Hình 2. Các Bộ Phận Cơ Học Và Quang Học Của Kính Hiển Vi Một Mắt.

Có thể bạn quan tâm

Trang chủ >
Khoa Học Tự Nhiên >
Sinh học >

Hình 2. Các bộ phận cơ học và quang học của kính hiển vi một mắt.

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (10.18 MB, 93 trang )

41.2.1. Các bộ phận cơ học.- Chân kính (đế kính): Thường có hình móng ngựa, hình chữ nhật, thường to và nặng đểgiữ các phần trên của kính. Trong chân kính có bộ phận lắp đèn hoặc gương phản chiếu đểcung cấp ánh sáng khi soi kính. Ở một số kính hiển vi có bộ phận biến thế điện và có thể điềukhiển để tăng hoặc giảm cường độ ánh sáng khi soi kính.- Thân kính: Thường có hình dấu ngoặc. Đầu trên thân kính gắn với ống kính và mâmxoay, đầu dưới gắn với đế kính. Giữa thân kính có các bộ phận. ốc vi cấp, ốc đại cấp, mâmkính, hộp tụ quang. Thân kính còn là chổ tay cầm khi ta di chuyển kính hiển vi.- Ống kính: Là đoạn ống nằm ở phần trên của kính, có 1 ống kính đối với kính 1 mắt và 2ống kính đối với kính 2 mắt. Đầu trên ống kính gắn với thị kính, đầu dưới gắn với thân kínhvà mâm xoay.- Hệ thống ốc di chuyển:+ Ốc đại cấp (ốc to): để điều chỉnh mâm kính ở khoảng cách lớn, di chuyển nhanh mâmkính trên một đoạn dài (khoảng từ 2,5cm đến 5cm).+ Ốc vi cấp (ốc nhỏ): để di chuyển mâm kính ở khoảng cách nhỏ, điều chỉnh cho rõ nétmẫu vật.+ Ốc hộp tụ quang: dùng để nâng hay hạ hộp tụ quang. Khi nâng hộp tụ quang lên ánhsáng mạnh dần lên, khi hạ hộp tụ quang xuống ánh sáng yếu dần xuống. Một số kính đã cónúm điều chỉnh ánh sáng nên không có ốc hộp tụ quang.Dưới hệ thống thấu kính của hộp tụ quang có bộ phận chắn sáng được sắp xếp bởi các láthép đồng tâm và có que điều chỉnh hệ thống chắn sáng. Người ta có thể thay đổi độ sáng khiquan sát tiêu bản bằng cách thay đổi mức độ đóng mở của bộ phận chắn sáng bằng que điềuchỉnh hệ thống chắn sáng.Dưới hệ thống chắn sáng có một khay tròn, bên trong có gờ dùng để lắp kính lọc màu.- Mâm kính: Hình chữ nhật hoặc hình vuông. Giữa mâm kính có lổ hình tròn hoặc hìnhchữ nhật để ánh sáng xuyên qua khi soi kính làm sáng mẫu vật. Trên mâm kính có gắn hệthống xe đẩy và kẹp giữ tiêu bản. Mâm kính dùng để dặt tiêu bản.- Hệ thống xe đẩy và kẹp giữ tiêu bản:Hệ thống xe đẩy được cấu tạo bởi những thanh thép răng cưa trượt lên nhau và được điềukhiển bởi hai ốc. Hai ốc của hệ thống xe đẩy (có thể cùng trục hoặc khác trục) dùng để dichuyển mẫu vật trên tiêu bản theo hai hướng vuông góc với nhau. Nhờ vậy mà ta có thể điềuchỉnh mẫu vật về vị trí theo ý muốn. Trên các thanh của xe đẩy có chia vạch dùng để xác địnhtọa độ của hình ảnh đang quan sát trên tiêu bản khi cần thiết.Kẹp giữ tiêu bản gắn với một thanh của xe đẩy dùng để kẹp giữ chặt tiêu bản vào xe đẩy.- Mâm xoay: Hình tròn, xoay được quanh một trục. Trên mâm xoay có các điểm để gắn vậtkính. Khi muốn thay đổi độ phóng đại của vật kính, ta dùng mâm xoay này.1.2.2. Các bộ phận quang học.- Gương (đèn): Gương dùng để hứng ánh sáng và phản chiếu ánh sáng cho kính hoạt động.Gương có 2 mặt: Mặt phẳng dùng khi ánh sáng mạnh, mặt lõm dùng khi ánh sáng yếu. Có thểdùng gương hoặc dùng đèn để cung cấp ánh sáng cho kính hoạt động.Những kính dùng đèn thường có thêm bộ phận điều chỉnh ánh sáng mạnh yếu khi cần thiếtvà mặt trên của hộp đèn có bộ phận để lắp kính lọc màu.- Kính lọc màu: Là các tấm thủy tinh hoặc nhựa màu chịu nhiệt. Có nhiều loại kính màukhác nhau dùng để chống mỏi mắt khi quan sát trên kính lâu hoặc dùng để làm nền màu khicần quan sát rõ nét 1 mẫu vật nào đó.- Tụ quang: Là một hệ thống thấu kính hội tụ để hội tụ ánh sáng thành một chùm sángmạnh, tập trung để làm sáng mẫu vật khi soi kính. Dưới hệ thống thấu kính hội tụ là hệ thốngchắn sáng. Bên dưới cùng của hộp tụ quang có thể có gắn bộ phận để lắp kính lọc màu.- Vật kính: Là phần quan trọng nhất trong hệ thống quang học của kính hiển vi, nó quyếtđịnh khả năng nhìn rõ của kính. Bên ngoài mỗi vật kính có khắc độ phóng to của vật kính và5các tính chất khác của vật kính.Ví dụ:+ Vật kính khô:- 40 / 0,65 - 100 / 0,27 / 0,5 .- 10 / 0,25 - 100 / 7,2.- 3,2 (4,0) / 0,10160Hai loại vật kính x3,2 (4,0) và x10 không đòi hỏi độ dày của lá kính (Lamen). Trên tiêubản quan sát có thể không cần đậy lá kính (Lamen).+ Vật kính dầu:- HI 100 / 1,25 - 100 / 0,17 .Các loại vật kính x40, x100 (vật kính có trị số mở cao và vật kính chìm) yêu cầu độ dàycủa lá kính (Lamen) là 0,17 mm (có thể thay đổi từ 0,15 – 0,19 mm).