SẮC Ký LỎNG HIỆU NĂNG CAO - Tài Liệu Text - 123doc

Tải bản đầy đủ (.pdf) (36 trang)

1. Trang chủ
>>
2. Giáo án - Bài giảng
>>
3. Cao đẳng - Đại học

SẮC ký LỎNG HIỆU NĂNG CAO

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (6.79 MB, 36 trang )

SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO - HPLCHIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHYI-ĐỊNH NGHĨA1-Lịch sử2-Các khái niệmNăm 1967- 1968: Huber, Hulsman, Giddinngs đã công bố phƣơng pháp sắc ký lỏng mớicó tên là SK lỏng tốc độ cao (HSLC), hiệu lực cao (HELC) và ngày nay mang tên chính thức làsắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).HPLC hay Sắc ký lỏng hiệu năng cao là kỹ thuật sắc ký tách hỗn hợp trên cột đƣợc nhồiđầy bằng các hạt có kích thước 10m.Là phƣơng tiện định tính, định lượng hiệu quả trong các Dƣợc điển hiện đại UPS, BP, EP,… trong kiểm nghiệm thuốc và phân tích hóa hợp chất tự nhiên.Do vậy phải dùng một bơm có áp suất cao (high pressure)  300atm để đẩy pha động(Mobile Phase) MP qua cột với tốc độ dòng khoảng vài ml/phút và cho phép phân giải nhanh(High Performance) một lượng mẫu nhỏ cỡ 20g.Quá trình cho chất lỏng đi qua cột gọi là sự rửa giải (ELUTION).Trong quá trình này, chất tan được vận chuyển trong môi trường phân tách bằng mộtdòng chất lỏng hay chất khí đƣợc gọi là chất rửa giải (ELUANT).Dung dịch sau khi qua cột có chứa chất tan đƣợc gọi là dung dịch rửa giải (ELUATE).Pha tĩnh có thể tác động lên chất tan bằng: Cơ chế hấp phụ như trong trường hợp của oxyt nhôm, silicagel đã được hoạt hoá. Cơ chế phân bố giữa pha tĩnh và pha động như trong trường hợp silicagel ghép phađảo. Cơ chế trao đổi ion với các hạt pha tĩnh trao đổi ion.Để tiến hành có kết quả tốt trong HPLC điều quan trọng là phải hiểu thấu đáo về bản chấtcác thành phần của hệ sắc ký gồm: Chất tan ( chất cần phân tích), pha tĩnh pha động.Lực tương tác phân tử đƣợc mô tả một cách định tính chính là độ phân cực tương đối củaba thành phần này.Chất cần phân tích có độ phân cực tăng lên theo các nhóm chức:Hydrocarbon < ether < ester < Cetone < aldhehyde < amide < amine < Alcohol< H2OHóa phân tích 2Trần Trung Trực13Ưu điểm vượt trộiĐộ nhạy, độ chính xác cao.Áp dụng cho hầu hết các hợp chất không bay hơi chịu nhiệt hay dễ bị phân hủy bởi nhiệt, …Giảm thời gian sắc ký,Giảm kích thƣớc hạt,Tăng độ phân giải, …II- CÁC THÀNH PHẦN CƠ BẢN CỦA HPLCA. BÌNH CHỨA DUNG MÔI PHA ĐỘNG1-Đặc điểm, tính chấtDùng loại thủy tinh trung tính, rửa sạch có thể tích từ 100ml  2 lítDùng bình thủy tinh màu nếu chứa những chất nhạy cảm với ánh sáng.Dùng nắp đậy thích hợp để tránh bay hơi dung môi.Bình đƣợc gắn với một ống bằng polytetrafluoroetylen (d=1-3mm) để dẫn pha động từbình chứa đến bơm: Các chất lỏng vào bơm không chứa