Sách Thực Hành Môn Miễn Dịch - Tài Liệu Text - 123doc

Tải bản đầy đủ (.docx) (12 trang)

1. Trang chủ
>>
2. Y Tế - Sức Khỏe
>>
3. Y học thưởng thức

Sách thực hành môn miễn dịch

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (169.96 KB, 12 trang )

Tài liệu thực hành mônMiễn dịchdùng cho sinh viên hệ bác sĩBài 1. MIỄN DỊCH KHÔNG ĐẶC HIỆUKỸ THUẬT THỰC BÀO HỒNG CẦU GÀ1. MỤC TIÊU1. Minh họa hiện tượng thực bào trên mô hình thực bào hồng cầu gà của đạithực bào chuột lang.2. Làm được một số bước của kỹ thuật: thu hoạch đại thực bào, làm tiêu bảnvà nhuộm.3. Biết đọc kết quả và giải thích được các hiện tượng quan sát được.2. NỘI DUNG2.1. Chuẩn bị2.1.1. Dụng cụ- Bông, cồn sát trùng 700- Bơm và kim tiêm, loại 5ml, 10ml- Ống nghiệm nhựa hoặc thủy tinh: 5ml, 10ml, 50 ml- Bàn mổ chuột lang- Bộ dụng cụ mổ chuột: dao, kéo, kẹp phẫu tích, pince- Pipet Pasteur (nhựa)- Lam kính sạch- Đèn cồn- Giá để ống nghiệm,- Giá nhuộm tiêu bản- Tủ ấm 370C- Máy ly tâm- Kính hiển vi có vật kính dầu 100x.- Hệ thống camera và màn hình nối với kính hiển viTài liệu thực hành mônMiễn dịchdùng cho sinh viên hệ bác sĩ2.1.2. Hóa chất-Dung dịch NaCl 9‰Chất chống đông Heparin hoặc Citrat natri 7%Dung dịch pepton 10% pha trong NaCl 9‰, bảo quản ở 40CCồn tuyệt đốiThuốc gây mê (ete)Thuốc nhuộm GiêmsaDầu đọc tiêu bản2.1.3. Động vật thí nghiệm- Gà- Chuột lang1.Thực hiện kỹ thuậtNgày 1: Thu hút đại thực bào- Cắt bỏ lông chuột vùng bụng dưới.- Sát trùng vùng da đã cắt lông bằng cồn 700.- Dùng bơm và kim tiêm loại 10ml hút 8-10ml dung dịch pepton 1% và tiêmvào khoang màng bụng chuột lang.- Đánh dấu chuột đã tiêm và tiếp tục nuôi chuột 24 giờ.Ngày 2. Thực bào hồng cầu gà bởi đại thực bào đã tập trunga. Chuẩn bị hồng cầu gà- Lấy 5ml máu gà cho vào ống nghiệm đã có sẵn chất chống đông (Heparinhoặc Citrat natri 7%).- Thêm 5ml NaCl 9‰, trộn đều và ly tâm 2000 vòng/phút x 5 phút.- Hút bỏ phần huyết tương và giữ lại phần hồng cầu.- Pha loãng hồng cầu ở nồng độ 6-8% trong NaCl 9‰.- Để hồng cầu vào tủ ấm 370C ít nhất 10 phút.b. Tiến hành- Cố định chuột lang trên bàn mổ.- Tiêm 3ml hồng cầu gà vào khoang màng bụng, xoa bụng nhẹ nhàng để hồngcầu gà được dàn đều trong khoang màng bụng.- 15 phút sau khi tiêm, gây mê chuột bằng bông tẩm ete đặt trong phễu(phương pháp gây mê hở).Tài liệu thực hành mônMiễn dịchdùng cho sinh viên hệ bác sĩ- Tiêm 5-10ml NaCl 9‰ vào ổ bụng chuột.- Mở bụng theo đường giữa, chiều dài đường rạch khoảng 0,5cm.- Dùng kẹp phẫu tích hoặc pince không có mấu để kẹp và nâng cao miệng vếtmổ.- Hút dịch ổ bụng bằng pipet Pasteur và cho vào ống nghiệm nhỏ 5ml.