Các Phản ứng Màu Của Axit Amin Và Protein. 1. Phản ứng Biure.

1. Trang chủ >
2. Luận Văn - Báo Cáo >
3. Công nghệ - Môi trường >

Các phản ứng màu của axit amin và protein. 1. Phản ứng Biure.

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (620.29 KB, 51 trang )

1.6.5. Khả năng thuỷ phân của protein

Các phân tử protein có thể bị thủy phân bằng axit, kiềm hay enzim cho các polypeptit và cuối cùng là các aminoaxit [1,3,6].2. CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG AMINOAXIT VÀ PROTEIN.2.1. Các phản ứng màu của axit amin và protein. 2.1.1. Phản ứng Biure.Đây là phản ứng đặc trưng của liên kết peptit. Trong môi trường kiềm, các hợp chất có chứa từ hai liên kết peptit trở nên có thể phản ứng với CuSO4tạo thành phức chất màu xanh tím, tím, tím đỏ tuỳ thuộc vào số lượng liên kết peptit nhiềuhay ít. Các phản ứng xảy ra như sau: Phản ứng tạo biure.C OHHN NHC O2H2N NH3NH2NH2H2N C OC ON HN HC OHUre Biure xetoBiure enol Phản ứng với protein.Cũng tương tự như trường hợp của biure, các liên kết peptit ở dạng enol trong môi trường kiềm của các phân tử protein tạo phức với Cu2+:2HN C OHN HC OHCuOH2NaOHONa ONaC NHC OCu HNNHHN NHC O+ +NH HNCDạng phức hợp như trên với bốn nguyên tử nitơ tham gia tạo liên kết phối trí thường có màu đỏ hấp thụ cực đại ở bước sóng 520-535nm. Trong trường hợp chỉcó hai hay ba nguyên tử N tham gia tạo liên kết thì phức sẽ có màu tím hoặc màu xanh hấp thụ cức đại ở những bước sóng tương ứng là 540-580 và 615-670nm. Vìvậy, thơng thường sản phẩm phản ứng của các polypeptit khác nhau sẽ có màu thay đổi từ xanh tím đến đỏ tím. Phản ứng biure thường được ứng dụng để định lượngprotein [1,3,6,9].

2.1.2. Phản ứng với ninhiđrin.

Các aminoaxit khi phản ứng với ninhiđrin ở nhiệt độ cao cho sản phẩm có màu xanh tím hấp thụ cực đại ở khoảng bước sóng 570nm. Đây là phản ứng chung chotất cả các aminoaxit có chứa nhóm NH2ở vị trí Cỏ. Ngồi -aminoaxit, các peptit, protein, muối amoni và amoniac cũng cho phản ứng này. Cơ chế phản ứng kháphức tạp như sau:Đầu tiên do tác dụng của các aminoaxit với ninhiđrin sẽ xuất hiện phức chất dạng bazơ-schiff. Sau đó xảy ra sự chuyển nhóm, tiếp theo là sự đề cacboxyl hoávà sự phân tách phức chất thành anđehit và aminođixetohiđrinden.O OO H2NCHR CHR COOHH CO2-H2O NN NinhiđrinAminoaxit Bazơ - SchiffChuyển nhóm và loại+OO OO CHR COOHAminođixetohiđrinden lại ngưng tụ với một phân tử ninhiđrin khác và hình thành nên một hợp chất mới, đồng thời bị enol hoá và chuyển thành dạng cú mu.C NH2CHR RH H+H2O-H2O NNPhức màu xanh tím Aminoxetohiđrinden+ +O OO HOONH2H OO OO OOO OOKhi có các dung môi hữu cơ axeton, etanol,piriđin … thường được dùng để pha ninhiđrin thì sẽ xảy ra phản ứng sau:CH CHCHR RH-H2O NNPhøc cã mµu +OO OO OOO-O O-CH2Sản phẩm của phản ứng này có chứa gốc R của aminoaxit ban đầu. Gốc này sẽ quyết định màu sắc khác nhau xanh da trời, đỏ… của các hợp chất khi phảnứng với ninhiđrin. Đặc biệt phức chất được tạo thành giữa prolin có chứa nhóm imin vàninhiđrin có màu vàng tươi, khác biệt hẳn với màu do các aminoaxit khác tạo nên trong phản ứng. Do vậy, ninhiđrin còn được sử dụng cho phản ứng màu đặc trưngđể phát hiện prolin:COOH ++ +O OO OHN O-N+CO2H2OPhức màu vàngPhản ứng với ninhiđrin có độ nhạy cao, do đó thường được dùng để định tính và định lượng protein [1,3,6].