Ở những vật kính có độ phóng đại càng lớn thì khoảng cách giữa đầu vật kính đến lamencàng nhỏ. Do đó, khi thay đổi vật kính cần chú ý để khỏi chạm vào tiêu bản.Khi quan sát ở kính hiển vi, ngoài độ phóng to của kính, người ta còn chú ý đến khả năngphân ly của vật kính ( là khoảng cách có thể nhìn rõ được giữa hai điểm gần nhau nhất). Khảnăng phân ly (d) được tính theo biểu thức sau:λd=2nsinαλ: Độ dài bước sóng phát ra từ mẩu vật.n: Chỉ số chiết quang của môi trường giữa mẫu vật và vật kính.α: Nửa góc mở của vật kính.2nsinα : Trị số mở của vật kính.Qua đó, ta thấy muốn có độ phân ly cao phải dùng ánh sáng có bước sóng thật ngắn, hoặcdùng vật kính có trị số mở lớn.Nếu dùng vật kính có trị số mở 0,65 và soi với ánh sáng trắng (có bước sóng trung bình λ= 0,55 µm) thì khoảng cách nhỏ nhất có thể nhìn thấy rõ được là:0,55d== 0,85 µm0,65Với những chi tiết có khoảng cách nhau dưới 0,85 µm thì người ta không phân biệt được.Trong khi đó nếu dùng thị kính có độ phóng đại lớn hơn cũng không ích gì mà phải thay vậtkính khác có trị số mở lớn hơn.Nếu thay vật kính chìm (vật kính dầu – x100) thì khoảng cách nhỏ nhất giữa các chi tiếtcủa vật soi có thể thấy được là:0,55d== 0,44 µm1,25Vì λ đã xác định bởi nguồn ánh sáng thấy, muốn giảm d để tăng khả năng phân tích củakính thì chỉ có cách là tăng nsinα. Trong số này góc α bị giới hạn bởi nhiều sai lệch khó điềuchỉnh, còn lại là chỉ số chiết quang n. Nhưng n không được cao hơn chỉ số chiết quang củacác thấu kính trong vật kính, nên người ta chỉ nâng n giữa vật kính và mẫu vật bằng một chấtdầu gọi là dầu bách hương (dầu cede) để đạt chỉ số chiết quang tối đa mong muốn bằng chỉ sốchiết quang của thấu kính.Vì vậy mà kính hiển vi quang học cho tới nay vẫn dừng ở độ phóng đại lý thuyết là 30006với bộ thấu kính: Thị kính 20x, trung gian 1,5x và vật kính 100x. Trong thực tế thì độ phóngđại này không dùng vì tối đa độ phóng đại thường dùng được với ánh sáng thấy là 1000 lần,với khoảng cách phân biệt được là 0,2 Micrômet. Những vật kính tốt dùng để nghiên cứu cóthể soi đạt ở độ phóng đại 1500 lần.Kính hiển vi điện tử giúp ta thấy được hình ảnh của mẫu vật trên một màn huỳnh quanghoặc trên bản phim chụp ảnh. Về nguyên lý cũng tương tự như kính hiển vi quang học phải cónhững chùm tia. Ở đây không phải là ánh sáng mà là chùm tia điện tử. Các chùm tia điện tửcó bước sóng vô cùng ngắn được khuyếch đại bởi các “thấu kính” điện tử hoặc từ để cuốicùng đập lên một màn huỳnh quang hoặc phim ảnh cho hình ảnh của mẫu vật nơi mà cácchùm tia điện tử đã xuất phát.Sự tiến bộ kỹ thuật của kính hiển vi điện tử có thể còn nâng cao độ phóng đại của kính hiểnvi điện tử và cũng không phải chỉ là vấn đề độ phóng đại mà còn là ở những hình ảnh nổi chophép thấy được ảnh có chiều sâu, có độ lồi lõm phức tạp. Phương pháp này gọi là phươngpháp hiển vi điện tử quét.Kính hiển vi điện tử có độ phóng đại rất lớn (có thể tới trên 60 vạn lần) vì dùng nguồn điệntử thay cho nguồn ánh sáng thường. Chiều dài bước sóng của chùm tia điện tử trong điều kiệnchân không ngắn hơn bước sóng của ánh sáng thường khoảng 1000 lần, nghĩa là dao độngtrong khoảng 0,0004 – 0,0007 µm. Vì vậy kích thước vật nhỏ nhất có thể nhìn thấy được dướikính hiển vi điện tử vào khoảng 0,8 nm ( 1nm = 1/1000 µm).- Thị kính: Gắn ở đầu trên của ống kính. Thị kính có cấu tạo đơn giản hơn vật kính, chỉgồm 2 thấu kính và một cái chắn sáng ở giữa. Trên mỗi thị kính đều ghi độ phóng đại của nó.Ví dụ: 5x, 6x, 10x, 15x.Độ phóng đại chung của kính hiển vi (ký hiệu L) sẽ bằng độ phóng đại của vật kính (kýhiệu Lv) nhân với độ phóng đại của thị kính (ký hiệu Lt).L = Lv x Lt1.3. Cách sử dụng và bảo quản kính hiển vi quang học.1.3.1. Sử dụng.Trước khi sử dụng phải kiểm tra tất cả các bộ phận của kính, dùng khăn mềm để lau các bộphận của kính (Chú ý: chỉ lau bên ngoài, không tháo rời các bộ phận của kính), để kính ngayngắn vừa với tầm ngồi, sau đó tiến hành tuần tự các bước tiếp theo để soi tiêu bản.Bước 1: Lấy ánh sáng.+ Đối với kính hiển vi phải dùng gương để lấy ánh sáng từ bên ngoài thì làm như sau:Chọn phía sáng nhất để làm nguồn sáng, quay gương về phía nguồn sáng đã chọn (nếu ánhsáng mạnh thì dùng mặt phẳng, nếu ánh sáng yếu thì dùng mặt lõm của gương), mở que chắnsáng nếu hệ thống chắn sáng bị đóng. Mắt nhìn qua lổ trên mâm kính, tay điều khiển gươngsao cho thấy mặt trên hộp tụ quang có 1 chùm sáng mạnh là đạt yêu cầu. Xoay vật kính nhỏnhất (vật kính 10) về trục kính (khi nghe tiếng cạch nhẹ là đã đúng vị trí).Mắt nhìn vào thị kính, thấy vi trường sáng tròn đều là được Nếu vi trường chưa sáng trònđều thì mắt nhìn vào thị kính, tay điều khiển gương cho đến khi được vi trường sáng tròn đều.