- Nhỏ vào mỗi lam kính sạch một giọt dịch ổ bụng thu được và dàn đều giốngnhư làm tiêu bản máu đàn- Sau 15 phút tính từ khi hút dịch ổ bụng lần thứ nhất, dịch ổ bụng lại đượchút ra lần 2 và làm tiêu bản như lần thứ nhất- Để tiêu bản khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng- Cố định tiêu bản bằng cồn tuyệt đối- Pha loãng dung dịch Giêmsa 1:20 (1ml Giêmsa + 19ml H 20) và nhỏ đều lênmặt tiêu bản máu đàn, để 10 phút ở nhiệt độ phòng sau đó rửa bằng nướcmáy và để khô tự nhiên.2.Đọc kết quả và giải thích hiện tượng- Nhỏ một giọt dầu lên mặt tiêu bản và đọc kết quả bằng kính hiển vi vật kínhdầu 100xYêu cầu: Xác định được:- Hồng cầu gà, đại thực bào chuột lang- Các giai đoạn của quá trình thực bào: tiếp cận, nuốt và tiêu hồng cầu gà.Số lượng bạch cầu đơn nhân thực bàoPhầm trăm thực bào = ------------------------------------------------------------Tổng số bạch cầu đã đọc ( 50 bạch cầu)Chỉ số thực bào =Tổng số hồng cầu gà bị thực bào đếm được----------------------------------------------------Tổng số bạch cầu đã thực bàoTài liệu thực hành mônMiễn dịchdùng cho sinh viên hệ bác sĩBài 2. MIỄN DỊCH ĐẶC HIỆUi. Mục tiêu1. Chứng minh sự kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể2. Trình bày được nguyên lý, các bước và cách nhận định kết quả kỹ thuật đánhdấu enzym (ELISA) để xác định kháng nguyên bề mặt virus viêm gan B(HBsAg)3. Làm được một số kỹ thuật miễn dịch cơ bản trong nhóm kỹ thuật ngưng kết:xác định nhóm máu, hay phát hiện kháng thể kháng giang mai.ii. Nội dung2.1. Kỹ thuật ELISA2.1.1. Nguyên lý chungELISA (Enzym Linked Immuno-Sorbent Assay) là kỹ thuật hấp phụ miễn dịch gắnenzym được dựa vào tính hấp phụ tự nhiên của protein trên một số chất nhưpolystyren. Các kháng nguyên hoặc kháng thể được gắn lên bản nhựa trên, sau đócho kháng thể hoặc kháng nguyên đặc hiệu tương ứng vào để tạo nên phản ứng kếthợp kháng nguyên-kháng thể. Các kháng thể hoặc kháng nguyên đã biết trướcđược gắn với enzym. Enzym sẽ phân hủy cơ chất không màu thành một sản phẩmcó màu đặc trưng. Mật độ màu được nhận định sơ bộ bằng mắt thường hoặc đượcđọc chính xác bằng quang phổ kế.Tài liệu thực hành mônMiễn dịchdùng cho sinh viên hệ bác sĩ2.1.2. Một số loại kỹ thuật ELISA thường dùng.Dựa trên nguyên lý của các phản ứng kết hợp kháng nguyên-kháng thể. Nếu muốntìm kháng nguyên trong hỗn dịch thì phải có kháng thể đặc hiệu với kháng nguyênđó đã biết hoặc ngược lại.2.1.2.1.Kỹ thuật ELISA gián tiếp.Nguyên lý: Kháng nguyên cần tìm trong mẫu thử được hấp phụ vào giếng nhựa.Sau khi ủ và rửa, cho kháng thể đã biết rồi lại ủ một thời gian để phản ứng KN-KTdiễn ra. Rửa kháng thể thừa và cho kháng-kháng thể gắn enzym. Cuối cùng, rửaKT gắn enzym thừa và cho cơ chất TMB. Đo