XÁC ĐỊNH ĐẾM VI KHUẨN COLIFORM, COLIFORM CHỊU NHIỆT

XÁC ĐỊNH – PHÁT HIỆN VÀ ĐẾM VI KHUẨN COLIFORM, VI KHUẨN COLIFORM CHỊU NHIỆT VÀ ESCHERICHIA COLI GIẢ ĐỊNH.

(TCVN 6187-1-1996)

1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này là phép thử Tiêu chuẩn để phát hiện và đếm khuẩn Escherichia coli và vi khuẩn coliform có trong mẫu thử.

Phép thử Tiêu chuẩn dựa trên sự lọc qua màng rồi cấy trên môi trường thạch khác nhau và tính số lượng các loài sinh vật quan tâm có trong mẫu..

2. Nguyên tắc

• Phương pháp này dựa trên sự lọc qua màng, ủ màng trong môi trường chọn lọc sau đó lấy đặc trưng sinh hóa của các khuẩn lạc dương tính lactoza điển hình để phát hiện và đếm vi khuẩn coliform và E. coli trong hai đến ba ngày.
• Phần mẫu thử được lọc qua màng để giữ vi khuẩn được đặt trên môi trường thạch lactoza được ủ ở (36 ± 2) oC trong (21 ± 3) h, tiếp theo ủ ở (44,0 ± 0,5) oC từ 19 h đến 20 h
• Những khuẩn lạc đặc trưng trên màng được đếm là vi khuẩn dương tính với lactoza. Đối với vi khuẩn coliform và E. coli việc cấy thử được tiến hành từ những khuẩn lạc đặc trưng đã được chọn ngẫu nhiên để khẳng định loại sinh ra oxydaza và indol. Đếm số coliform dương tính với lactoza và E. coli có trong 100 ml mẫu.
• Những khuẩn lạc trên màng có khả năng tạo indol từ tryptophan trong môi trường thạch được đếm là E. coli. Đếm số E. coli có trong 100 ml mẫu.

3. Thiết bị và dụng cụ
   • Thiết bị tiệt trùng bằng hơi nước (nồi hấp) ,Thiết bị và dụng cụ thủy tinh được tiệt trùng theo hướng dẫn trong ISO 8199.
   • Tủ ấm có điều chỉnh nhiệt độ ở (36 ± 2) oC
   • Tủ ấmcó điều chỉnh nhiệt độ ở (44,0 ± 0,5) oC
   • Máy đo pH, với độ chính xác ± 0,1.
   • Thiết bị lọc màng, phù hợp với ISO 8199
   • Màng lọc, làm bằng este xenlulô, đường kính khoảng 47 mm, có cỡ lỗ 0,45 µm và, có lưới.
   • Kẹp mũi tròn, dùng để kẹp màng lọc
   • Giá lọc, đường kính ít nhất 47 mm

4. Dịch pha loãng,môi trường nuôi cấy và thuốc thử
   • Nước cất: nước cất hoặc nước đã loại ion không chứa các chất ức chế sự phát triển của vi khuẩn trong các điều kiện thử và phù hợp với TCVN 4851 (ISO 3696).
   • Axit clohidric (ρ = 1.18 g/l)
   • NaOH (1 mol/l): hoà tan 0.4g NaOH vào 10ml nước (2.1).
   • HCl (1 mol/l): hút 0.85 ml HCl (3.2) vào ống đong và định mức 10ml bằng nước (3.1)
   • Dịch pha loãng Nước pepton (0.1%):Hoà tan 1g pepton trong khoảng 950 ml nước (3.1). Chỉnh pH bằng dung dịch NaOH (4.3) hoặc HCl (4.4), sao cho sau khi khử trùng pH là 7.0 ± 0.1. Thêm nước cất cho đủ 1000 ml, phân phối thành các lượng phù hợp và khử trùng ở 1210C ± 10C trong 15 phút.
   • Môi trường phân lập:
     • Aga TTC lactose với natri heptadecylsunphat
       • Môi trường cơ bản

                                   Lactoza                                                              20 g

                                   Pepton                                                                10 g

                                   Chất chiết nấm men                                           6 g

                                   Chất chiết thịt                                                    5 g

                                   Bromothymol xanh                                            0,05 g

                                   Aga (dạng bột hoặc miếng)                                15 g đến 25 g

                                   Nước cất                                                            1000 ml

Hòa tan các chất trong nước bằng đun nóng. Nếu cần, điều chỉnh pH sao cho sau khi tiệt trùng pH đạt 7,2 ± 0,1 ở 25 °C. Cho môi trường vào bình, thể tích tối đa là 250 ml và tiệt trùng trong nồi hấp ở (121 ± 3) °C trong 15 phút.