+ Đối với kính hiển vi dùng ánh sáng đèn thì cắm dây đèn vào ổ cắm, bật công tắc, điềukhiển núm chỉnh ánh sáng ở đế kính để có được ánh sáng thích hợp. Xoay vật kính nhỏ nhất(vật kính 10x) về trục kính như trên.Bước 2: Đặt tiêu bản vào mâm kính.Trước khi đặt tiêu bản vào mâm kính, phải chọn mặt phải, mặt trái của tiêu bản. Mặt phảicủa tiêu bản thường có dán lamen, dán nhãn (nếu có lamen và nhãn) hoặc làm giảm bớt độ lóacủa gương khi để nghiêng soi ra ánh sáng (nếu không có lamen, không có nhãn).Để mặt phải của tiêu bản lên trên, tay phải mở kẹp tiêu bản, tay trái cầm phía đầu nhãntiêu bản, đặt tiêu bản vào mâm kính và tay phải thả kẹp giữ tiêu bản ra. Tiêu bản được giữchặt vào xe đẩy, trên mâm kính.Dùng ốc xe đẩy để điều chỉnh sao cho mẫu vật nằm đúng vào trục kính (giữa lổ mâm kính)7Chú ý: Có thể dùng điểm sáng của hộp tụ quang để làm điểm chuẩn khi điều chỉnh mẫu vậtvề điểm trục kính, nếu mẫu vật nhỏ quá.Bước 3: Quan sát.Nguyên tắc bắt buộc khi quan sát là phải quan sát được ở vật kính có độ phóng đại nhỏ, rồimới chuyển sang quan sát ở vật kính có độ phóng đại lớn hơn kề nóQuan sát ở vật kính 10x:Sau khi đặt tiêu bản đúng chỗ, mắt nhìn vào khoảng cách giữa tiêu bản và vật kính x10, tayđiều khiển ốc đại cấp để nâng mâm kính lên cho đến khi khoảng cách giữa vật kính và tiêubản còn 1/2cm thì dừng lại. Mắt nhìn vào thị kính, hạ từ từ mâm kính xuống cho đến khi thấyrõ mẫu vật.Điều chỉnh ốc vi cấp để quan sát.Quan sát ở vật kính 40x:Ở vật kính 40x cần nhiều ánh sáng hơn, do vậy phải nâng hộp tụ quang lên hoặc phải điềuchỉnh ốc chỉnh sáng để có ánh sáng mạnh thích hợp.Ở vị trí quan sát được bởi vật kính 10x, xoay vật kính 40x về phía trục kính, mắt nhìn vàothị kính, tay điều khiển ốc vi cấp cho đến khi thấy rõ mẫu vật. Quan sát mẫu vật ở vật kính40x.Chú ý. Từ vật kính 40x trở lên, khoảng cách giữa vật kính và tiêu bản rất ngắn, nên khôngđược sử dụng ốc đại cấp điều chỉnh kính để tránh làm vỡ tiêu bản.Quan sát ở vật kính 100x.Vật kính 100x còn gọi là vật kính dầu (vật kính chìm) vì vật kính này khi sử dụng nó luônluôn chìm trong dầu.Nhỏ một giọt dầu cede (dầu soi kính hiển vi) lên mẫu vật trên tiêu bản tại điểm đã quan sátở vật kính x40. Để nguyên vị trí đã quan sát được ở vật kính 40x, xoay vật kính 100x về trụckính. Đầu vật kính 100 sẽ chạm vào giọt dầu cede. Nâng hộp tụ quang lên tối đa (hoặc điềukhiển ốc chỉnh sáng cho ánh sáng mạnh nhất). Mắt nhìn vào thị kính, tay điều khiển ốc vi cấpcho đến khi thấy rõ mẫu vật. Quan sát ở vật kính 100x.Trong phòng thực tập khi sử dụng vật kính 100x phải có sự chỉ dẫn của cán bộ hướng dẫnthực hành.* Một số điểm cần chú ý khi sử dụng kính hiển vi.- Khi quan sát, cần thường xuyên nhấp nháy ốc vi cấp để thấy được đầy đủ trên các mặtphẳng khác nhau của vi phẩu.- Ốc vi cấp chuyển động được cả 2 chiều, mỗi chiều ít nhất 2 vòng. Nếu đang vặn mà thấybị kẹt cứng thì phải dừng ngay và quay ngược về chiều kia. Tuyệt đối không được dùng sứcmạnh để vặn tiếp, vì sẽ làm hỏng bộ phận này. Trong trường hợp đó, phải dùng ốc đại cấp đểnâng hay hạ mâm kính cho phù hợp rồi mới điều chỉnh ốc vi cấp cho rõ nét.- Ảnh thấy trong kính hiển vi luôn luôn ngược chiều với vật quan sát Vì vậy, để cho hìnhảnh trong kính được thuận chiều, dễ quan sát thì khi dặt tiêu bản lên mâm kính phải quayngược lại với chiều muốn có, khi di chuyển tiêu bản trên mâm kính cũng phải di chuyểnngược chiều với chiều mình muốn.- Nên mở cả hai mắt khi quan sát (kể cả dùng kính một mắt) Mắt trái nhìn vào kính, mắtphải nhìn vào giấy vẽ đặt bên phải kính (ngược lại nếu thuận tay trái) Như thế ta có thể vừaquan sát vừa vẽ mà không cần di chuyển thân mình Không nên nhắm một mắt vì nhìn lâu sẽmỏi.- Người ta quy ước chia vị trí trên kính trường như trên mặt đồng hồ (cũng từ 1 đến 12 giờ)để dễ dàng trao đổi ý kiến với nhau.- Khi sử dụng vật kính 40x trở lên tuyệt đối không được dùng ốc đại cấp.- Ở độ phóng đại càng lớn thì cần ánh sáng càng nhiều.1.3.2. Bảo quản.- Sau khi sử dụng xong, xoay tất cả các vật kính ra trước, mở kẹp tiêu bản, lấy tiêu bản ra8trả về chỗ cũ, hạ mâm kính, hạ hộp tụ quang, dùng khăn mềm khô lau lại kính. Dùng hai taybê kính cất vào tủ chống ẩm.