mật độ quang của màu bằng quangphổ kế hoặc mắt thường (xem sơ đồ 1).Sơ đồ 1Sinh màuCơKN ELISAKTsandwich.Kháng2.1.2.2.Kỹ thuậtchấtcầnđãKT gắntìmkhôngbiếtNguyên lý: KTđánh dấu enzym(đã biết) đã được gắn lên trên chất mang (cácgiếng của bản nhựa), sau đó cho mẫu thử có mang KN cần tìm và ủ. Rửa bỏ KNthừa và cho KT có gắn enzym. Như vậy, nếu có KN thì nó bị kẹp giữa 2 KT (xemsơ đồ 2). Sau khi rửa lần 2 để loại bỏ KT gắn enzym thừa thì cho dung dịch cơ chấtvào. Enzym sẽ phân hủy cơ chất sinh ra màu đặc trưng và mật độ quang học đượcđo bằng quang phổ kế ở bước sóng 450nm.Sơ đồ 2KTđãbiếtKNcầntìmKTgắnenzymSinh màuCơchất2.1.3 . ứng dụng để phát hiện HBsAg trong huyết thanh(Sử dụng bộ chế phẩm của PHARMATECH- HBsAg EIA).Tài liệu thực hành mônMiễn dịchdùng cho sinh viên hệ bác sĩ2.1.3.1. Nguyên lý (dựa trên nguyên lý kỹ thuật ELISA-sandwich 1 pha): KT đơndòng kháng HBsAg không đánh dấu enzym đã được gắn vào các giếng của bảnnhựa, đồng thời KT kháng HBsAg có gắn enzym peroxidase đã cho sẵn trong cácgiếng (hạt màu xanh). Cho huyết thanh nghi ngờ có HBsAg vào và ủ. Rửa bỏ cáchuyết thanh và KT gắn enzym thừa, sau đó cho cơ chất TMB (tetramethylbenzidin). Nếu trong huyết thanh thử có HBsAg thì peroxidase sẽ phân hủy TMBkhông màu thành dung dịch có màu xanh.Sơ đồ 3Sinh màuKTKhángHBsAgđó biếtKNHBsAgcần tỡmKTgắnperoxidaseCơchấtTMB2.1.3.2. Các chất liệu cần cho phản ứng-Huyết thanh hoặc huyết tương của máu người không cần nhịn đói.Chuẩn bị các dung dịch đệm để rửa theo chỉ dẫn đi kèm bộ chế phẩm.Một số dụng cụ cần thiết: Găng tay cao su, micropipet, đầu côn, giấy thấm.Máy quang phổ kế để đọc kết quả2.1.3.3. Các bước tiến hành- Tính toán và lấy số giếng thử cần thiết- Cho vào mỗi giếng thử 100µl huyết thanh bệnh nhân hay mẫu chứng gồmchứng âm (không có HBsAg) và chứng dương (chắc chắn có HBsAg) củahãng sản xuất.- Nhỏ 50µl dung dịch kháng thể gắn enzym và mỗi giếng thử.- ủ các giếng ở 370C trong 90 phút.- Rửa mỗi giếng 4 lần bằng đệm phosphat. Sau rửa chú ý loại bỏ hết đệm(dùng máy hút chân không hay đập mạnh trên giấy thấm)- Nhỏ 100 µl dung dịch TMB cho mỗi giếng thử.- ủ ở nhiệt độ phòng 15 phút.Tài liệu thực hành mônMiễn dịchdùng cho sinh viên hệ bác sĩ- Ngừng phản ứng bằng cách cho thêm 100µl H2SO4 1nmol/l trong mỗi giếng,gõ nhẹ lên phiến nhựa để trộn đều.- Kết quả được đọc trong khoảng thời gian 15 phút sau khi dừng phản ứngbằng mắt thường hay máy đo quang phổ kế ở bước sóng 450 nm.2.1.3.4. Đọc kết quả.- Chứng âm: Giếng thử không đổi màu.