Xây Dựng đường Chuẩn Glucose/Xylose Xác định Hoạt Tính Enzyme

Xây dựng đường chuẩn glucose/xylose với nồng độ từ 50 – 300 µg/ml. Các bước dựng đường chuẩn để xác định hoạt tính enzyme được tóm tắt qua bảng 2.3

Bảng 2.3: Tóm tắt quá trình dựng đường chuẩn glucose/xylose Ống số 0 1 2 3 4 5 Nồng độ glucose/xylose (µg/ml) 0 50 100 150 200 300 Dung dịch glucose/xylose (1mg/ml) (µl) 0 60 60 60 60 60 DD đệm acetate 0,1 M, pH 5 (µl) 60 0 0 0 0 0 Dung dịch CMC 2%/xylan1% (µl) 600 600 600 600 600 600 Dung dịch DNS (µl) 300 300 300 300 300 300 Nước cất (ml) 3 3 3 3 3 3

2.2.5.3. Phương pháp đo mẫu thí nghiệm

Thí nghiệm tiến hành mỗi mẫu với 5 ống nghiệm: 3 ống cho phản ứng (Am), 1 ống đối chứng (A0), 1 ống blank. Các bước thực hiện như bảng 2.4.

Bảng 2.4: Các bước của quá trình xác định hoạt tính cellulase và xylanase

Bước thực hiện Mẫu Am Mẫu A0

1. Đệm acetate 0,1M, pH=4,5 (µl) 0 0

2. Dịch enzym (µl) 60 60

3. Ủ 40oC (phút) 5 0

4. Cơ chất (CMC/xylan) (µl) 600 300 (bước 7)

5. Trộn đều Trộn đều Trộn đều

6. Ủ 40oC (phút) 20 0

7. DNS (µl) 300 600 (bước 4)

8. Trộn đều Trộn đều Trộn đều

9. Đun cách thủy 10 phút 10 10

10. Làm nguội Làm nguội Làm nguội

11. Nước cất (ml) 3 3

12. Trộn đều Trộn đều Trộn đều

So màu trên máy quang phổ Hewlett-Packard 8453 với chương trình HPUV-vis Chemstations ở bước sóng 540 nm

2.2.5.4. Xác định hoạt tính enzyme cellulase và xylanase

Đơn vị hoạt tính enzyme cellulase/xylanase (IU/ml) là lượng enzyme mà sẽ giải phóng lượng đường khử (như glucose/xylose) khi thủy phân CMC/xylan với vận tốc 1 µmol /phút dưới các điều kiện phản ứng

2.3. Phương pháp nghiên cứu

2.3.1. Khảo sát ảnh hưởng của yếu tố thời gian đến hàm lượng đường khử trong quá trình thủy phân rơm trong quá trình thủy phân rơm

* Mục tiêu: Xác định thời điểm hàm lượng đường khử được tạo ra nhiều nhất ở các mốc thời gian bố trí thí nghiệm.

* Bố trí thí nghiệm

- Sử dụng 1 gam rơm đã chuẩn bị cho vào 100 ml môi trường Mandle chứa trong bình tam giác 250 ml, xác định pH trước khi hấp khử trùng của các mẫu thí nghiệm, đậy lại bằng nút bông, hấp khử trùng ở 1210C, trong thời gian 15 phút.

- Bào tử nấm mốc từ ống nghiệm được chuyển vào lọ thủy tinh có chứa nước cất đã hấp khử trùng, xác định mật độ bào tử sao cho dịch bào tử là 107

bào tử/ml. Bổ sung dịch bào tử mốc vào hỗn hợp rơm sau khi hấp khử trùng để nguội theo tỉ lệ 10% (v/v). Lắc trên máy lắc ở điều kiện nhiệt độ phòng và theo dõi hàm lượng đường khử theo mỗi mốc thời gian 3 ngày, 5 ngày, 7 ngày, 9 ngày, 11 ngày và 13 ngày. Mẫu được lập lại 3 lần.

