc ký đồng phân quang học 83 2. PHÂN LOẠI HPLC
  • 84. 2.6. Sắc ký đồng phân quang học • Mục đích: Tách các đồng phân quang học. • Pha tĩnh thường dùng là slica có gắn cyclodextrin có khả năng liên kết với các đồng phân đối quang ở các mức năng lượng khác nhau. 84
  • 85. 85 2.6. Sắc ký đồng phân quang học
  • 86. 86 2.6. Sắc ký đồng phân quang học
  • 87. 87 2.6. Sắc ký đồng phân quang học
  • 88. 88 2.6. Sắc ký đồng phân quang học
  • 89. Tóm lại: Cơ chế của các loại HPLC 89 SK hấp phụ SK phân bố SK đồng phân quang học SK trao đổi ion SK ái lực SK trên gel
  • 90. 90 3. HỆ THỐNG MÁY HPLC
  • 91. 3. HỆ THỐNG MÁY HPLC • Bao gồm các bộ phận: - Hệ thống cấp pha động - Bơm sắc ký lỏng - Bộ phận tiêm mẫu - Cột và pha tĩnh - Detector - Hệ thu nhận và xử lý dữ liệu 91
  • 92. 92 System Controller UV detector Auto sampler Column Oven Pump Unit Reservior Tray Degassing Unit Low pressure gradient device 3. HỆ THỐNG MÁY HPLC
  • 93. 3. HỆ THỐNG MÁY HPLC • Bao gồm các bộ phận: - Hệ thống cấp pha động - Hệ thống bơm - Bộ phận tiêm mẫu - Cột và pha tĩnh - Detector 93
  • 94. 3.1. Hệ thống cấp pha động Pha động thường là 2 dung môi hòa tan vào nhau để tách với độ phân giải phù hợp. Có 2 cách dùng pha động rửa giải: • Đẳng dòng: thành phần ko thay đổi/ qt sắc ký • Gradient: Tỷ lệ dung môi thay đổi theo chương trình đã định. 94 3. HỆ THỐNG MÁY HPLC
  • 95. 95 95 Long Time Analysis MeOH / H2O = 6 / 4 ( Column : ODS ) Bad Separation MeOH / H2O = 8 / 2 Đẳng dòng Đẳng dòng MeOH% Time Gradient 3. HỆ THỐNG MÁY HPLC
  • 96. 96 96 Isocratic System Simple system with one pump and one solvent reservoir. If more than one solvent is used, solvents should be premixed. Data processor Pump Injector Column Oven Detector Mobile Phase
  • 97. 97 High-pressure Gradient System Data processor pump pump pump A B C Injector Column Oven Detector Mixer • Excellent gradient accuracy. • 2-3 pumps required - one pump per solvent used.
  • 98. • Một vài loại khí tan /DMHC, khi áp suất cao được bơm, sự hình thành bong bóng khí tăng làm ảnh hưởng đến qt tách, giảm hiệu lực cột, nhiễu đường nền và hình dạng của đỉnh. • Do đó việc loại khí là rất quan trọng và nó có thể được thực hiện bằng nhiều cách khác nhau: chạy siêu âm, sục khí trơ heli… 98 3.1. Hệ thống cấp pha động
  • 99. • Lọc chân không: không phải là luôn luôn đáng tin cậy và đầy đủ. • Đưa khí Heli: cho khi heli vào dung môi, rất hiệu quả nhưng Heli rất đắt. • Siêu âm: sử dụng siêu âm làm chuyển đổi tần số cực cao thành rung động cơ học 99 3.1. Hệ thống cấp pha động
  • 100. 3. HỆ THỐNG MÁY HPLC • Bao gồm các bộ phận: - Hệ thống cấp pha động - Hệ thống bơm - Bộ phận tiêm mẫu - Cột và pha tĩnh - Detector 100
  • 101. 101 3.2. Hệ thống bơm
  • 102. • Tạo áp suất khoảng 5000 psi trở lên • Các vật liệu trong bơm chịu được tác động của các dmôi (ko bị ăn mòn). Bơm, van mẫu, cột… được chế từ kim loại titan (tránh ảnh hưởng đến mẫu sinh học) • Đảm bảo tốc độ dòng chảy dao động từ 0,01 -10 ml / phút • Bơm phải có khả năng lấy dmôi từ một bình chứa hoặc nhiều bình chứa có chứa dmôi khác nhau cùng một lúc. 102 3.2. Hệ thống bơm
  • 103. 103 Các loại bơm trong HPLC Bơm đẩy một piston Bơm đầy nhanh Bơm kéo đẩy 3.2. Hệ thống bơm