- Chứng dương: Giếng thử có màu xanh- Kết quả mẫu thử âm tính: Màu giống màu chứng âm  trong huyết thanh thửkhông có HBsAg- Kết quả mẫu thử dương tính: Màu giống màu chứng dương trong huyếtthanh thử có HBsAg (độ đậm nhạt phụ thuộc nồng độ HBsAg có trong mẫuthử).2.2. Kỹ thuật ngưng kết2.1.1. Chuẩn bị dụng cụ và hóa chất-Bộ dụng cụ lấy máu đầu ngón tay hoặc bộ dụng cụ lấy máu tĩnh mạchLam kính 2,5 & 7,5cmBông thấm nước, cồn sát trùng 70 độBộ huyết thanh mẫu để xác định nhóm máu ABO và bộ kit phát hiện khángthể kháng giang mai RPR-Nosticon ( Biomerieux).2.1.2. Tiến hành kỹ thuật2.1.2.1 Kỹ thuật xác định nhóm máu ABO* Nguyên lý : Kháng nguyên trên bề mặt hồng cầu khi gặp kháng thể tương ứng (đãbiết) thì sẽ tạo nên mạng lưới ngưng kết. Hồng cầu sẽ vón lại thành từng mảng haycác hạt lớn có thể nhìn thấy bằng mắt thường so với mẫu chứng.* Tiến hành :-Nhỏ 3 giọt máu lên lam kínhSau đó nhỏ 3 giọt huyết thanh mẫu antiA, antiB, antiAB lên cạnh 3 giọt máuDùng đũa thủy tinh trộn đều ( sau mỗi lần trộn lau sạch đũa thủy tinh)Để nhiệt độ phòng đọc kết quả sau 10 phút.Tài liệu thực hành mônMiễn dịchdùng cho sinh viên hệ bác sĩ* Đọc kết quả: Dựa vào vị trí ngưng kết hay không ngưng kết và tên huyết thanhđã biết, suy ra nhóm máu tương ứng.2.1.2.2. Kỹ thuật phát hiện kháng thể giang mai:* Nguyên lý: Người ta tổng hợp một số chất có cấu trúc giống kháng nguyên giangmai (VDRL) gắn lên chất mang là cacbon với mục đích khi kháng nguyên kết hợpvới kháng thể thì có thể phát hiện được bằng mắt thường do các mẩu cacbon màuđen bị ngưng kết thành dạng chấm tròn màu đen.* Tiến hành- Nhỏ 1 giọt huyết thanh lên vòng tròn của giấy- Dùng que nhựa dàn đều huyết thanh- Nhỏ 1 giọt kháng nguyên ( trước khi nhỏ lắc đều)- Sau đó lắc tròn lam giấy một lúc để kháng nguyên tiếp xúc tốt với kháng thể- Đọc kết quả sau 8 phút* Kết quả:- Chứng âm: không có chấm tròn màu đen- Chứng dương: nhiều chấm tròn màu đen- Mẫu huyết thanh dương tính: Khi thấy xuất hiện các chấm tròn màu đen, vậytrong huyết thanh bệnh nhân có kháng thể kháng trực khuẩn giang maiTài liệu thực hành mônMiễn dịchdùng cho sinh viên hệ bác sĩBài 3: MÔ HÌNH THỰC NGHIỆMSỐC TRUYỀN MÁU KHÁC LOÀII. MỤC TIÊU1. Mô tả và giải thích được các thay đổi trong sốc truyền máu khác loài.2. Phân tích được cơ chế bệnh sinh của sốc truyền máu.II. MÔ HÌNH SỐC TRUYỀN MÁU2.1 Trang bị, hoá chất và động vật thí nghiệm.2.1.1 Động vật thí nghiệm:- Chó khoẻ có trọng lượng từ 8-10 kg.- Thỏ khoẻ trọng lượng 2-2,5 kg.2.1.2 Dụng cụ thí nghiệm:- Bàn cố định chó, thỏ- Bộ dụng cụ mổ- Hệ thống ghi huyết áp và hô hấpTài liệu thực hành mônMiễn dịchdùng cho sinh viên hệ bác sĩ- Bộ dụng cụ đếm hồng cầu, bạch cầu: ống hút hồng cầu, ống hút bạch cầu,buồng đếm Thoma.- Kính hiển vi quang học.- Bộ dụng cụ truyền máu- Máy ly tâm.- Đồng hồ bấm giây.- Ống đo hematorit.