bụi hay tiểu phân khác vì chúng len lỏi vào các mốihàn gây hại cho bơm và làm nghẽn cột. Pha động phải được lọc trước khi vào bơm bằng màng lọc thép không gỉ được nhấnkhít vào bề mặt của ống polytetrafluoroethylen đặt trong bình chứa.Hóa phân tích 2Trần Trung Trực22-Xử lý dung môi độnga. Lọc qua màng lọc thích hợp tùy theo loại dung môiDung môi là nước: cellulose nitrat hay cellulose acetat kích thƣớc 0,45 và 0,22.Hỗn hợp dung môi hữu cơ và nước: RC (regenerated cenlulose) hay polyamid nylonDung môi hữu cơ: lọc qua màng lọc teflonb. Đầu lọc dung môiThƣờng có kích thƣớc 5  10m cần phải thƣờng xuyên làm vệ sinh (ngâm trong dungdịch acid nitric 5% hoặc methanol+ đánh siêu âm khoảng 15’, rửa lại bằng nước cất đã đượclọc qua màng lọc 0,45m) [lọc chân không].c. Đuổi khí dung môiLọc dƣới áp suất giảmĐuổi khí dung môi bằng siêu âm (Ultrasonic)Đuổi khí dung môi bằng sạc khí heliumd. Nước rửa cột HPLClà nước cất hai lần, phải lọc qua màng lọc 0,45m và đƣợc đánh siêu âm để đuổi khí hoàtan hay khí dưới dạng treo (sức kháng trở 18MΩ).B. BỘ PHẬN KHỬ KHÍ DUNG MÔI (DEGASSER)Là bộ phận quan trọng để loại khí ngay trong bình chứa dung môi hoặc trên dòng chảycủa pha động trƣớc khi dung môi vào bơm.Kỹ thuật khử khí dung môi với Degasser in line là kỹ thuật rẻ tiền so với kỹ thuật sục khíhelium.Dung môi qua hệ thống khử khí sẽ qua màng tổng hợp nhựa đặc biệt, những khí hòatan trong dung môi có ái lực và linh độ cao hơn với màng này so với các phân tử dung môi lỏngvì thế khí đƣợc đuổi ra ngoài hệ thống.Chất lỏng đƣợc khử khí.C. BƠM (PUMP)1-Đặc điểmCó khả năng hoạt động ở áp suất đầu vào khoảng 5000psi (1psi=0.068atm, 1bar=14.7psi).Chịu đƣợc tác động của nhiều dung môi.Đảm bảo lƣợng lặp lại 0.01-10ml/phút.Hóa phân tích 2Trần Trung Trực32-Cấu tạo3-Phân loạia. Đầu bơmHút pha động vào thân bơmĐẩy pha động từ thân bơm vào cột sắc kýb. Thân bơmCó 1 pisston chuyển động qua lại.Khi pisston tiến tới 1 bi đóng lỗ phía cột lại và bi khác nhấc ra để pha động vào thân bơm.Khi pisston lùi lại, 1 bi đóng lỗ phía bình đựng dung môi và mở lỗ phía cột để pha độngvào cột sắc ký.a. Bơm đẳng dòng (isocratic pump)Chỉ lấy đƣợc một loại dung môi không tự động pha trộn đƣợcdung môi.Không tăng tốc độ dòng đột ngột.Theo dõi áp suất bơm trong quá trình phân tích.Định kỳ rửa lọc dung môi đầu vào.Nạp đầy hệ thống HPLC bằng methanol, acetonitril hay hỗnhợp của chúng với nƣớc khi không tiến hành phân tích để tránh nấmmốc phát triển.b. Hệ thống bơm tứ phân (quaternary pump)Lấy đồng thời 4 loại dung môi độngChạy đƣợc chƣơng trình dung môi (gradient) một cách uyển chuyển và đa dạngTiết kiệm dung môiHóa phân tích 2Trần Trung Trực4c. Bơm có áp suất không đổiÁp suất không đổi.Lƣu lƣợng thay đổi.d. Bơm có lưu lượng hằng định.Di chuyển đơn giản (ống tiêm) có lưu lượngthường không đổi, áp suất không đổi.Thân bơm có thể tích nhỏ.Phải làm đầy pha động thƣờng xuyên.Phân loại: Bơm 1 pisston:+ Hệ thống tâm sai+ Lưu lượng không đổi+ Áp suất thay đổi Bơm 2 pisston:+ Áp suất không đổi và hằng định.