- Phải giữ gìn kính luôn luôn sạch sẽ, không để bụi bẩn và hóa chất dính vào. Luôn luôngiữ kính ở nơi khô ráo, mát mẻ để các bộ phận quang học không bị mốc.- Khi lau kính, khi sử dụng kính, không được tháo rời các bộ phận của kính. Không đượcdùng tay xoa trên mặt các thấu kính, mà nên dùng một bút lông nhỏ sạch để chải bụi ở cácmặt kính hoặc dùng bông mềm, sạch để lau.- Nếu sử dụng vật kính 100x thì phải dùng xylen hoặc toluen hoắc Alcol Ethylic (tuỳ theoloại vật kính mà sử dụng dung môi cho phù hợp) thấm vào khăn bông mềm hoặc giấy thấm đểlau sạch dầu cede đầu vật kính 100x. Một số loại vật kính khi dùng Alcol Ethylic để lau thì sẽlàm tan chất gắn các thấu kính của vật kính. Nhưng ngược lại, một số loại vật kính thì xylenvà toluen lại làm tan chất gắn các thấu kính của vật kính.- Tránh mọi sự va chạm mạnh vào kính, không đánh đổ, đánh rơi kính. Nếu di chuyển kínhra khỏi phòng thí nghiệm, nhất thiết phải đưa kính vào hộp của nó có chèn lót cẩn thận.- Nếu phát hiện có 1 hư hỏng nào đó, nhất thiết không được tự ý tháo ra sửa chữa mà phảibáo với cán bộ hướng dẫn biết để xử lý.2. Tiêu bản hiển vi.2.1. Thành phần.- Lam kính (phiến kính): hình chữ nhật, kích thước 20 x 76 mm, dày khoảng 1mm, dùng đểmang mẫu vật soi ở kính hiển vi.- Mẫu vật: được dàn đều và mỏng lên lam kính.- Lamen (lá kính): có nhiều hình dạng và kích thước khác nhau. Thường có hình vuông vớikích thước 10 x 10mm, 22 x 22mm hoặc hình chữ nhật kích thước 22 x 32mm, 25 x 50mm,dày 0,12 – 0,14mm. Lamen dùng để đậy mẫu vật trên lam kính.Hình 3. Tiêu bản hiển vi.2.2. Các loại tiêu bản hiển vi.2.2.1. Tiêu bản soi tươi.Để nghiên cứu những mẫu vật đang còn sống (Tế bào sống hoặc các vi sinh vật đangsống), là một trong những phương pháp cơ bản của kỹ thuật hiển vi. Qua đó, người ta biếtđược thêm các đặc điểm sinh trưởng và phát triển của chúng.Cách làm: Đối với những mẫu nghiệm là chất lỏng mà có đậm độ tế bào thấp , người ta lấymẫu nghiệm đem ly tâm rồi lấy cặn ly tâm để dàn lên lam kính rồi đậy lamen và quan sát soitươi. Đối với những mẫu nghiệm là chất lỏng có đậm độ tế bào lớn thì người ta lấy nhỏ mộtgiọt nước muối sinh lý nhỏ lên phiến kính sạch, dàn đều, mỏng mẫu vật lên giọt nước muốisinh lý đó. Đậy lamen, quan sát ở vật kính 10x và 40x.Những mẫu nghiệm đặc và chất rắn đều phải được cắt mỏng thành lát mỏng, đặt các látmỏng lên lam kính trong dung dịch sinh lý để quan sát soi tươi.Chú ý:- Phải làm sạch, khô lam kính và lamen.- Mẫu vật dàn vào giọt nước muối sinh lý phải vừa đủ, không nhiều quá, dày quá mà chồngchất lên nhau khi quan sát không thấy rõ được, nhưng cũng không quá ít thì khó tìm thấy.9- Đậy lamen không để tạo thành các bọt không khí dưới lamen bằng cách để 1 cạnh lamenchấm vào giọt mẫu vật, để nghiêng lamen rồi từ từ hạ xuống.Ngoài phương pháp làm tiêu bản soi tươi không nhuộm màu, người ta còn dùng phươngpháp soi tươi có nhuộm màu đối với các mẫu vật đang sống. Mục đích của phương pháp nàylà nhuộm một vài thành phần của tế bào khi mẫu vật đang sống. Nó đóng vai trò quan trọngtrong việc nghiên cứu sinh lý của đối tượng quan sát. Nguyên tắc của phương pháp này là:Một vài bộ phận của cơ thể sống có một số khả năng tích lũy một số chất màu nhất định. Quađó sẽ xuất hiện sự tương phản về màu sắc làm cho người ta dễ phân biệt với các bộ phận kháckhông bắt màu. Chất màu được dùng phải ở nồng độ rất loãng để giảm mức thấp nhất sự táchại của thuốc nhuộm màu với mẫu vật.Người ta thường dùng 2 loại chất màu.+ Chất màu diacrom dùng cho tiêu bản quan sát ở kính hiển vi thông thường.+ Chất màu loại fluorocrom dùng cho tiêu bản quan sát ở kính hiển vi huỳnh quang.+ Chất màu loại Diacrom thường dùng để nhuộm không bào, màng tế bào, thể hạt sợi(chondriosome) và một phần các lạp thể (Plastid). Không dùng để nhuộm nhân tế bào.Thuốc màu Fluorocrom có ưu điểm là được dùng ở nồng độ rất thấp, mà kết quả lại chohình ảnh tương phản rõ hơn thuốc màu diacrom , vì vậy mà ít độc cho vật sống đang quan sát.Nhưng thuốc màu Fluorocrom lại có nhược điểm là khi quan sát phải dùng nguồn sáng xanhhay cực tím, mà loại ánh sáng này lại rất có hại cho cơ thể sống và dần dần làm nhạt màu củathuốc nhuộm2.2.2. Tiêu bản cố định.Thông thường khi làm tiêu bản cố định, người ta cần nhuộm màu và tiến hành nhiều bước.- Đối với mẫu vật là chất lỏng (như các chất dịch, máu, mủ, đàm …) người ta phết đều vàmỏng mẫu vật lên lam kính, để khô, cố định rồi nhuộm màu (nếu mẫu vật là chất lỏng có đậmđộ tế bào thấp thì phải ly tâm, lấy cặn ly tâm để làm tiêu bản).