- Ống nghiệm, lam kính, lamen.- Pipette, cốc đong.- Bông, gạc, chỉ.2.1.3 Hoá chất:- Dung dịch chống đông: Citrat natri 7%, Heparin 5000 UI/ml.- Dung dịch muối đẳng trương NaCl 9‰.- Dung dịch đếm bạch cầu: acid acetic 3-5%.- Thuốc tê Novocain.2.2 Chuẩn bị thí nghiệm:2.2.1 Lấy hồng cầu thỏ:- Thỏ được cố định trên bàn mổ. Cắt lông vùng cổ.- Gây tê tại chỗ bằng Novocain. Bộc lộ động mạch cảnh.- Luồn canuyl vào động mạch cảnh.- Dẫn lưu toàn bộ máu thỏ ra lọ thuỷ tinh có chứa sẵn 20 ml dung dịchchống đông Citrat Natri 7%.- Máu chống đông được ly tâm tách riêng hồng cầu bỏ huyết tương và lọcloại trừ cục máu đông.- Tái hoà tan hồng cầu bằng đúng thể tích huyết tương đã loại bỏ với dungdịch NaCl 9‰.2.2.2. Chuẩn bị chó:- Chó được cố định trên bàn mổ- Cắt lông cổ- Gây tê tại chỗ bằng Novocain ở vùng cổ và vùng bẹn chân sau.- Bộc lộ động mạch cảnh luồn canuyn vào để đo huyết áp trực tiếp tronglòng mạch bằng huyết áp kế thuỷ ngân.- Bộc lộ khí quản, luồn kim đo hô hấp vào khí quản, kim này được nốithông với trống Marey (có gắn kim ghi biên độ trên băng giấy).- Bộc lộ tĩnh mạch đùi phải để lấy máu kiểm tra các chỉ số trước và sausốc.- Bộc lộ tĩnh mạch đùi trái để truyền hồng cầu thỏ.2.3. Tiến hành thí nghiệm:2.3.1. Xác định các chỉ số ở thời điểm trước truyền:Tài liệu thực hành mônMiễn dịchdùng cho sinh viên hệ bác sĩ* Các chỉ số về huyết động:- Huyết áp động mạch: được xác định qua huyết áp kế thuỷ ngân. Đo giátrị huyết áp động mạch trực tiếp trong lòng mạch, giá trị huyết áp thuđược là giá trị huyết áp lấy điểm giữa của khoảng cách dao động cột thuỷngân.- Tần số mạch: được xác định qua số lần mạch nảy trong một phút tại độngmạch đùi bên phải.* Các chỉ số hô hấp:- Tần số hô hấp: đếm số lần lên xuống của trống Marey trong một phút.- Biên độ hô hấp: ghi độ dao động của kim ghi trên băng giấy được gắntrên mặt trống Marey.* Các chỉ số huyết học:- Số lượng hồng cầu: Đếm bằng buồng đếm Thoma. Dùng ống hút hồngcầu hút máu (ngay sau khi lấy máu ra khỏi lòng mạch). Sau đó pha loãng200 lần với dung dịch nước muối đẳng trương (NaCl 9‰). Lắc đều, bỏvài giọt đầu, nhỏ lên buồng đếm và đếm số lượng bằng kính hiển viquang học.- Số lượng bạch cầu: Cũng được xác định bằng buồng đếm Thoma. Dùngống hút bạch cầu để hút máu, sau đó pha loãng với dung dịch bạch cầu đểphá vỡ hồng cầu với độ pha loãng 20 lần. Lắc đều bỏ vài giọt đầu, nhỏlên buồng đếm và đưa lên kính hiển vi quang học xác định số lượng.- Hematocrit: Theo phương pháp microhematocrit xác định cột hồng cầu.Lấy máu cho vào ống đo có tráng Heparin, sau đó bịt một đầu bằng sáp.Tiến hành ly tâm với tốc độ 10.000 vòng/phút x 5 phút, sau đó xác địnhtỷ lệ chiều cao cột hồng cầu so với máu toàn phần.