+ Lưu lượng không đổi; có thể điềuchỉnh bằng motơ.+ Thể tích không bị giới hạn.++Hóa phân tích 2Trần Trung Trực54-Lưu ý khi sử dụng bơm nhị phân và bơm tứ phânTƣơng tự nhƣ bơm đẳng dòng.Phối hợp dung môi hợp lý tránh kết tủa chất điện giải trên đƣợng ống.Dùng dung môi trung gian một cách hợp lý khi phối hợp dung môi.Cân bằng cột bằng hỗn hợp dung môi – nước với tỷ lệ tƣơng tự hỗn hợp dung môi đệm.Rửa kĩ đường ống chứa đệm bằng nước sau khi kết thúc quá trình phân tích, sau đó rửa lạibằng hỗn hợp dung môi ethanol hay acetonitril với nước.D. BỘ PHẬN TIÊM MẪU Không làm xáo trộn chất nhồi trong cột khi đưa mẫu thử vào cột.1-Phương pháp sử dụng syringe trực tiếpa. Đặc điểm, cấu trúcTiêm chính xác đến l để tiêm mẫu qua cột vách ngăn tự liền bằng cao su, Teflon, silicone.Không tƣơng kị với pha động của hệ thống sắc ký.Chịu áp suất cao.Không chứa chất dẻo hóa, chất chống oxy hóa.b. Ưu điểmTiện lợi, đơn giản, hiệu lực caoHạn chế thể tích ngoài cộtc. Nhược điểmĐộ lặp lại không cao vì thể tích mỗi lần bơm khác nhau.Tắt kimNgƣng dòng chảy khi mỗi lần đƣa mẫu vào cột, đợi đến khi áp suất bằng áp suất không khírồi mới thêm.Hóa phân tích 2Trần Trung Trực62-Phương pháp sử dụng van bơm - Kiểu van loopa. Đặc điểmHay sử dụngThể tích thay đổi: 5 – 100 lDùng dưới áp suất cao và tự động hóa được (autosampler)Van tiêm mẫu có thể hoạt động dưới áp suất cao và đƣợc trang bị một loop có thể tích nhất định chứa mẫu(loop: 10, 20, 30, 50 l) đƣợc đƣa vào cột lúc nào cũng hằng định.Lƣợng mẫu bơm vào thƣờng nhiều hơn lƣợng cần thiết (10-100l)b. Ưu điểmHệ thống bơm có thể làm việc dƣới áp suất cao mà không bị gián đoạn dòng chảy nhờ trang bị một loopcó thể tích hằng địnhKhông bị tắt, bị bẩn do các mảnh đệm ngăn (septum)Độ lặp lại caoLoại bỏ sai số mỗi lần tiêm của loại syringe thẳng vào cộtTự động hóa đƣợc (autosampler)3-Bơm mẫu tự động (Autosampler)a. Đặc điểmCũng là phƣơng pháp đưa mẫu phân tích vào cột bằng van bơm với thể tích xác địnhNhƣng hệ thống này sẽ tự động bơm mẫu sau khi cài đặt chƣơng trình điều khiển với thểtích bơm mẫu có thể thay đổi 1-100lb. Ưu điểmĐộ lặp lại caoĐộ chính xác caoCó thể tự động hóa đƣợcHóa phân tích 2Trần Trung Trực7E. CỘT SẮC KÝ1-Tiền cột (pre-column, guard column, scavenger column)Hấp phụ, giữ lại các tiểu phân tạp kích thƣớc nhỏ có thể sẽ gây nghẹt hay phá hủy cộtsắc ký nhằm kéo dài tuổi thọ cột.Cột bảo vệ có tác dụng bão hòa pha động với pha tĩnh làm cho sự mất dung môi là tốithiểu.Cấu tạo chất