                         Dung dịch TTC

                                   2,3,5-Triphenyltetrazoliun chlorua (TTC)         0,05 g

                                   Nước cất                                                            100 ml

                                   Hòa tan TTC trong một ít nước và thên nước đến 100 ml. Tiệt trùng bằng cách lọc qua màng có cỡ lỗ danh định 0,2 µm.

                         Dung dịch natri heptadecylsunphat

                                   Natri heptadecylsunphat (Tergitol3) 7)  0,2g

                                   Nước cất                                                            100 ml

                                   Hòa tan natri heptadecylsunphat trong một ít nước rồi thêm nước đến 100 ml. Tiệt trùng trong nồi hấp ở (121 ± 3) °C trong 15 min.

                         Môi trường hoàn chỉnh

                                   Môi trường cơ bản (4.6.1.1)                               100 ml

                                   Dung dịch TTC (4.6.1.2)                                   5 ml

                                   Dung dịch natri heptadecylsunphat (4.6.1.3)5 ml.

                                   Đun tan chảy môi trường cơ bản rồi để nguội đến (50 ± 5) °C. Thêm TTC và dung dịch natri heptadecylsunphat vô trùng, cẩn thận để tránh tạo bọt sau mỗi lần thêm. Đổ vào đĩa Petri sao cho độ dầy của môi trường ít nhất là 5 mm. Nếu không dùng ngay thì bảo quản ở (5 ± 3) °C trong tối cho thời hạn không quá mười ngày.

                         Môi trường Triptophan

                                   Casein                                                                10 g

                                   L-tryptophan                                                      1 g

                                   Natri clorua                                                        5 g

                                   Nước cất đến                                                      1000 ml

                                   Hòa tan các chất trong nước bằng đun nóng. Lấy 3 ml vào ống nghiệm để thử. Đậy ống nghiệm bằng nút vải, plastic hoặc nắp kim loại. Để trong nồi hấp trong 15 min ở (121 ± 3) °C, pH của môi trường phải là 7,5 ± 0,1 ở 25 °C.

                         Thạch Trypton đậu nành (TSA)

                                   Casein                                                                15 g

                                   Pepton đậu nành                                                5 g

                                   Natri clorua                                                        5 g

                                   Aga (dạng bột hay miếng)                                 15 g đến 25 g

                                   Nước cất đến                                                      1000 ml

                                   Hòa tan các chất trong nước bằng đun nóng. Điều chỉnh pH sao cho sau khi tiệt trùng là 7,2 ± 0,1 ở 25 °C. Rót vào các bình hoặc ống nghiệm có thể tích tối đa 250 ml và tiệt trùng trong 15 min ở (121 ± 3) °C. Để môi trường nguội đến (50 ± 5) °C và rót vào đĩa Petri sao cho độ dày môi trường ít nhất là 5 mm.

                         Thuốc thử Kovacđểthử indol

                                   p-Dimetylamin benzadehyt                               0,5 g

                                   Axit clohydric c(HCl) = 1 mol/l                         100 ml

                                   Hòa tan p-Dimetylamin benzadehyt trong axit clohydric (xem cảnh báo trong B.5.1).

                                   Bảo quản thuốc thử trong bình mờ ở (5 ± 3) °C. Thuốc thử phải có màu vàng nhạt và không dùng nữa nếu dung dịch chuyển thành màu vàng nâu.

                         Thuốc thử oxidaza

                                   Tetrametyl-p-phenylendiamin dihyroclorua        0,1 g

                                   Nước cất                                                            10 ml

                                   Thuốc thử này không bền và cần chuẩn bị trước khi dùng.

                      CẢNH BÁO – Tetrametyl-p-phenylendiamin dihyroclorua là chất gây ung thư. Cần làm việc trong tủ hút, sử dụng găng và tránh tiếp xúc với da.