- Đối với mẫu vật đặc (như mô cơ, mô xương …) người ta chọn mẫu vật thích hợp, cố địnhmẫu vật khi còn tươi để giết chết mẫu vật tức khắc, ngăn chặn quá trình tự phá hủy do menhay thối rữa trong các mô; đồng thời làm cho các mô cứng hơn để dễ cắt, dễ nhuộm màu hơn,các dung dịch được dùng để làm chất cố định thường là acide cromic, ethanol, formol…+ Khử nước: Sau khi lấy mẫu vật ra khỏi dung dịch cố định, cần rữa sạch bằng nước rồingâm vào các lọ cồn với nồng độ cao dần để loại nước và làm cho mẫu vật khỏi bị co rúm+ Chuyển mẫu vật vào môi trường trung gian: Chất trung gian này vừa phải hòa tan trongcồn, vừa hòa tan được parafin. Thường dùng là benzen.Chuyển mẫu vật vào parafin để cho parafin ngấm hoàn toàn vào mẫu vật.+ Đúc khối parafin: Khi parafin đã ngấm hoàn toàn vào mẫu vật, đem đúc thành khối trongnhững khuôn giấy nhỏ hoặc chén nhỏ bằng thiếc, sứ … được tráng mỏng 1 lớp glycerin vàsau đó làm nguội nhanh thỏi parafin.+ Chuẩn bị phiến kính sạch, bôi lên phiến kính chỗ sau này sẽ đặt lát cắt một lớp mỏngchất dính glycerin – lòng trắng trứng để khi đặt các lát cắt vào, nó được dính chặt vào phiếnkính, khỏi bị bong ra khi loại parafin và khi nhuộm màu. Để phiến kính khô mới đem dùng.Lưu ý: Chất dính này có khả năng phát huỳnh quang riêng nên khi soi bằng kính hiển vihuỳnh quang thì cần phải dùng chất dính khác.+ Cắt mẩu vật qua khối parafin bằng máy cắt và đưa các lát cắt lên phiến kính.+ Loại parafin ở lát cắt và nhuộm màu.+ Gắn Lamen lên mẩu vật bằng bome canada.* Phương pháp nhuộm màu.Tùy theo từng loại mẫu vật và mục đích nghiên cứu mà người ta dùng các chất màu vàphương pháp nhuộm khác nhau nhằm làm nổi rõ một số thành phần cấu tạo của từng tế bàohoặc của từng mô trong cơ thể sinh vật. Ở đây đề cập đến phương pháp thông thường nhất.Trong nghiên cứu về tế bào và giải phẩu học, người ta thường áp dụng cách nhuộm sau.10- Nhuộm đơn: chỉ dùng một loại chất màu. Ví dụ nhuộm thể nhiễm sắc ở thực vật bằngdung dịch carmin – acetic; nhuộm tế bào máu bằng giemsa.- Nhuộm phối hợp: Dùng từ 2 chất màu trở lên.Ví dụ:+ Nhuộm 2 màu bằng phương pháp nhuộm kết hợp giữa carmin – phèn chua – xanhmethylen để nghiên cứu cấu tạo giải phẩu thực vật.+ Nhuộm Gram, nhuộm Ziehl – Neelsen để nghiên cứu các loại vi khuẩn, nhuộmPapanicolaous để nghiên cứu tế bào và tổ chức mô…+ Nhuộm tăng dần: Vật nhuộm đặt vào dung dịch màu cho đến khi màu sắc đạt yêu cầu thìdừng lại, sau đó rửa sạch chất màu dính ngoài rồi quan sát.+ Nhuộm giảm dần: Vi phẩu được nhuộm màu quá đậm, sau đó dùng chất lỏng thích hợpđể tẩy bớt màu thừa cho đến khi màu sắc vừa đúng thì dừng lại.Đối tượng cần nhuộm cũng có các loại sau:+ Vật nhuộm đang sống phải chọn chất màu thích hợp để giữ cho nó tiếp tục sống bìnhthường khi quan sát.+ Vật nhuộm đã cố định và đã cắt: Áp dụng trong đa số trường hợp nghiên cứu cấu tạo giảiphẩu.+ Vật nhuộm đã cố định, rửa sạch rồi nhuộm mà không cắt: Áp dụng đối với các mẩu vậtbé mảnh dẻ, hoặc làm các tiêu bản thực vật ép bẹp trên phiến kính.Kết quả nhuộm màu phụ thuộc vào nhiều yếu tố, tính chất lý hoá của vật nhuộm, chấtlượng của thuốc nhuộm, nồng độ pH của dung dịch nhuộm, nhiệt độ và thời gian nhuộm,phương pháp tẩy và rửa sau khi nhuộm, v.v… Thực ra các yếu tố này khó kiểm tra chặt chẽ,cũng có khi không cần thiết, nên phần nhiều vẫn dựa theo kinh nghiệm.Đối với loại tiêu bản cố định có nhuộm màu, thường người ta gắn lamen đậy lên mẫu vậtđể bảo quản tiêu bản được lâu dài. Nhỏ lên phiến kính chỗ có mẫu vật thích hợp một giọtbome canada pha loãng bằng xylen, đặt lamen nghiêng chấm một cạnh lên giọt bome, để hạcạnh đối diện xuống từ từ, bome tự dàn đều dưới lamen. Để tiêu bản nằm ngang chỗ thoángmát khoảng 1 tuần cho bome khô cứng là đem dùng được.V. CÂU HỎI ĐỂ ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ.1. Trình bày cấu tạo và chức năng của các bộ phận trong kính hiển vi quang học. Vẽ và chúthích.2. Thực hành sử dụng thành thạo kính hiển vi.3. Thực hành bảo quản, lau chùi và di chuyển kính hiển vi.4. Tiêu bản hiển vi là gì? Thành phần của tiêu bản hiển vi. Phân loại sơ bộ các loại tiêu bảnhiển vi ?5. Trình bày các bước tiến hành làm tiêu bản soi tươi và mục đích của phương pháp này ?6. Trình bày tổng quát các bước làm tiêu bản nhuộm màu, ý nghĩa mục đích của phươngpháp này ?7. Thực hành làm các loại tiêu bản. Tiêu bản soi tươi, tiêu bản niêm mạc miệng, tiêu bảnmáu người, tiêu bản máu gà, tiêu bản tinh trùng người.8. Kiến tập làm tiêu bản thần kinh tủy sống Thỏ.11Bài 2: HÌNH THỂ VÀ CẤU TRÚC TẾ BÀOI. YÊU CẦU.