nhồi cột bảo vệ giống như cột phân tích nhƣng kích thước hạt lớn hơn mộtít, làm áp suất hệ thống tăng lên 200-300psi.Thƣờng 3 tháng phải thay tiền cột hay áp suất cao hơn áp suất lịch sử 50%.2-Cột sắc ký Thép không rỉ hay thủy tinh đặc biệta. Cột phân tíchDài: 10 – 30 cmĐƣờng kính trong: 4 – 10 mmCỡ hạt pha tĩnh: 1.5 – 10 mThƣờng dùng: 15 hay 25 cm x 4 – 6 mm, 5 m, H = 40000 – 60000 đĩa/métHiện nay: 5 – 10 cm x 1 – 4.6 mm, 1.7 m, H = 100.000 đĩa/mét  tiêu tốn ít dung môivà giảm thời gian phân tích.Chất nhồi cột sắc ký lỏng đƣợc chế tạo từ silica (SiO2) bằng cách làm kết tụ các hạt silicađể tạo thành hạt có kích thước lớn hơn có đường kính đều nhau.Các hạt silica gel đƣợc hình thành đƣợc bao bởi lớp mỏng hữu cơ liên kết hóa học và vật lývới bề mặt.Ngoài ra còn sử dụng chất nhồi cột khác nhƣ: oxyd nhôm, polymer xốp, nhựa trao đổiion, … tùy vào loại hình sắc ký.Hóa phân tích 2Trần Trung Trực8b.Cột bán điều chế (semi - preparative column)Đƣờng kính >10mm.Kích thƣớc chất nhồi cột: 10-50m.Tách 100-200mg mẫu thử để phân lập các chất.c. Cột chế hóa – cột điều chế (preparative column)Dài 25 – 100 cmĐƣờng kính trong: 6 mmCột trao đổi ion, cột rây phân tửKích thƣớc hạt > 10 mCó thể tác 0.5-1g mẫu thử. Quy mô công nghiệp có thể đạt tải lƣợng lên đến hàng kg mẫuthử.F. ĐẦU DÒ (DETECTOR)12-Đặc điểmChất tan đi qua đầu dò  tạo những tín hiệu điệnSự thay đổi về độ lớn vật lý chất tan sẽ chuyển thành xung điện và đọc đƣợc trên máy ghi.Sự đáp ứng đầu dò tỷ lệ với lƣợng chất tan, lặp lại và độc lập với chất rửa giải.hấp thụ uv-vis, huỳnh quang, chỉ số khúc xạ, độ dẫn, khuếch tán ánh sáng…Detector lý tưởngĐộ nhạy cao (< 1μg/ml)Độ lặp lại caoĐáp ứng rộng rãi đối với các mẫu cần phân tíchKhông quá nhạy cảm với sự thay đổi của nhiệt, ẩm, tốc độ pha động, …Không phá hỏng mẫu thửVận hành dễ, liên tục, giá thành rẻPhân loạia. Đầu dò quang phổ kế khả kiến và tử ngoại (detector UV-Vis)-i- Nguyên tắcPhổ biến nhất hiện nay trong định lƣợng thƣờng quiNguyên tắc: pha động chứa chất phân tích đƣợc rửa giải từ cột đi ngang qua tế bào đo sẽhấp thụ năng lƣợng bức xạ UV-Vis; chất phân tích có cấu trúc không no hay có màuSự hấp thu bức xạ này bởi các chất tan tuân theo định luật Lambert-BeerDung môi dùng trong trƣờng hợp này không hấp thu hay hấp thu rất ít tại bƣớc sóng phântích; chứa tạp chất cực nhỏ.Hóa phân tích 2Trần Trung Trực9-ii-Cấu tạomộ t)Nguồn ánh sáng đơn sắc (Source of monochromatic light)Đèn kết hợp với kính lọc hay đèn kết hợp bộ tạo ánh sáng đơn sắc.Cho phép chọn 1 bƣớc sóng từ đèn nguồn phát ra ánh sáng trên 1 vùng dải bước sóngrộng.hai)Flow cellKiểu hình chữ “Z”.Cửa sổ là thủy tinh quartz bao lấy 2 đầu ống hình trụ có đường kính 1mm và dài 1cm.ba)Bộ phận đo sự thay đổi cường độ ánh