* Chỉ tiêu theo dõi

- Hàm lượng đường khử (mg/g)

- Hoạt tính enzyme cellulase, xylanase (IU/ml) - Hiệu suất thủy phân (%)

2.3.2. Khảo sát ảnh hưởng của mật độ bào tử mốc đến hàm lượng đường khử trong quá trình thủy phân rơm khử trong quá trình thủy phân rơm

* Mục tiêu: Xác định mật độ bào tử mốc thích hợp bổ sung vào môi trường thủy phân để thu được hàm lượng đường khử nhiều nhất ở các mật độ bào tử bố trí thí nghiệm.

Chuẩn bị hỗn hợp rơm và điều kiện thí nghiệm tương tự thí nghiệm 2.3.1. Bào tử nấm mốc từ ống nghiệm được chuyển vào lọ thủy tinh có chứa nước cất đã hấp khử trùng, xác định mật độ bào tử sao cho dịch bào tử lần lượt là 106, 107, 108 bào tử/ml. Dựa vào kết quả của thí nghiệm 2.3.1 về thời gian tối ưu, tiếp tục bố trí thí nghiệm bổ sung với 3 kiểu mật độ bào tử mốc là 106, 107, 108 bào tử/ml. Mẫu được lập lại 3 lần.

* Chỉ tiêu theo dõi

- Hàm lượng đường khử (mg/g)

- Hoạt tính enzyme cellulase, xylanase (IU/ml). - Hiệu suất thủy phân (%)

2.3.3. Khảo sát ảnh hưởng của yếu tố pH ban đầu đến hàm lượng đường khử trong quá trình thủy phân rơm khử trong quá trình thủy phân rơm

* Mục tiêu: Theo dõi sự thay đổi pH trong quá trình thủy phân rơm và hàm lượng đường khử được tạo ra để xác định pH tối ưu được bố trí trong thí nghiệm

* Bố trí thí nghiệm

Chuẩn bị hỗn hợp rơm và điều kiện thí nghiệm tương tự thí nghiệm 2.3.1. Mật độ bào tử nấm mốc là kết quả của thí nghiệm 2.3.2. Thí nghiệm được lập lại 3 lần, với pH ban đầu của hỗn hợp rơm được điều chỉnh là 4,0; 4,5; 5,0; 5,5.

* Chỉ tiêu theo dõi

Theo mỗi mốc thời gian: 5 ngày lấy dịch thủy phân xác định các chỉ tiêu - Hàm lượng đường khử (mg/g)

- Hoạt tính enzyme cellulase, xylanase (IU/ml) - Hiệu suất thủy phân (%)

2.3.4. Khảo sát hàm lượng đường khử tạo ra khi không sử dụng và sử dụng dung dịch đệm Na-acetate trong quá trình thủy phân rơm

* Mục tiêu: Theo dõi hàm lượng đường khử được tạo ra trong quá trình thủy phân rơm để so sánh sự khác biệt giữa sự duy trì pH = 4,5 bằng dung dịch đệm Na-acetate 0,1 M, pH = 4,5 và điều chỉnh pH ban đầu là 4,5.

* Bố trí thí nghiệm

Chuẩn bị hỗn hợp rơm và điều kiện thí nghiệm tương tự thí nghiệm 2.3.1. Mật độ bào tử nấm mốc là kết quả của thí nghiệm 2.3.2. Thí nghiệm được lập lại 3 lần, với pH ban đầu của hỗn hợp rơm được điều chỉnh bằng dung dịch đệm Na-acetate 0,1 M, pH = 4,5 và điều chỉnh pH ban đầu là 4,5. Thí nghiệm được lập lại 3 lần.

* Chỉ tiêu theo dõi

- Hàm lượng đường khử (mg/g)

- Hoạt tính enzyme cellulase, xylanase (IU/ml). - Hiệu suất thủy phân (%)

2.3.5. Khảo sát ảnh hưởng của chất hoạt động bề mặt lên quá trình thủy phân rơm phân rơm

* Mục tiêu: Khảo sát ảnh hưởng của chất hoạt động bề mặt đến hàm lượng đường khử được tạo ra trong quá trình thủy phân rơm

* Bố trí thí nghiệm

Chuẩn bị hỗn hợp rơm và điều kiện thí nghiệm tương tự thí nghiệm 2.3.1. Bào tử nấm mốc từ ống nghiệm được chuyển vào lọ thủy tinh có chứa Tween-80, 0,1% và nước cất đã hấp khử trùng, mật độ bào tử bổ sung là kết quả của thí nghiệm 2.3.2. Thí nghiệm được lập lại 3 lần.