  • 104. 104 • Nhược điểm: dòng chảy xuất hiện xung dòng, gây nhiễu detector, giảm độ nhạy. Bơm đẩy một pistong 3.2. Hệ thống bơm
  • 105. 105 105 motor and cam plunger plunger seal check valve pump head 5 - 50µL out in Mobile phase check valve Bơm đẩy một pistong
  • 106. 106 106 106 motor and cam plunger plunger seal check valve pump head 5 - 50µL out in Mobile phase check valve Bơm đẩy một pistong
  • 107. • Dung môi được bơm qua lại bằng một động cơ piston • Hai van kiểm tra mở và đóng kiểm soát lưu lượng • Piston tiếp xúc trực tiếp với dung môi • Thể tích nội bộ nhỏ 35- 400μL • Áp suất ra cao đến 10.000 psi • Khả năng thích ứng tạo hệ dung môi gradient và tốc độ dòng chảy liên tục 107 Bơm đẩy một pistong
  • 108. Bơm làm đầy nhanh 108 Hay dùng Rẻ 3.2. Hệ thống bơm
  • 109. Bơm kéo đẩy kéo Kết nối hai bơm một pistong 109 3.2. Hệ thống bơm
  • 110. 3. HỆ THỐNG MÁY HPLC • Bao gồm các bộ phận: - Hệ thống cấp pha động - Hệ thống bơm - Bộ phận tiêm mẫu - Cột và pha tĩnh - Detector 110
  • 111. 3.3. Hệ tiêm mẫu 111
  • 112. 3.3. Hệ tiêm mẫu • Dung dịch được tiêm thẳng vào pha động cao áp ngay ở đầu cột mà ko cần dừng dòng bằng một van tiêm có vòng chứa mẫu. • Van tiêm tự động hóa, máy tính điều khiển, kiểm soát hệ bơm mẫu tự động 112
  • 113. 3. HỆ THỐNG MÁY HPLC • Bao gồm các bộ phận: - Hệ thống cấp pha động - Hệ thống bơm - Bộ phận tiêm mẫu - Cột và pha tĩnh - Detector 113
  • 114. 3.4. Cột và pha tĩnh 114
  • 115. 3.4. Cột và pha tĩnh 115 Đầu vào Cột bảo vệ Vỏ bảo vệ bằng nhôm Đầu ra Cột chính
  • 116. 3.4. Cột và pha tĩnh 116 Cột chế tạo bằng thép không gỉ, thủy tinh, chất dẻo - Dài 10-30cm, đường kính trong 4-10 mm. - Cột nhồi có cỡ hạt 5-10micromet - Chất nhồi cột: silic dioxyd, các hạt gel, nhôm oxyd, polymer xốp, nhựa trao đổi ion… tùy thuộc vào sắc ký.
  • 117. • Đặt trước cột sắc ký • Bảo vệ và kéo dài tuổi thọ của cột tách. • Ngắn hơn cột sắc ký, được nhồi hạt cùng loại nhưng có kích thước hạt lớn hơn 117 Cột bảo vệ (guard column) 3.4. Cột và pha tĩnh
  • 118. Điều nhiệt cột • Để có được sắc ký đồ tốt hơn và có thể lặp lại được, cần duy trì nhiệt độ cột ổn định. • Thường trong sắc ký lỏng, vận hành ở RT ko cần điều nhiệt cột (sắc ký khí phải có). Các máy HPLC hiện đại thường có thêm hệ thống điều nhiệt cột có thể lên đến 150oC 118 3.4. Cột và pha tĩnh
  • 119. 3. HỆ THỐNG MÁY HPLC • Bao gồm các bộ phận: - Hệ thống cấp pha động - Hệ thống bơm - Bộ phận tiêm mẫu - Cột và pha tĩnh - Detector 119
  • 120. 3.4. Detector • Phát hiện các chất phân tích có thể dựa vào: • Đáp ứng chọn lọc với chất phân tích khi detector hấp thụ bức xạ UV hoặc huỳnh quang. • Tính chất chung của chất phân tích trong pha động, như detector chỉ số khúc xạ, độ dẫn điện 120
  • 121. Hiện nay có nhiều loại detector, thường dùng 6 loại thuộc 2 nhóm quang học và điện hóa: 1. Detector hấp thụ UV-VIS 2. Detector huỳnh quang 3. Detector chỉ số khúc xạ 4. Detector tán xạ bay hơi 5. Detector đo dòng 6. Detector hấp thụ UV-VIS 121 3.4. Detector
  • 122. • Detector hấp thụ UV-VIS - Phổ biến nhất, dựa trên sự hấp thụ bức xạ UV-VIS Ba cấu hình của detector hấp thụ UV-VIS: + Detector có bước sóng cố định + Detector đo ở bước sóng thay đổi: có bộ thay đổi bước sóng + Detector mảng diod 122 3.4. Detector
  • 123. 123
  • 124. 124 Spectra Absorbance Chromatogram
  • 125. 125