sáng khi đi qua Flow cellLà diod quang (photodiode) hay ống nhân quang (photomultiplier tube)Tín hiệu từ diode quang hay ống nhân quang đƣợc khuếch đại và truyền tới máy ghi(Recorder), Interrator hay máy vi tính.Peak trên sắc ký đồ biểu thị cho sự đáp ứng với các thành phần có thể dùng chúng đƣợckhi rửa giải khỏi cột sắc ký. Chiều cao peak hay diện tích peak của từng thành phần có thể dùngđể xác định nồng độ khi đối chiếu với peak thu đƣợc từ việc tiêm mẫu chuẩn có cùng hoạt chất.-iii-Ưu điểm-iv-Nhược điểmĐộ nhạy cao (3ng/ml), giá thành không quá cao, dễ vận hànhÍt phụ thuộc vào các thay đổi điều kiện (nhiệt độ, tốc độ dòng..)Đòi hỏi dung môi phù hợp và tinh khiếtChọn lọc các chất tan hấp thu trong vùng Uv-visĐộ nhạy thấp hơn UV-Vis.b. Đầu dò dãy diode quang PDAD (Photo-Diode Array Detector)-i-Đặc điểmPhát triển từ UV-VisSử dụng rộng rãi nhất trong nghiên cứu [phòng RD].Tia đa sắc sau khi qua tế bào đo đƣợc đƣa đến một cách tử để phân thành các tia đơn sắcrồi đi đến một dãy diod quangMỗi một diod với một băng có độ dài sóng hẹp phát hiện sự hấp thu ở một bƣớc sóng nhấtđịnhToàn bộ dãy diod [1024 con diode] đƣợc quét nhiều lần trong 1 giây bởi bộ phận vi xử lýThu đƣợc phổ UV-Vis của pic.Có thể nhìn toàn thang sóng (maxplot)Hóa phân tích 2Trần Trung Trực10-ii-Ưu điểmPhát hiện đồng thời chất được phân tích ở nhiều bước sóng khác, cung cấp thông tin vềphổ uv-vis của một peak.Xác định bƣớc sóng hấp thụ tối đa của một chất.Phát hiện tạp chất, chất gây nhiễu [biến đổi của thuốc] ở bƣớc sóng thấp hơn không đặctrƣng.Cung cấp thông tin vầ độ tinh khiết của peak.% tinh khiết peak [có phải đó chỉ là 1 đỉnh?].Cung cấp phổ 3D [độ hấp thu, thời gian lƣu, bƣớc sóng] giúp cho việc chọn bƣớc sóng phântích tối ƣu cho định lƣợng, định danh chất phân tích.Cung cấp phổ UV-Vis của một peak, định danh peak.[đo NMR phải tinh khiết 95%].[vanillin sulfuric dùng để phát hiện tạp nối đơn].…Hóa phân tích 2Trần Trung Trực11-iii-Nhược điểmĐộ nhạy kém hơn đầu dò UV-Vis thông thƣờngKhông tách đƣợc các đồng phân quang học.Hóa phân tích 2Trần Trung Trực12c. Đầu dò tán xạ ánh sáng bay hơi ELSD (Evaporative light scatteringdetector)-i-Hoạt độngmộ t)Giai đoạn 1:phun sươngDung dịch rửa giảiđƣợc phun sƣơngTrộn với khí nitơHình thành hạt phântán-ii-hai)Giai đoạn 2:Bốc hơi phađộngHạt phân tán đi quabuồng nhiệtPha động bốc hơikhỏi hạtPhân lập chất phântích thành những giọt nhỏba)Giai đoạn 3:Phát hiệnChất phân tích đƣợcchiếu chùm tia laser củađèn nguồn và gây tán xạánh sáng.Ánh sáng khuếch tánđƣợc giữ lại bởi ống nhânquang hay diode quang vàchuyển thành tín hiệuđiện tỉ lệ với lƣợng chấttan.Ưu điểmPhát hiện tất cả các hợp chất có sự bay hơi thấp hơn sự bay hơi của pha động.Sự bay hơi của pha độngĐộ nhạy cao (ng/ml).Khảo sát đƣờng và những chất có áp suất hơi yếu.