* Chỉ tiêu theo dõi

- Hàm lượng đường khử (mg/g)

- Hoạt tính enzyme cellulase, xylanase (IU/ml) - Hiệu suất thủy phân (%)

2.3.6. Thủy phân rơm trong bình lên men với các điều kiện thời gian, mật độ BTM, pH và chất hoạt động bề mặt đã chọn ở các thí nghiệm

* Mục tiêu: Khảo sát hàm lượng đường khử được tạo ra trong quá trình thủy phân rơm

* Bố trí thí nghiệm

- Dùng 5 gam rơm đã chuẩn bị cho vào 500 ml môi trường Mandle chứa trong bình lên men, duy trì pH ở mức 4,5 bằng dung dịch đệm Natri-acetate 0,1

M, pH 4,5.

- Bào tử nấm mốc từ ống nghiệm được chuyển vào lọ thủy tinh có chứa Tween-80, 0,1% đã hấp khử trùng, mật độ bào tử bổ sung là 107 tế bào/ml với tỉ lệ 10% (v/v).

- Đặt bình lên men trên máy khuấy từ ở điều kiện nhiệt độ phòng. Theo dõi hàm lượng đường khử trong thời gian 5 ngày. Thí nghiệm được lập lại 3 lần

* Chỉ tiêu theo dõi

- Hàm lượng đường khử (mg/g)

- Hoạt tính enzyme cellulase, xylanase (IU/ml) - Hiệu suất thủy phân (%)

2.3.7. Lên men ethanol trong điều kiện cung cấp oxi với hai mức độ khác nhau với chủng Saccharomyces cerevisiae và Pichia stipitis nhau với chủng Saccharomyces cerevisiae và Pichia stipitis

* Mục tiêu: Theo dõi ảnh hưởng của việc cung cấp oxi trong quá trình lên men sinh ethanol

* Bố trí thí nghiệm

- Dùng 50 ml dịch thủy phân thu được từ thí nghiệm ở mục 2.3.6, có bổ sung hoặc không bổ sung dịch chiết nấm men và pepton, pH chưa hấp khử trùng là 5,79 cho vào bình tam giác 250 ml và đậy lại bằng nút bông. Sau đó, mang đi hấp khử trùng ở 1210C, trong thời gian 15 phút.

- Dùng 50 ml dung dịch glucose 6%, không bổ sung dịch chiết nấm men và pepton, pH chưa hấp khử trùng là 5,79 cho vào bình tam giác 250 ml và đậy lại bằng nút bông. Sau đó, mang đi hấp khử trùng ở 1210C, thời gian 15 phút.

- Bổ sung 2 ml dịch tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae và

Pichia stipitis có mật độ 109 tế bào/ml. Lắc trên máy lắc với hai mức vận tốc lắc khác nhau ở điều kiện nhiệt độ phòng và theo dõi hàm lượng ethanol trong thời gian 4 ngày. Hàm lượng ethanol (g/l) sinh ra được xác định bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp.

Bảng 2.5: Bố trí thí nghiệm lên men ethanol [28]

Thời gian lên men 4 ngày

Nghiệm thức 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Dịch thủy phân (ml) 0 50 50 50 50 0 50 50 50 50 Glucose 6% (ml) 50 0 0 0 0 50 0 0 0 0 Dịch chiết nấm men (g) 0 0 0 0,01 0,01 0 0 0 0,01 0,01 Pepton (g) 0 0 0 0,25 0,25 0 0 0 0,25 0,25 S. cerevisiae (ml) 2 2 2 2 2 2 Pichia stipitis (ml) 2 2 2 2 Vận tốc lắc (vòng/phút) 100 50

* Chỉ tiêu theo dõi

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN

3.1. Khảo sát ảnh hưởng của yếu tố thời gian đến hàm lượng đường khử tạo ra trong quá trình thủy phân rơm

3.1.1 Theo dõi sự thay đổi pH trong quá trình thủy phân

pH là một trong những yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân và quan trọng cho phản ứng thủy phân được diễn ra tốt nhất. Với 1 gam rơm dùng trong quá trình thủy phân và thí nghiệm được bố trí như mô tả ở mục 2.3.1, không điều chỉnh pH hỗn hợp ban đầu, giá trị pH ban đầu của hỗn hợp rơm trước khi hấp khử trùng trung bình là 5,37. pH hỗn hợp dung dịch ban đầu sau khi hấp khử trùng giảm 0,2.