5. Lấy mẫu:

Lấy mẫu và đưa đến phòng thí nghiệm theo TCVN 6663-1 (ISO 5667-1), TCVN 5992 (ISO 5667-2) và TCVN 6663-3 (ISO 5667-3).

6. Cách tiến hành
   • Chuẩn bị mẫu

Để chuẩn bị mẫu lọc và chủng cấy trên môi trường biệt lập, theo hướng dẫn trong ISO 8199 và TCVN 6507-1 (ISO 6887-1). Tốt nhất là bắt đầu phép thử ngay sau khi lấy mẫu.Nếu mẫu được giữ ở nhiệt độ môi trường (trong tối và không quá 25 °C) việc kiểm tra nên tiến hành ngay trong vòng 6 h kể từ khi lấy mẫu.Trường hợp đặc biệt mẫu có thể lưu giữ ở (5 ± 3) °C đến 24 h trước khi kiểm tra.

• Lọc

Lọc 100 ml mẫu (hoặc thể tích lớn hơn, ví dụ 250 ml cho nước đóng chai màng lọc (3.6).Đặt cái lọc lên trên môi trường thạch tương ứng (4.6.1), đảm bảo không có không khí ở phía dưới.

• Ủ và phân biệt, Phép thử Tiêu chuẩn

Sau khi lọc (6.2) đặt màng trên đĩa aga Lactoza TTC (4.6.1) và ủ ở (36 ± 2) °C trong (21 ± 3) h.

CHÚ THÍCH 1: Kéo dài thời gian ủ đến (44 ± 4) h có thể cho độ nhạy của phép thử cao hơn và nhất là với những đĩa không hiện rõ các khuẩn lạc điển hình sau (21 ± 3) h.

CHÚ THÍCH :2 Dùng thêm một màng lọc để ủ ở 44 °C có thể khắc phục được vấn đề phát triển nền mẫu.

Kiểm tra và đếm tất cả các khuẩn lạc đặc trưng dương tính với lactoza, nhưng không quan tâm đến kích thước, hiện màu vàng trong môi trường ở dưới màng lọc. Đối với thử oxydaza và indol cần cấy tiếp tất cả các khuẩn lạc đặc trưng thu được, hoặc một số đại diện (ít nhất 10) trên thạch không chọn lọc (4.6.3) và trên tryptophan (4.6.2) tương ứng.

Ủ aga không chọn lọc ở (36 ± 2) °C trong (21 ± 2) h và tiến hành thử oxydaza như sau:

– Nhỏ hai đến ba giọt thuốc thử oxydaza mới chuẩn bị (4.6.5) lên giấy lọc.

– Dùng que cấy thủy tinh, gỗ, vòng dây plastic hoặc platin (không dùng dây crom-niken) bởi một phần khuẩn lạc vi khuẩn lên giấy lọc đã được chuẩn bị.

– Màu xanh đậm xuất hiện trong 30 s là phản ứng dương tính.

Ủ ống nghiệm chứa L-tryptophan (4.6.2) ở (44,0 ± 0,5) °C trong (21 ± 3) h và kiểm tra sự sinh ra indol bằng cách thêm 0,2 ml đến 0,3 ml thước thử Kovac (4.6.4). Mẫu đỏ thẫm trên bề mặt môi trường xác định sự sinh ra indol.

Một số chủng Klebsiella oxytoca cho phản ứng indol dương tính.Để khắc phục kết quả dương tính này, cần thử thêm β- glucuronidaza (E. coli cho phản ứng dương tính còn K. oxytoca cho phản ứng âm tính).

Đếm các khuẩn lạc có phản ứng oxydaza âm tính là vi khuẩn coliform.

Đếm các khuẩn lạc có phản ứng oxydaza âm tính và phản ứng indol dương tính là E.coli.

7. Thể hiện kết quả

Dựa vào số khuẩn lạc đặc trưng trên màng lọc (3.6) tính số vi khuẩn E. coli, coliform

8. Báo cáo kết quả

Báo cáo kết quả cần bao gồm những thông tin sau:

a) Viện dẫn tiêu chuẩn này;

b) Mọi chi tiết để nhận dạng đầy đủ mẫu;

c) Kết quả thể hiện theo Điều 7;

d) Những sự cố đặt biệt quan sát được trong suốt quá trình phân tích và mọi thao tác không quy định trong phương pháp này có thể ảnh hưởng đến kết quả thử nghiệm.