- Nắm được các phương pháp cơ bản nghiên cứu tế bào.- Quan sát và nhận diện được hình dạng và cấu trúc tế bào, nhân tế bào ở một số tế bào củangười, động vật, thực vật.- Tự làm một số tiêu bản đơn giản để quan sát hình dạng tế bào và nhân tế bào.II. DỤNG CỤ, HÓA CHẤT, MẪU VẬT.- Kính hiển vi. mỗi sinh viên một cái.- Phiến kính sạch, lamen .- Lọ đựng tảo rung.- Tranh vẽ các loại cấu trúc tế bào và nhân tế bào.- Tiêu bản các loại.- Cồn 960, cồn tuyệt đối.- Giấy thấm, kim chích đầu ngón tay để lấy giọt máu.- Giemsa, xanh methylen, dầu cede, hematoxylin, eosine, acide acetic, ether.III. TÓM TẮT NỘI DUNG.1. Các phương pháp nghiên cứu tế bào.1.1. Phương pháp hiển vi quang học.Với kính hiển vi quang học ta có thể quan sát được tế bào sống và tế bào đã định hình.Muốn xem tế bào sống phải đặt mẫu vật vào môi trường giống hay gần giống với môitrường sống tự nhiên của nó. Một số bộ phận của tế bào sống có chỉ số chiết quang bằng nhaunên quan sát theo phương pháp bình thường không thể thấy được nhưng khi cải biến chút ítbằng các phụ kiện thành kính hiển vi nền đen hay kính hiển vi đối pha thì có thể thấy rõ rànghơn. Để quan sát những bào quan và những vật thể trong tế bào có cấu trúc tương tự cấu trúccủa tinh thể, người ta dùng kính hiển vi phân cực. Để quan sát hình thể không gian ba chiềucủa tế bào, người ta dùng kính hiển vi soi nổi hoặc kính hiển vi đảo ngược . Tế bào sống cũngcó thể nhuộm sống để tăng độ chiết quang của các phần khác nhau. Chất màu nhuộm phảiloãng, không độc hoặc rất ít độc đối với tế bào. Các phẩm nhuộm thường dùng là đỏ trungtính, xanh Janus, lục Trypan, lục Methyl, đỏ Trypan.Phương pháp hay dùng hơn là xem tế bào đã định hình và nhuộm, định hình nhằm làm chotế bào chết một cách đột ngột để cho hình dạng tế bào ít thay đổi nhất. Sau định hình, một sốbộ phận trong tế bào thường bị co lại, phồng lên hoặc bị đông lại.Để định hình người ta sốc nóng hay đông lạnh hay dùng các hoá chất như alcol, các muốikim loại nặng như Platin clorua, thuỷ ngân biclorua, Uran nitrat, các axit như axit acetic, axitpicric, axit cromic, axit focmic. Mẫu vật sau khi định hình nếu dày quá thì phải cắt thành từnglát cắt mỏng khoảng vài Micromet. Sau đó nhuộm bằng các chất màu thích hợp.Với kính hiển vi giao thoa và các phương pháp giao thoa cũng có thể phần nào xác địnhđược sự tập trung của các chất rắn có trong nhân, hạch nhân và bào tương của các tế bào đangphát triển.Dưới kính hiển vi mà đặc biệt là dưới kính hiển vi đảo ngược và hệ thống vi thao tác,người ta có thể tiến hành phẫu tích gọi là vi phẫu tích với những dụng cụ rất nhỏ, tách đượcnhân ra khỏi tế bào hoặc cắt tế bào ra thành những mảnh nhỏ, hoặc tiến hành những kỹ thuậtkhác để nghiên cứu tế bào.1.2. Phương pháp hiển vi điện tử.Phương pháp này thực chất là chùm điện tử được dùng để quan sát tế bào qua các bộ máyphức tạp. Nhờ bước sóng ngắn mà kính hiển vi điện tử có độ phóng đại lên hàng chục vạn lần,có thể phân biệt đến A: Loại kính hiển vi có chùm tia xuyên qua mẩu vật được gọi là xuyênqua (Transmission electron microscope). Kính hiển vi điện tử mà chùm tia không xuyên qua12mẫu vật (đã được bao một màng mỏng bằng vàng), nó ghi nhận các điện tử thứ cấp bắn ra từbề mặt của mẫu vật phản ánh cấu trúc không gian ba chiều của mẫu vật.1.3. Phương pháp hoá học tế bào.Phương pháp hoá học tế bào giúp ta xác định được vị trí tập trung của các chất khác nhautrong tế bào và trong nhiều trường hợp có thể định lượng được chúng nhờ những máy quangphổ. Nhờ các phương pháp hoá học tế bào mà ta có thể xác định được protide, acide nucleide,lipide, các chất lipoide, hormon, vitamin, các kim loại và các enzyme. Người ta có thể dựatrên các phản ứng định tính hoá học, đối với từng loại chất, bằng cách dùng thuốc thử khácnhau, có thể thấy được màu sắc đặc trưng và vị trí của chất được phát hiện. Người ta cũng cóthể định lượng các chất có trong tế bào bằng phương pháp quang kế tế bào.Các phương pháp sắc kí và điện di ngày nay được áp dụng rộng rãi để phân tích định tínhvà định lượng tới acide amin và các thành phần trong dịch tế bào.Trong số các phương pháp hoá học tế bào thì phương pháp hiển vi huỳnh quang có vị trínổi bật hơn cả. Phương pháp này giúp ta nhìn thấy một số chất hoá học