Lô thí nghiệm theo dõi pH được bố trí riêng với lô thí nghiệm xác định hàm lượng đường khử trong cùng một điều kiện. Theo mỗi mốc thời gian: 3 ngày, 5 ngày, 7 ngày, 9 ngày, 11 ngày và 13 ngày tiến hành lấy dịch thủy phân trong các bình tam giác riêng lẻ, để xác định giá trị pH sau thủy phân. Từ kết quả của giá trị pH sau thủy phân vẽ đồ thị biểu diễn sự thay đổi pH theo các mốc thời gian trước và sau quá trình thủy phân trong thí nghiệm.

5.38 5.38 5.37 5.38 5.37 5.37 7.28 7.38 7.31 7.34 7.21 7.13 5.36 5.37 5.37 5.37 5.37 5.37 5.38 5.38 5.38 5.38 3 5 7 9 11 13

Thời gian (ngày)

G iá t rị p H 7.00 7.05 7.10 7.15 7.20 7.25 7.30 7.35 7.40 pH trước thủy phân pH sau thủy phân

Hình 3.1: Đồ thị biểu diễn sự thay đổi pH ở các mốc thời gian thí nghiệm Kết quả từ hình 3.1 cho thấy, giá trị pH bắt đầu tăng kể từ ngày thứ 3 của quá trình thủy phân, pH đã tăng lên 7,21 và giữ ở mức trên pH = 7 ở các

ngày tiếp theo. Giá trị pH tăng có thể là do trong suốt quá trình thủy phân các sản phẩm được tạo ra đã làm thay đổi giá trị pH. Tuy nhiên, trong phạm vị nghiên cứu của đề tài, không đủ điều kiện tìm hiểu kỹ hơn các yếu tố cụ thể làm thay đổi giá tri pH sau thủy phân mà chỉ tiến hành điều chỉnh giá trị pH trong quá trình thủy phân ở các thí nghiệm tiếp theo. pH sau thủy phân tăng lên có thể là do các sản phẩm tạo ra làm thay đổi số lượng các ion âm và ion dương dẫn đến sự thay đổi pH.

3.1.2. Hàm lượng đường khử theo thời gian

Mục tiêu của thí nghiệm là xác định thời điểm hàm lượng đường khử được tạo ra nhiều nhất, ở các mốc thời gian bố trí thí nghiệm, xác định hoạt tính enzyme celllulase và xylanase tạo ra trong quá trình thủy phân.

Với 1g rơm, không điều chỉnh giá trị pH hỗn hợp ban đầu, kết quả thu được hàm lượng đường khử được tạo ra trong quá trình thủy phân theo các mốc thời gian như bảng 3.1.

Bảng 3.1: Hàm lượng đường khử theo thời gian Thời gian

thủy phân (ngày) Hàm lượng đường khử (mg/g rơm)

3 5,61 ± 0.19 5 17,62 ± 0.76 7 11,80 ± 0.18 9 8,21± 0.13 11 5,44 ± 0.19 13 3,37 ± 0.19

Từ bảng 3.1 vẽ được đồ thị biểu diễn hàm lượng đường khử được tạo ra theo các mốc thời gian trong quá trình thủy phân như sau

5.61 17.62 11.80 8.21 5.44 3.37 0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 3 5 7 9 11 13

Thời gian (ngày)

H à m l ư ợ n g đ ư ờ n g k h ử ( m g /g r ơ m r ạ )

Hàm lượng đường khử trong dịch thủy phân

Hình 3.2: Đồ thị biểu diễn hàm lượng đường khử tạo ra theo thời gian Dựa vào kết quả trình bày ở bảng 3.1 và hình 3.2 ta thấy, hàm lượng đường khử ở thời gian 5 ngày là cao nhất (17,62 ± 0,76 mg/g rơm), kế đến là 7 ngày (11,80 ± 0,18 mg/g rơm). Hàm lượng đường giảm ở các ngày tiếp theo. Sự khác biệt giữa các kết quả ở thời gian 3, 5, 7, 9, 11 và 13 ngày khác nhau. Tuy nhiên, hàm lượng đường khử được tạo ra trong thời gian 3 ngày và 11 ngày là không khác nhau.