2.1.3. Phản ứng với axit HNO

2.Dưới tác dụng của HNO2, aminoaxit bị deamin hoá tạo thành nitơ ở dạng khí. Phản ứng này được sử dụng để định lượng các -aminoaxit phương pháp VanSlyke [6]. Phản ứng xảy ra như sau:O OHH2O H2N CHCOOHR N2+ ++ NHO CHCOOHR

2.1.4. Phản ứng Pauli để phát hiện histiđin và tirozin.

Khi tác dụng với axit điazobenzensunfonic thuốc thử diazo, histiđin tạo thành phức chất màu mận chín, còn tirozin tạo thành phức chất màu da cam [6].Các phản ứng xảy ra như sau:Sự tạo thành axit điazobenzensunfonic:O H2NN N+ ++ +O OS HClNaCl OHNaNO2O OS 2H2OPhản ứng của tirozin:O CHN N+ ++N OCOOHN SNa2CO3H2CO3O ON NO OO S2 OHCH2NH2ONa ONaCH COOH OHCH2NH2SPhức màu da cam.

2.1.5. Phản ứng Millon đặc trưng cho tyrozin.

Thuốc thử Millon chính là muối thuỷ ngân nitrat trong HNO3đặc. Khi cho thuốc thử Millon tác dụng với nhân phenol của tirozin sẽ tạo nên hợp chấtnitrotirozin-thuỷ ngân có màu đỏ. Phản ứng xảy ra như sau:CH COOH OHCH2NH2CH COOH CH2NH2+ ++ HgNO3HNO3O2N OOHg OH2O NPhản ứng Millon được sử dụng để phát hiện tyrozin và các hợp chất phenol. Chú ý không cho quá nhiều thuốc thử Millon vì HNO3có trong thuốc thử sẽ tác dụng với protein cho màu vàng [6].

2.1.6. Phản ứng của các axit amin chứa lưu huỳnh Phản ứng Folia.

Các axit amin chứa lưu huỳnh như xistin, xistein, methionin dưới tác dụng của kiềm bị phân huỷ tạo thành natri sunfua Na2S:RSH + 2NaOH  Na2S + ROH + H2OThêm chì axetat vào Na2S sẽ phản ứng tạo thành kết tủa nâu đen của chì sunfua PbS [6].Na2S + PbCH3COO2 2CH3COONa + PbS kết tủa nâu đen

2.1.7. Phản ứng Sakaguchi đặc trưng cho acginin.

Đây là phản ứng dùng để phát hiện acginin. Khi cho acginin tác dụng với hipobromua NaBrO và ỏ-naphtol sẽ tạo thành sản phẩm có màu đỏ cam [6].Phản ứng có thể được trình bày như sau:C OCOOH NaBrH2O NaBrONH2CH2 312N2CHNH2NH NH+ ++ ++ HOCCOOH NH2CH2 3CHNH2NH

2.1.8. Phản ứng Adamkievic đặc trưng cho tryptophan.

Trong môi trường axit, tryptophan phản ứng với nhiều loại anđehit tạo thành những sản phẩm ngưng kết có màu đỏ tím đặc trưng [6].Các phản ứng xảy ra như sau: OH HH ++ OC HOOCH2SO4CO2Axit glioxilic FocmanđêhitCO +H2SO4Bis-2-triptophanylmetal CH2CH2COOH H2N CH+ ++ NHNH HH CCH2COOH CHNH CH2COOH CHCH2COOH H2N CHNH NH2NH2H2OO Bis-2-triptophanylmetalBis-2-triptophanylcacbinol CH2CH HNH CH2COOH CHCH2COOH H2N CHNH NH2Oxi ho¸ NHCH2COOH CHCH2COOH H2N CHNH NH22.2.Định lượng axit am in và protein.