trong tế bào chưa bịtổn thương. Nguồn sáng của kính hiển vi huỳnh quang là đèn thuỷ ngân tạo ra một chùmnhiễu tia xanh và tia cực tím, các gương lọc ánh sáng và gương tán sắc đặc biệt sẽ phản chiếulên bản quan sát những tia bước sóng ngắn, các tia UV đó tác động gây ra hiện tượng huỳnhquang và làm cho bản quan sát phát ra những tia sáng huỳnh quang có bước sóng dài hơn; độdài bước sóng bức xạ huỳnh quang luôn luôn dài hơn độ dài bước sóng bức xạ gây ra nó.Các vật thể có khả năng huỳnh quang bắt đầu phát sáng một cách rõ ràng và mỗi chất cómột bức xạ huỳnh quang đặc trưng. Chẳng hạn chất diệp lục có bức xạ huỳnh quang màu đỏtươi.Phương pháp hiển vi huỳnh quang được áp dụng rộng rãi trong vi sinh vật học, miễn dịchhọc, phương pháp kháng thể huỳnh quang. Người ta sử dụng Quinacin và một số dẫn chất đểphát hiện các băng huỳnh quang trên nhiễm sắc thể và vật thể giới tính Y ở tế bào lúc gian kỳ.1.4. Phương pháp nuôi cấy tế bào.Trong nhiều trường hợp việc nghiên cứu từng loại tế bào là cần thiết, nhiều trường hợp cầnsố lượng lớn tế bào một loại nào đó. Các phương pháp tách và nuôi cấy tế bào được cải tiếnvà hoàn thiện dần.Các tế bào tách riêng được nuôi cấy trong các bình nuôi cấy chứa môi trường dinh dưỡngthích hợp. Những tế bào như bạch cầu Lympho máu ngoại vi, các tế bào từ bào thai bong ratrong dịch ối, các mô tách ra từ cơ thể như mô lấy từ bào thai, mô lấy từ da… Các tế bào nuôicấy sau khi rời khỏi cơ thể vẫn sống và sinh sản và về cơ bản vẫn giữ được bản chất sinh họccủa cá thể nguồn gốc mà chúng được tách ra.Các tế bào nuôi cấy được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như:- Chẩn đoán trước sinh bằng cách nuôi cấy tế bào nước ối.- Sử dụng tế bào nuôi cấy để làm mô hình thực nghiệm.- Sản xuất các chế phẩm sinh học: sản xuất vaccin virus, sản xuất các hoạt chất sinh học,sản xuất Interferon trong điều trị viêm gan B,C và một số bệnh ung thư, sản xuất kháng thểđơn dòng.- Tế bào động vật sử dụng trong cấy ghép để khắc phục các sai hỏng của cơ thể: cấy ghépcác tế bào tụy tạng sản xuất insulin, cấy ghép các tế bào thần kinh để phục hồi chức năng củanão, cấy ghép các tế bào nguồn tạo máu để khắc phục tình trạng không hoạt động của tủyxương, cấy ghép các tế bào sụn lành để khắc phục các tổn thương của sụn ở các khớp.- Tạo cơ quan từ tế bào động vật nuôi cấy: Sản xuất mạch máu tự nhiên bằng nuôi cấy tếbào động mạch chủ của bò. Tạo dòng trị liệu để có những mô, những cơ quan mới thay thếcho mô, cơ quan bị hư hỏng.Đặc biệt ứng dụng của lĩnh vực này và có triển vọng lớn đó chính là tế bào phôi thai người.Sản xuất các hợp chất tự nhiên hay nhân tạo từ tế bào thực vật nuôi cấy.- Tái sinh cây có đặc tính sinh học mong muốn.13- Tạo sinh khối từ tế bào vi sinh vật nuôi cấy.- Sản xuất các hợp chất phân tử lượng thấp và cao phân tử từ tế bào vi sinh vật nuôi cấy.- Sử dụng tế bào vi sinh vật nuôi cấy trong một số quá trình công nghệ.1.5. Phương pháp tự chụp hình phóng xạ.Phương pháp này dựa vào khả năng phát hiện nhờ phim ảnh, các chất phóng xạ được đưavào các hợp chất thích hợp rồi đưa các hợp chất đó vào tế bào. Chất phóng xạ khi xâm nhậpvào tế bào và nằm ở vị trí theo sự chuyển hoá của nó. Sau đó lấy mô hoặc tế bào ra định hình,cắt mỏng đặt lên phiến kính và có thể nhuộm. Bọc phiến kính bằng nhủ tương ảnh trong tối vàgiữ trong tối như phim ảnh. Sau một thời gian chất phóng xạ nằm trong tế bào sẽ phát ra cácđiẹn tử, các điện tử này sẽ tác động lên Bromua bạc của nhủ tương ảnh. Đem rửa phiến kínhnhư rửa phim ảnh thường, khi soi dưới kính hiển vi sẽ nhìn thấy cả hình tiêu bản bình thườngvà ảnh của bộ phận tế bào có chất phóng xạ, chỗ những vệt đen tập trung trên nhủ tương ảnh.Các chất đồng vị phóng xạ thường dùng là 14C, 35S, 3H, 32P, 14C, 35S đưa vào các axit aminđể theo dõi sự tổng hợp protein, 3H được đưa vào timin hoặc uraxin để theo dõi sự tổng hợpAND, ARN.1.6. Phương pháp ly tâm phân tách.Ly tâm phân tách là phương pháp cho phép tách rời các bào quan thành từng loại thuầnkhiết để nghiên cứu. Phương pháp này gồm có hai bước:- Nghiền tế bào để phá vỡ tế bào sao cho chỉ làm vỡ màng mà không hại tới các bào quanvà các thành phần khác của bào tương. Nghiền và để lắng ở nhiệt độ thấp trong môi trườngđặc trưng chứa dung dịch đệm để duy trì độ pH ổn định.