* Các chỉ số khác:- Thời gian đông máu: Xác định khoảng thời gian từ khi lấy máu ra khỏilòng mạch tới khi nghiêng lam kính không có sự biến dạng của cục máu.Nhỏ một giọt máu lên lam kính sạch với điều kiện giọt máu tròn, có độvồng, đường kính 0,7-1,0cm.- Hiện tượng dung huyết: Lấy 2ml máu chống đông, cho vào ống nghiệm.Ly tâm tách riêng hồng cầu và huyết tương với tốc độ 5000 vòng/ phút,quan sát mầu huyết tương thu được.- Phản ứng chéo giữa hồng cầu thỏ và huyết thanh chó: Nhỏ một giọt hồngcầu thỏ và một giọt huyết thanh chó lên lam kính, dùng que thuỷ tinh trộnđều. Lam kính được đưa lên kính hiển vi quang học và quan sát hiệntượng ngưng kết trên lam kính (cũng có thể quan sát bằng mắt thường).Tài liệu thực hành mônMiễn dịchdùng cho sinh viên hệ bác sĩ- Chứng minh vai trò bổ thể: Huyết thanh chó chia 2 ống: 01 ống để ởnhiệt độ phòng, ống còn lại để ở 56°C trong 30 phút sau đó cho một giọthồng cầu thỏ vào mỗi ống và ủ ở 37 0Cx10phút. Ly tâm 2000 vòng/phút x5 phút và nhận xét sự khác nhau giữa 2 ống.- Tình trạng toàn thân của chó.2.3.2 Tiến hành truyền dịch hồng cầu thỏ cho chó qua đường tĩnh mạch đùivới tốc độ- 25-30 giọt/ phút. Theo dõi sự biến đổi của huyết áp, mạch và hô hấp cũng nhưtình trạng toàn thân của chó trong toàn bộ quá trình truyền.- Khi huyết áp còn 50- 60 mmHg ngừng truyền lấy lại toàn bộ các chỉ tiêu giốngnhư trước khi truyền, ghi vào biên bản.Bảng kết quả thí nghiệm sốc truyền máu khác loài:Các chỉ sốTrước sốcSau sốcMạchHuyết ápHô hấpPhản ứng chéoVai trò bổ thểSố lượng bạch cầuHematocritThời gian đông máuHiện tượng tan máuTình trạng toàn thân2.3.3 Nhận xét và giải thích kết quả thu được, trên cơ sở đó phân tích cơchế bệnh sinh của sốc truyền máu khác loài.

Tài liệu liên quan

• Danh sách đăng ký thực hành môn thị trường chứng khoán
  • 2
  • 828
  • 0
• Môn miễn dịch học phân tử - Vấn đề:Vacxin
  • 15
  • 610
  • 0
• Môn miễn dịch học phân tử Vấn đề:Vacxin
  • 15
  • 464
  • 0
• Tài Liệu Thực Hành Môn Thiết Kế Mạng Lan
  • 42
  • 942
  • 2
• Khối 11_KẾ HOẠCH THỰC HÀNH MÔN VẬT LÝ năm 09-10
  • 1
  • 444
  • 7
• Khối 10_KẾ HOẠCH THỰC HÀNH MÔN VẬT LÝ năm 09-10
  • 1
  • 414
  • 6
• Đề cương thực hành môn học: Thuế
  • 9
  • 561
  • 5
• Bài tập thực hành môn thiết kế lập trình C
  • 7
  • 799
  • 4
• Tài liệu hướng dẫn thực hành môn Cấu trúc dữ liệu và giải thuật HCMUS 2010 DANH SÁCH LIÊN KẾT
  • 5
  • 1
  • 21
• Tài liệu Bài thực hành môn học Máy tính Kinh doanh 1 - Phần Microsoft Word pdf
  • 14
  • 952
  • 28

Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

(42.41 KB - 12 trang) - Sách thực hành môn miễn dịch Tải bản đầy đủ ngay ×