Từ kết quả trên ta có thể giải thích như sau, ở thời gian 5 ngày hàm lượng đường khử được tạo ra cao nên ức chế việc tiết enzyme của nấm mốc, ở giai đoạn này nấm mốc sử dụng lượng đường được tạo ra nên không tiết enzyme. Sau thời gian 7 ngày, 9 ngày lượng đường khử tiếp tục giảm và tiếp tục giảm ở thời gian 13 ngày. Lượng đường khử được tạo ra ở thời 5 ngày là cao nhất. Ngoài ra giá trị pH tăng cũng làm ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme cellulase và xylanase. Nên ta kết thúc quá trình thủy phân ở thời gian 5 ngày là hợp lý nhất.

3.1.3. Hoạt tính enzym cellulase

Thủy phân cellulose bởi enzyme từ nấm mốc đã được đề nghị để chuyển lignocellulosic thành các đường có thể dùng lên men ethanol. Trong nghiên cứu này, sự tăng trưởng của nấm mốc và hoạt tính enzyme phụ thuộc vào cơ chất và từng giai đoạn. Vì thế ta tiến hành xác định lượng đường khử được tạo ra và hoạt tính enzyme cellulase sinh ra trong quá trình thủy phân. Kết quả xác định hoạt tính enzym cellulase được trình bày ở bảng 3.2

Bảng 3.2: Hoạt tính enzym cellulase Thời gian thủy phân

(ngày) Hoạt tính enzyme cellulase (IU/ml)

3 0,13 ± 0,01 5 0,27 ± 0,01 7 0,21± 0,02 9 0,09 ± 0,01 11 0,08 ± 0,01 13 0,07 ± 0,01

Từ bảng 3.2 vẽ được đồ thị biểu diễn hoạt tính enzyme celllulase được tạo ra theo các mốc thời gian như sau

0.13 0.07 0.08 0.09 0.21 0.27 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 3 5 7 9 11 13

Thời gian (ngày)

H o ạt t ín h e n zy m e ce ll u la s e (I U /m l)

Hoạt tính enzyme cellulase (IU/ml)

Hình 3.3: Sự biến đổi hoạt tính cellulase thời gian

Dựa vào kết quả của bảng 3.2 và hình 3.3 ta nhận thấy hoạt tính enzyme cellulase ở thời điểm 5 ngày là cao nhất (0,27 ± 0,01 IU/ml), sau đó giảm dần cho đến ngày 13 là thấp nhất (0,07 ± 0,01 IU/ml). Hoạt tính của enzyme cellulase giảm dần kể từ ngày thứ 5, là do bị ức chế bởi các sản phẩm tạo ra trong quá trình thủy phân. Do sự tích tụ của glucose và cellobiose, mà cellobiose là một chất ức chế mạnh các hoạt động của cellobiohydrolase và endoglucanase trong quá trình thủy phân cellulose.

Nghiên cứu thời gian nuôi cấy để sản xuất cellulase tối đa ở 120 giờ. Với thời gian nuôi cấy dài hơn năng suất của cellulase có xu hướng giảm. Sự giảm hoạt tính của enzyme có thể là do tác dụng tích lũy của cellulobiose. Hoạt tính của enzyme cao hay thấp phụ thuộc vào cơ chất và mật độ nấm [24].

3.1.4. Hoạt tính enzym xylanase

Ngoài ra, trong quá trình thủy phân còn có sự hiện diện của enzyme xylanase, nên tiến hành xác định hoạt tính của enzyme xylanse trong quá trình

thủy phân. Kết quả xác định hoạt tính enzym xylanse được trình bày ở bảng 3.3 Bảng 3.3: Hoạt tính enzym xylanase

Thời gian thủy phân (ngày)

Hoạt tính enzyme xylanse (IU/ml) 3 0,34 ± 0,02 5 0,52± 0,02 7 0,44 ± 0,02 9 0,27 ± 0,04