[rất sạch tạp, sắc ký rõ đẹp].-iii-Nhược điểmSử dụng với pha động dễ bay hơiMẫu phân tích có sự bay hơi thấp hơn sự bay hơi của pha độngHóa phân tích 2Trần Trung Trực13d. Đầu dò khúc xạ kế vi sai RI (Refractive Index detector)-i-Nguyên tắc chung-ii-Ưu điểm-iii-Nhược điểmDựa trên sự khác nhau giữa chỉ số khúc xạ của pha động và pha động có lẫn chất tan sauquá trình tách qua sắc ký cột.Là loại thứ 2 đƣợc dùng phổ biến làm detector trong HPLC phân tích, rây phân tử.Là detector vạn năng do có khả năng phát hiện hầu hết các chất tan (đƣờng, glycosideno, …)Rất bền và rất nhạy.Độ nhay kém hơn UV-VisPhụ thuộc nhiều vào sự thay đổi thành phần của pha động nên thƣờng không sử dụng khicần gradient hóa dung môi.Các máy HPLC phải đƣợc trang bị bộ phận điều nhiệt giữ cho độ biến thiên nhiệt độ của hệthống khoảng ±0.5oC.Hóa phân tích 2Trần Trung Trực14e. Đầu dò huỳnh quang FD (Fluorecence detector)-i- Đặc điểmCột sắc ký : RP-LC 18 (25 cm x 4,6 mm, 5 μm.Nhiệt độ cột : 35oCPha động : H2O- MeOH- ACN (4:3:5)Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút.Bƣớc sóng/FD: (kích hoạt) E x 365 nm, (phát xạ) Em 455 nm.Thể tích tiêm : 20 μl[chất phát huỳnh quang đƣợc khi có nhiều nối đôi liên hợp, cồng kềnh], tách đẹp hơn ELS.-ii- Ưu điểmPhát hiện huỳnh quang cho:Các thuốc trừ sâu,CarbamateAflatoxin (nấm mốc),Vitamin,Acid amin.Khả năng tăng độ nhạy hang nghìn lần so với pháthiện bằng đo độ hấp thu.Độ chọn lọc, sự phát quang dùng 2 bƣớc sóng khácbiệt làm giảm đi các peak gây nhiễu.Hóa phân tích 2Trần Trung Trực15f.Đầu dò điện hóa ED (Electrochemical detector)Đo các cation, anion.Rất nhạy, dùng rộng rãi.Có trong ion chromatography.Giới hạn phát hiện: 1pg/mlg. Đầu dò đo độ dẫn CD (conductivity detector)Chọn lọc ionKhảo sát ion và hợp chất có thể ion hóa.Giới hạn phát hiện: 0.2% của sự sai lệch độ dẫn.h. Đầu dò khối phổ MSD (Mass spectroscopy detector)[mạnh nhất: sắc ký lỏng ghép khối phổ thời gian bay].Giới hạn phát hiện: cực nhỏ,Đắt tiền, lĩnh vực áp dụng rộng rãi.Hóa phân tích 2Trần Trung Trực16Hóa phân tích 2Trần Trung Trực17i.3-Đầu dò đo cường độ xung PAD (Pulsed Amperometry Detector)Hệ thống gồm 3 điện cực:Điện cực đối chứngĐiện cực chỉ thịĐiện cực bề mặt nhỏ làm bằng thủy tinh hay vàng.Phát hiện:Carbohydrate Aldehyd Acid aminAlcool Amine Chất hữu cơ có S.Tóm tắt tính năng sử dụng các đầu dò trong HPLCGiới hạnphát hiệnRISử dụngVạn năng 0,7g/mlUV-VISDetectorChọn lọc 3ng/mlHóa phân tích 2Chú ýƯu điểmNhược điểmLà detector vạnĐộ nhạynăng do có khả năng phát kém hơn UV-VisPhụ thuộchiện hầu hết các chất tan (đƣờng, glycoside no, …) nhiều vào sựRất bền và rất nhạy. thay đổi thànhphần của phađộng nên thƣờngđiềukhông sử dụngkiệnkhi cần gradientnhiệthóa dung môi.