2.2.1. Xác định N -amin bằng phương pháp chuẩn độ focmol.

Các aminoaxit có thể phản ứng với focmol trung tính để tạo thành metyl - aminoaxit. Focmol đã khố nhóm amin NH2mang tính kiềm nên có thể chuẩn độ nhóm cacboxyl trong phân tử aminoaxit bằng kiềm. Dựa vào lượng kiềm đã dùngđể chuẩn độ sẽ tính được lượng Nitơ của aminoaxit [6,9]. Phản ứng được biểu diễn như sau:COOH COOH+ +CH2R CH CH OAminoaxit FocmolMetyl-aminoaxit RCH NH2H NH2O

2.2.2. Định lượng protein bằng phương pháp Kjeldahl.

Lượng nitơ tổng số trong các phẩm vật có nguồn gốc sinh vật thường được xác định bằng phương pháp Kjeldahl. Đó là hàm lượng tổng của các dạng nitơ hữucơ và vô cơ có trong phẩm vật nghiên cứu. Để định lượng nitơ protein, người ta thường xác định nitơ tổng số và nitơ phi protein theo phương pháp Kjeldahl, sau đólấy hiệu số giữa hai dạng nitơ này rồi nhân với hệ số tương ứng [6,9].Lưu ý: Các protein thực vật có tỷ lệ nitơ protein khoảng 16.8, do vậy trongtrường hợp này hệ số nhân sẽ là 5.95 100 : 16.8. Các protein động vật có tỷ lệ nitơ protein khoảng 16, do vậy trong trường hợp này hệ số nhân sẽ là 6.25 100 : 16[6].

2.2.2.1. Xác định nitơ tổng số theo phương pháp Kjeldahl.

Dưới tác dụng của H2SO4đặc ở nhiệt độ cao, các hợp chất hữu cơ có chứa nitơ N bị phân huỷ và bị oxi hoá đến CO2và H2O, còn nitơ chuyển thành amoniac và tiếp tục kết hợp với H2SO4tạo thành muối amoni sunfat. Quá trình được tiến hành qua các bước sau:Vơ cơ hố ngun liệu. R-CHNH2-COOH + H2SO4 CO2+ H2O + NH4 2SO4Cất đạm. NH4 2SO4+ 2NaOH  Na2SO4+ 2H2O + 2NH3 Phản ứng xảy ra trong bình hứng:2NH3+ H2SO4 NH4 2SO4Chuẩn độ H2SO4dư ở bình hứng bằng NaOH 0.1N.

2.2.2.2. Xác định nitơ phi protein.

Để xác định N-phi protein cần dùng các dung mơi thích hợp để chiết rút tất cả các dạng N-phi protein ví dụ dung môi là etanol 70. Tuy nhiên, trong dịchchiết vẫn còn lẫn một vài loại protein, vì vậy cần dùng chất kết tủa để tách phần protein hồ tan trong q trình chiết rút.Kết tủa protein có thể tiến hành theo nhiều cách như: bằng etanol, axeton, các muối kim loại nặng, axit hoặc đun ở nhiệt độ cao … nhưng thông dụng nhất làdùng các chất kết tủa sau đây: TCA 10-20, poly nhôm clorua PAC với chất trợ keo tụ dạng âm A101, polyme C310H keo tụ dương PbCH3COO210-15, CuSO410 trong hỗn hợp với NaOH 10, tỷ lệ 1 : 1 [5,6]. Sau khi đã loại bỏ kết tủa, dịch lọc chỉ còn chứa các dạng N-phi protein.Đem vơ cơ hố dịch này và tiếp tục tiến hành xác định hàm lượng nitơ theo phương pháp Kjeldahl.

2.2.2.3. Định lượng protein trong nguy ên liệu.

N-tổng số bao gồm N-protein và N-phi protein. Muốn xác định hàm lượng protein trong nguyên liệu phải xác định N-tổng số và N-phi protein.Hàm lượng protein trong mẫu được tính theo công thức sau:Protein mg = Ntổng số- Nphi protein.6,25 Hoặc Protein mg = Ntổng số- Nphi protein.5,95

2.2.3. Định lượng protein theo phương pháp Bradford.

Các protein khi phản ứng với xanh Coomassie Coomassie Brilliant Blue - CBB sẽ hình thành hợp chất màu có khả năng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 595nm, cường độ màu tỷ lệ với nồng độ protein trong dung dịch. Phương pháp có độ nhạy cao, cho phép phát hiện tới vài g proteinml, dễ thực hiện và tiết kiệm thờigian [6,9]

2.2.4. Định lượng protein theo phương pháp Lowry.