  • 126. • Detector chỉ số khúc xạ 126 Sample Reference Photodiode W Lamp Refraction 3.4. Detector
  • 127. 127
  • 128. • Detector huỳnh quang: Rất nhạy, chọn lọc. Dùng trong phân tích vết. 128 128 3.4. Detector
  • 129. • Ưu điểm: - Độ nhạy cao hơn máy dò UV-Vis - Tính chọn lọc cao vì ít chất có huỳnh quang • Nhược điểm: - Khó đoán được huỳnh quang - Bị ảnh hưởng lớn bởi môi trường: Dung môi, pH, nhiệt độ, độ nhớt, cường độ ion, khí tan 129 129
  • 130. Detector tán xạ bay hơi: Là detector vạn năng đ/ứng với bất kỳ chất ptích nào kém bay hơi hơn so với pha động của sk lỏng 130 3.4. Detector
  • 131. Detector điện hóa: Phát hiện chất ptích dựa vào độ dẫn điện của pha động có mặt các chất ptích ion hoặc dòng điện tạo thành do p/ứ oxy hóa khử ở điện thế xác định Có 2 loại: - Detector độ dẫn: Thích hợp sk ion, chất phân tích là ion mang điện. - Detector đo dòng: Loại này nhạy nhất, điện cực dễ bị nhiễm bẩn 131 3.4. Detector
  • 132. 4. CÁC ĐẠI LƯỢNG ĐẶC TRƯNG 4.1. Hằng số cân bằng K Là tỉ lệ phân bố giữa 2 pha được tính như sau: Với CS: nồng độ cấu tử trong pha tĩnh. CM: nồng độ cấu tử trong pha động. Hệ số K tùy thuộc vào bản chất pha tĩnh, pha động và chất phân tích. 132
  • 133. 4.2. Thời gian lưu tR : thời gian lưu của một cấu tử từ khi vào cột đến detector. tO : thời gian để cho chất nào đó không có ái lực với pha tĩnh đi qua cột; cũng là thời gian pha động đi từ đầu cột đến cuối cột (còn gọi là thời gian lưu chết). tR' : thời gian lưu thật của một cấu tử. 133 4. CÁC ĐẠI LƯỢNG ĐẶC TRƯNG
  • 134. 134 4.3. Hệ số dung lương k’ Với VS : thể tích pha tĩnh VM : thể tích pha động Nếu k’~ 0, tR~ tM: chất ra rất nhanh, cột không có khả năng giữ chất lại. Nếu k’ càng lớn (tR càng lớn): chất ở trong cột càng lâu, thời gian phân tích càng lâu, mũi có khả năng bị tù. Khoảng k’ lý tưởng là 2-5, nhưng khi phân tích một hỗn hợp phức tạp, k’ có thể chấp nhận từ 1-20. 4. CÁC ĐẠI LƯỢNG ĐẶC TRƯNG
  • 135. 4.4. Số đĩa lý thuyết N đặc trưng cho khả năng tách mũi sắc ký của các cấu tử trên cột. N càng lớn, hiệu năng tách càng cao. Với: W1/2 là chiều rộng mũi sắc ký ở vị trí ½ chiều cao mũi W: chiều rộng mũi sắc ký ở vị trí đáy mũi 135 4. CÁC ĐẠI LƯỢNG ĐẶC TRƯNG
  • 136. 4.5. Độ chọn lọc Đặc trưng cho khả năng tách hai chất của cột. Thông thường, α dao động 1,05-2 là tốt. Nếu α càng lớn thì thời gian chạy sắc ký sẽ kéo dài. 136 4. CÁC ĐẠI LƯỢNG ĐẶC TRƯNG
  • 137. 4.6. Độ phân giải Là đại lượng biểu thị rõ cả ba khả năng của cột sắc ký: sự giải hấp phụ, sự chọn lọc và hiệu quả tách. Nó được xác định qua phương trình sau: 137 4. CÁC ĐẠI LƯỢNG ĐẶC TRƯNG
  • 138. Bài 1. Khi chạy sắc ký một hỗn hợp 2 chất A và B thu được thời gian lưu lần lượt là 10,8 phút và 11,7 phút, chiều dài của cột là 40 cm. Một chất không lưu giữ qua cột ở 1,7 phút. Chiều rộng đáy pic của A và B tương ứng là 1,51 phút và 1,65 phút. Tính: a. Tính số đĩa trung bình? b. Hệ số chọn lọc cho A và B? c. Độ phân giải? 138
  • 139. Tên chất tR (phút) W1/2 (phút) Chất không lưu giữ 1,9 - A 10,1 0,77 B 10,4 0,83 C 13,5 1,07 139 Bài 2. Dữ kiện sau thu được bằng sắc ký trên cột dài 40 cm Tính: a. Số đĩa lý thuyết trung bình của cột? b. Chiều cao của đĩa? c. Độ phân giải giữa: B và A, A và C.
  • 140. 140
  • 141. 141

Từ khóa » Slide Sắc Ký Lỏng Hiệu Năng Cao