- Làm lắng bằng máy li tâm. Trong máy li tâm, các thành phần khác nhau sẽ bị kéo bởi mộtlực li tâm khác nhau.1.7. Phương pháp nhiễu xạ tia X.Tia X cũng như ánh sáng đều bị nhiễu xạ khi va chạm vào vật chất. Đối với tia X, nhữngtâm gây nhiễu xạ là những nguyên tử cấu tạo nên các phân tử.Khi những tâm gây nhiễu xạ cách đều nhau, những tia X bị nhiễu xạ cùng tia tới làm thànhmột góc xác định có trị số tỉ lệ nghịch với khoảng cách các tâm gây nhiễu xạ. Khoảng cách đógọi là chu kỳ và những cấu trúc gồm các tâm gây nhiễu xạ được gọi là cấu trúc có chu kỳ. Khichu kỳ có cấu trúc nhỏ hơn vài chục Ăngstron, những góc làm bởi những tia nhiễu xạ và tiatới sẽ lớn hơn 50 trường hợp này gọi là nhiễu xạ với góc lớn. Chu kỳ ở vào khoảng từ 40-1000Angstron, góc đó sẽ nhỏ hơn 50 và gọi là nhiễu xạ góc nhỏ.Sự nhiễu xạ với góc lớn cho phép đo những khoảng cách giữa những nguyên tử cùng phântử và xây dựng lại cấu trúc ba chiều của phân tử. Nhờ phương pháp này, người ta xây dựngđược mô hình không gian của các phân tử axit nucleic, polysaccarit và một số protein.Sự nhiễu xạ với góc nhỏ cho phép đo khoảng cách giữa các phân tử giống nhau sắp xếpthành cấu trúc chu kỳ như sự sắp xếp của những phân tử Photpholipide trong Myelin hoặc sựsắp xếp của các đại phân tử hình sợi trong tế bào cơ.Về thực hành, người ta chiếu một chùm nhỏ tia X trên một mẫu vật, những tia bị nhiễu xạchiếu hình lên một tấm kính ảnh đặt ở sau nó.Biết khoảng cách giữa mẫu vật và tấm ảnh và hướng của tia tới có thể tính các góc của cáctia bị nhiễu xạ so với tia tới. Từ những số liệu đó người ta tính ra chu kỳ của những tâm gâynhiễu xạ.Nhờ sức đâm xuyên lớn của tia X, người ta có thể nghiên cứu những mẫu vật tương đốidày và những nhóm tế bào. Ví dụ đo khoảng cách của những đại phân tử hình sợi ở trong bàotương của tế bào cơ có thể thực hiện trên một bắp thịt nguyên vẹn kích thước nhỏ như bắp thịtbàn chân ếch, bắp thịt cánh ruồi. Phương pháp này còn có thể thực hiện được trên mẫu vậtđang sống, cho phép so sánh những cấu trúc siêu vi thể ở trạng thái sống và sau khi định hình.Phương pháp nhiễu xạ tia X còn có khả năng theo được dõi sự vận động bên trong phân tửnhờ các kết quả nối tiếp nhau kiểu quay phim.14Ngoài phương pháp trên một phương pháp lý sinh khác gọi là nhiễu xạ nơtron đã được sửdụng thành công trong nghiên cứu phức hợp các phân tử khác nhau. Kỹ thuật nhằm cho mộtchùm tia nơtron đi qua một tinh thể. Phổ thu được cho phép thấy vị trí các nguyên tử tronglưới tinh thể. Khi notron nhiễu xạ, độ khuyếch đại của nhiễu xạ sẽ là âm đối với các nguyêntử Hydro, còn có các yếu tố khác có trong mô sinh vật thì có độ khuyếch đại ấy là dương.Prôtein chứa một tỉ lệ Hyđrô cao hơn tỉ lệ ấy ở AND. Lợi dụng tính chất này, người ta khámphá ra mô hình liên kết của Prôtein histon với AND tức là cấu trúc của sợi Cromatin, thànhphần chính của nhiễm sắc thể của sinh vật bậc cao.2. Phân loại tế bào.Tế bào là hệ thống sống cơ bản, là cơ sở vật chất của cấu tạo, phát triển và hoạt động củamọi cơ thể động vật và thực vật. Người ta chia tế bào các loài sinh vật thành hai kiểu chính.2.1. Tế bào có nhân không điển hình (tế bào Prokaryota hay Prokaryotie cell): virus, vi khuẩn,tảo lam. Vùng nhân không có màng bao bọc.2.2. Tế bào có nhân điển hình (tế bào Eukaryota hay Eukaryotie cell). Nhân có màng nhântách biệt nhân với bào tương.Tùy thuộc vào chức năng sinh lý của tế bào và sự tác động cơ học của các yếu tố tế bào vàmô bao quanh chúng mà tế bào, nhân tế bào có hình dạng, kích thước và sự bắt màu khácnhau.Kích thước, hình dạng, màu sắc tế bào không phụ thuộc vào kích thước cơ thể sinh vật.IV. NỘI DUNG.1. Tế bào sợi nuôi cấy.1.1. Cách làm tiêu bản.Lấy tế bào phôi thai người trong điều kiện vô trùng và đem nuôi cấy ngay trong môitrường, nhiệt độ, độ pH thích hợp đã có đặt sẵn các tấm lamen vô trùng. Sau 72 giờ các tế bàomọc đều trên lamen, lấy ra định hình (cố định), để khô, nhuộm màu bằng Hematoxyline.1.2. Quan sát.Quan sát ở vật kính 10x và vật kính 40x:Các tế bào sợi có dạng hình thoi, hình tam giác kéo dài nối tiếp nhau; nhân có nhiều chấmhạt nhiễm sắc bắt màu hồng đậm; bào tương bắt màu hồng nhạt hơn. Bên cạnh các tế bào ởgian kỳ, các tế bào đang phân chia chuyên nhiễm, có một số ít các tế bào đang phân chia vônhiễm và ta thường bắt gặp một số dạng: tế bào có nhân thắt lại để chuẩn bị chia đôi, hoặcnhân và bào tương thắt lại nhưng chưa phân chia thành hai, hoặc tế bào có nhân đã phân đôihoàn toàn và bào tương thắt lại chuẩn bị trở thành hai tế bào.12Hình 4. Tế bào sợi nuôi cấy.1. Thân; 2. Nhân.

Xem Thêm