Protein tác dụng với thuốc thử Folin-Ciocalteux tạo thành sản phẩm màu xanh. Đây là sản phẩm khử của photphomolipđat-photphovolframat bởi phức chấtĐồng-Protein và có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 750 nm. Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỷ lệ thuận với nồng độ Protein trong một phạm vi cho phép.Dùng máy so màu quang điện để xác định cường độ màu trong các mẫu và so sánh với dịch protein tiêu chuẩn.Phương pháp Lowry sử dụng kết hợp phản ứng Biure tác dụng lên liên kết peptit, mục 2.1.1. và phản ứng với thuốc thử Folin tác dụng lên các gốc Tyrozin,Tryptophan, Histiđin để tạo phức có màu đặc trưng. Phương pháp có độ nhạy tương đối cao, cho phép xác định được đến nồng độ vài chục g protein, do vậyđược sử dụng rộng rãi để xác định nhiều loại protein ở dạng tương đối tinh khiết. Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp là màu của phức chất bị ảnh hưởngnếu trong dung dịch có chứa một số chất như EDTA, sacarozơ, đệm Tris hay một số chất khử như xistein, ditiotreitol ... [4,6,9]

2.2.5. Định tính và định lượng aminoaxit bằng phương pháp sắc ký giấy.

Phương pháp sắc ký phân bố trên giấy dựa vào sự khác nhau về hệ số phân bố các chất tan giữa hai pha lỏng không trộn lẫn.Người ta mang lên một điểm ở đầu bản giấy sắc ký một giọt dung dịch nghiên cứu rồi nhúng đầu giấy có mang dung dịch nghiên cứu đó vào chậu dung môi hữucơ linh động bão hồ nước như rượu butilic. Trong q trình di chuyển chậm của dung môi qua ống mao dẫn của giấy, cáccấu tử riêng biệt của hỗn hợp sẽ chuyển dịch theo với vận tốc khác nhau, nhờ vậy mà hỗn hợp được phân chia ra thành các cấu tử thành phần.Sự chuyển dịch của các chất trong khi tiến hành sắc ký có thể giải thích như sau: Các sợi xenlulozơ của giấy có ái lực lớn đối với nước và hấp phụ nước trongdung mơi hữu cơ bão hồ nước đóng vai trò là chất mang . Ở đây pha tĩnh là nước, có chứa trong nước khoảng 20, còn dung mơi hữu cơ là chất lỏng linh động khidung môi chảy qua phần giấy có chứa dung dịch nghiên cứu thì một phần các chất chuyển vào dung môi pha động . Khi dung môi tới phần giấy khơng có chứa cácchất phân tích thì ở đó lại xảy ra quá trình phân bố các chất giữa pha tĩnh là nước và pha động là dung môi hữu cơ. Lần này, các chất lại chuyển từ dung môi pha hữucơ sang pha nước. Như vậy, nếu cho dung môi chuyển dịch liên tục qua giấy, các chất phân tích sẽ được chuyển từ điểm mang ban đầu đến một điểm khác trên giấytheo hưưóng chảy của dung mơi do kết quả của quá trình tách phân bố liên tục giữa hai pha tĩnh và động.Quá trình phân tích này được tiến hành trong thiết bị kín bão hồ của dung mơi và nước. Khi tuyến dung môi đã đi được đoạn đường 30 – 40 cm, người ta lấygiấy ra sấy khô và phun thuốc nhuộm màu, nhờ đó xác định được vị trí của các cấu tử trên dải giấy. Dải giấy sau khi hiện màu gọi là sắc ký đồ.Trong thực tiễn, hệ số vận tốc chuyển dịch ký hiệu là Rf có ý nghĩa rất lớn. Hệ số vận tốc chuyển dịch Rf là tỉ số giữa quãng đường đi được của chất so vớiquãng đường chuyển dịch của dung môi. Rf = Quãng đường dịch chuyển của chất Quãng đường dịch chuyển của dung môi.Rf: Là đại lượng đặc trưng và không đổi đối với mỗi chất trong những điều kiện xác định.Tuỳ thuộc vào hướng hoặc chiều chuyển dịch của dung môi, người ta phân biệt một số dạng sắc ký như sau:Sắc ký nghịch: Khi dung môi chảy dịch từ dưới lên trên. Sắc ký thuận: Khi dung mơi chảy từ trên xuống.Sắc ký vòng tròn: Khi dung mơi chuyển dịch từ tâm ra xung quanh. Ngồi ra, người ta còn phân biệt: Sắc ký một chiều khi cho dung môi chuyển dịchtheo một hướng nhất định. Sắc ký hai chiều khi cho dung môi chuyển dịch theo một chiều nào đó, sau đấy sấy khơ và cho dung mơi chảy theo một chiều khác vng gócvới chiều ban đầu.Phương pháp sắc ký giấy một chiều có thể thuận hoặc nghịch là phương pháp đơn giản nhất, chỉ dùng một hệ dung môi nào đó. Khả năng phân tích kém hơnsắc ký hai chiều. Trong sắc ký thuận, hệ số vận tốc chuyển dịch Rf lớn, nhưng các vết màu thuđược khơng gọn, còn trong sắc ký nghịch đại lượng Rf nhỏ hơn, nhưng vết màu lại gọn hơn.Để định lượng các axit amin người ta thường sử dụng các phương pháp sau: So sánh bằng mắt thường cường độ màu và diện tích các vết màu của hợpchất đã cho với cường độ màu và diện tích các vết màu của hỗn hợp đối chứng đã biết rõ nồng độ.Đo chiết suất của dịch chiết chất màu từ sắc ký đồ bằng một dung mơi thích hợp. Sai số của phương pháp này khoảng 3 – 6 .Dùng densitomet đo mật độ màu của các vết trong khi cho ánh sáng xuyên qua. Độ chính xác của phép đo tăng lên đến 10 – 15 [8,9]