độ, độCác máyẩmHPLC phải đƣợctrang bị bộ phậnđiều nhiệt giữcho độ biến thiênnhiệt độ của hệthống khoảng±0.5oC.Độ nhạy caoĐòi hỏisử(3ng/ml), giá thành không dung môi phùdụngquá cao, dễ vận hànhhợp và tinh khiếtnhiềuÍt phụ thuộc vào các Chọn lọcnhấtthay đổi điều kiện (nhiệtcác chất tan hấptrongđộ, tốc độ dòng..)thu trong vùngphânUv-vistíchĐộ nhạythườngthấp hơn UVquiVis.Trần Trung Trực18PDADGiới hạnphát hiệnChọn lọc 10ng/mlFDSử dụngChọn lọc 8 pg/mlECDDetectorChọn lọc 1 pg/mlHóa phân tích 2Chú ýƯu điểmNhược điểmĐộ nhạyPhát hiện đồng thời kém hơn đầu dòchất được phân tích ởnhiều bước sóng khác,UV-Vis thôngcung cấp thông tin về phổ thƣờng.uv-vis của một peak.Không táchXác định bƣớc sóng đƣợc các đồnghấp thụ tối đa của mộtphân quang họcchất.Phát hiện tạp chất,chất gây nhiễu ở bƣớcDùngsóng thấp hơn không đặcnhiềutrƣng.trongCung cấp thông tinnghiênvầ độ tinh khiết của peak.cứu% tinh khiết peak.Cung cấp phổ 3D[độ hấp thu, thời gian lƣu,bƣớc sóng] giúp cho việcchọn bƣớc sóng phân tíchtối ƣu cho định lƣợng,định danh chất phân tích.Cung cấp phổ UVVis của một peak, địnhdanh peak.Phát hiện huỳnh quang cho: Các thuốc trừ sâu, Carbamate Aflatoxin (nấm mốc),Tính Vitamin,đặc Acid amin.hiệuKhả năng tăng độ nhạy hang nghìn lầncaoso với phát hiện bằng đo độ hấp thu.Độ chọn lọc, sự phát quang dùng 2 bƣớcsóng khác biệt làm giảm đi các peak gâynhiễu.Nhạy cao, dùng rộng rãiTrần Trung Trực19Sử dụngGiới hạnphát hiệnChú ý 1 pg/mlHợp chất có thể ion hóaELSDChọn lọcChọn lọcMSCDDetectorVạn năngNhiệtđộ bayhơichất 1 ng đối phânvới glucose tíchthấphơnphađộngfg/mlƯu điểmNhược điểmPhát hiện tất cả các Sử dụnghợp chất có sự bay hơivới pha động dễthấp hơn sự bay hơi củabay hơi.pha động.Mẫu phânSự bay hơi của phatích có sự bayđộnghơi thấp hơn sựĐộ nhạy cao (ng/ml) bay hơi của pha[rất sạch tạp, sắc kýđộngrõ đẹp].đắt tiền, áp dụng mọi lĩnh vựcIII- CÁC THÔNG SỐ ĐẶC TRƯNG TRONG HPLCThời gian lưu (tR)Diện tích đỉnh (S)Hệ số dung lượng (k’)Hệ số chọn lọc (α)Hóa phân tích 2 Hệ số bất đối (AF) Độ phân giải (RS) Số đĩa lý thuyết (N)Trần Trung Trực20A. TỐC ĐỘ DI CHUYỂN CỦA CÁC CHẤT1-Tốc độ di chuyển của một chất Được đặc trưng bởi:hệ số phân bố của nó giữa hai phacác đại lượng về sự lưu giữ của chất đó trên pha tĩnh: thời gian lưu, thể tích lưua. Thời gian lưu (Retention time)tR = t’R + tM tR: Thời gian lưu là khoảng thời gian tính từ lúc tiêm mẫu vào cột đến khi pic đếndetector; thời gian lưu càng lớn thì chất tan bị lưu giữ càng mạnh và tốc độ di hcuye6n3của nó càng nhỏ. tM (t0): thời gian chết là thời gian lưu của một chất không bị lưu giữ, nghĩa là tốc độ của nóbằng tốc độ di chuyển trung bình của các phân tử dung môi (pic nhỏ bên trái). tR’: là thời gian lưu tương đốib. Thể tích