2.2.6. Xác định aminoaxit v à peptit bằng sắc ký lỏng pha ngược và sắc ký lỏng

khối phổ thầy xem và sửa giúp em mục này [10].Phương pháp mới cho phép xác định nhạy các aminoaxit và peptit là sử dụng thuốc thử 2-9-carbazole-ethyl chloroformate CEOC với máy dò huỳnh quangFL đã được phát triển. Sự phát hiện ra các dẫn xuất đã được tiến hành bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ. Nhóm mang màu trong thuốc thử 2-9-fluorenyl-ethyl chloroformate FMOC đã được thay thế bằng carbazole,dẫn đến một tác nhân dẫn xuất có tính nhạy quang là CEOC. CEOC có thể phân loại cácpeptit và aminoaxit dễ dàng và nhanh chóng. Chất dẫn xuất đủ bền để có khả năng phân tích bởi phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC. Hiệu suất tạo dẫnxuất cực đại gần 100 được quan sát với số mol thuốc thử vượt quá 3-4 lần và nằm trong khoảng pH = 8.8  10. Các dẫn xuất có độ nhạy quang mạnh cho phépbơm thẳng vào hỗn hợp phản ứng mà không làm xáo trộn đáng kể bởi sản phẩm phụ trong quá trình phân huỷ tác nhân nhạy quang như là 2-9-carbazole-ethanol và 2-9-carbazole-ethyl carbonate. Thêm vào đó, q trình phát hiện sự phản ứng với dẫn xuất CEOC được so sánh với quá trình phát hiện sự phản ứng thu dược bằngFMOC. Tỷ lệ ACCEOCACFMOC= 1.00  1.82 cho sự cảm ứng phát huỳnh quang FL và ACCEOCACFMOC= 1.00  1.21 cho sự cảm ứng tử ngoại - cực tím UV. Ở đây AC và AC là sự cảm ứng tương ứng giữa FL và UV. Sự phân tách các chất dẫnxuất của peptit và aminoaxit dã được tối ưu hoá trên cột Hypersil BDS C18. Phương pháp này được sử dụng thành cơng để phân tích protein thuỷ phân từ len và từ dẫnxuất trực tiếp của bia.

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM

Xem Thêm

Tài liệu liên quan

• PROTEIN VÀ CÁC CHỨC NĂNG
  • 51
  • 1,470
  • 5

Tải bản đầy đủ (.pdf) (51 trang)

Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

(620.29 KB) - PROTEIN VÀ CÁC CHỨC NĂNG-51 (trang) Tải bản đầy đủ ngay ×