lưuVR’=VR-VM=VM-V0VR: thể tích lƣu.VR’: thể tích lƣu tƣơng đối.VMthể tích chết của cột = V0: thể tích rỗng là thể tích dung môi từ nơi tiêm trong cột đếnđầu dò.c. Hệ số dung lượng k’(capacity factor)QsCs xVsVS t ' Rk k t M (1  k ' )QM CM xVMVM t M' VM, VS: là thể tích pha tĩnh, pha động.k’: bản chất các pha, chất tan, nhiệt độ, pH1 < k’ < 8 (tối ƣu 1 1Để tách riêng 2 chất: 1,05 <  < 2,00 càng lớn thì 2 chất càng tách khỏi nhau; nếu  quá lớn thì thời gian tách càng kéo dài.Nếu chỉ dựa vào  thì không biết hiệu lực tách của quá trình sắc ký.B. HÌNH DẠNG- SỰ ĐỐI XỨNG CỦA PICDạng pic sắc ký có tính đối xứng nhƣ phân bố Gauss là dạng lý tưởng.Pic thƣờng bị dãn ra và chỉ gần đối xứng; để đánh giá tính bất đối xứng của pic ngƣời tadùng hệ số bất đối.Hệ số bất đối (asymmetrical factor): AF BC(0,8 < AF < 1,2)ACBC: nửa chiều rộng phía sau của pic được đo ở 1/10 chiều cao của peak.AC: nửa chiều rộng phía trước của pic được đo ở 1/10 chiều cao của peak.Khi Af càng tăng thì hiện tượng kéo đuôi (tailing peak) càng rõ do:tương tác giữa chất cần phân tích và pha tĩnhcột sắc ký bẩn.Đỉnh kéo tuyến trƣớc (fronting peak) có thể lƣợng mẫu đƣa vào quá lớn so với năng lực cột.Khi Af của đỉnh càng gia tăng  tính tƣơng thích và độ chính xác kém tin cậy hơn.Hóa phân tích 2Trần Trung Trực22C. HIỆU LỰC CỘT- SỐ ĐĨA LÝ THUYẾTHiệu lực cột là thông số về hiệu lực tách của cột, đƣợc biểu thị bằng 2 thông số: Số đĩa lý thuyết N. Chiều cao đĩa lý thuyết H.𝑳 t t LN   16 R   5,54 R   H=H𝑵 WB  W1/ 2 22 N: số đĩa lý thuyết của cột H: chiều cao đĩa lý thuyết (0.03-1mm) WB: chiều rộng của peak ở đáy peak W1/2: chiều rộng của peak đo ở nữa chiều caoHiệu lực cột càng cao (đỉnh nhọn, hẹp, không dãn rộng)  N càng lớn  H càng nhỏ WB nhỏ (độ dãn peak nhỏ).N max  4000Ldp L: chiều dài cột (cm) dp: đường kính hạt pha tĩnh (m)Kích thước hạt càng nhỏ  Số đĩa lý thuyết càng lớn  Hiệu lực cột càng tăng  N > 1500Hóa phân tích 2Trần Trung Trực23D. ĐỘ PHÂN GIẢI – HỆ SỐ TÁCH CỘT (RESOLUTION)Độ phân giải là đại lƣợng đo mức độ tách 2 chất trên 1 cột sắc ký.Độ phân giải RS thể hiện: Độ nhọn của đỉnh (hiệu lực cột, column efficacy) Khoảng cách giữa các đỉnh (hiệu lực dung môi, sonvent efficacy).2(t R ) B  (t R ) A N      k 'B Rs ; Rs WA  WB4    1  k 'B  Rs = 0,75: hai peak không tách tốt, còn xen phủ nhau nhiều. Rs = 1,0: hai peak tách khá tốt, còn xen phủ nhau 4%. Rs = 1,5: hai peak tách hoàn toàn (chỉ xen phủ 0,3%).Tăng độ phân giải RS: Tăng số đĩa N+ Cột dài hơn (áp suất, thời gian và độ rộng của peak cũng tăng theo)+ Kích thước hạt nhỏ+ Giảm tốc độ dòng pha động Tăng hệ số dung lượng k'B:+ thay đổi thành phần pha động trong sắc ký lỏng+ tăng nhiệt độ đối với sắc ký khí.+ Nếu kB’ tăng nhiều thì tăng thời gian phân tích (1