Insulin - SlideShare

More Related Content

Insulin

• 1. TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG Sản xuất protein tái tổ hợp trên E.coli INSULIN
• 2. Nhóm: 1. Trần Thị Huyền Trân 61003158 2. Huỳnh Thị Trúc 61003267 3. Lê Thị Thúy Quyên 61003118 4. Nguyễn Thị Kim Thao 61003132 5.Huỳnh Thị Thanh Trúc 61003268 6.Phan Mỹ Hoàng Mai 61003080 7.Trần Nguyễn Hương Trang 61003262
• 3. I/ Bệnh tiểu đường:
• 4. II/ Một số loại insulin trên thị trường:
• 5. Thời gian bắt Loại insulin Màu sắc Nguồn gốc Thời gian hết tác đầu tác dụng dụng Tác dụng nhanh - Insulin Trong Người 30 phút (tiêm dưới 8h Actrapid HM Lợn da) - Insulinum maxirapid Tác dụng bán chậm Đục Người 1h 20h - Insulatard HM Lợn 18h - Insulin Lente Loại pha trộn -Mixtar HM Đục Người 30 phút 20h 30/70 Tác dụng rất chậm Đục Bò 4h 30h -Utra – Lente
• 6. III/ Cơ sở khoa học của công nghệ sản xuất insulin 1. Cấu trúc phân tử insulin: Insulin người là 1 polipeptide Bao gồm: - Chuỗi A 21 aa - Chuỗi B 30aa. Có 1 cầu nối disulfur giữa 2 chuỗi A và 2 cầu nối giữa 2 chuỗi A và B. CTHH: C257H383N65O77S6. Trọng lượng phân tử: 5808
• 7. 2. Vai trò của insulin:
• 8. 2. Vai trò của insulin:  Insulin làm tăng tính hấp thụ của các acid amin.  Thúc đẩy sự sinh tổng hợp các acid béo trong gan
• 9.  Insulin làm tăng tính thấm của các ion kali, magie và phosphate vô cơ tạo điều kiện cho quá trình phosphoryl hóa và sử dụng glucose.
• 10. IV/ Công nghệ sản xuất insulin: Năm 1922, Fred Banting và Charles Best thuộc Đại học tổng hợp Toronto (Canada) thông báo họ đã tìm ra insulin và ứng dụng chất này trong điều trị bệnh tiểu đường ở người.
• 11. Nhược điểm: +Insulin từ động vật có cấu trúc không hoàn toàn giống insulin người. + Hoạt động chức năng trong cơ thể kém hơn insulin người. + Khả năng hấp thụ kém. + Có thể gây ra các phản ứng miễn dịch trong cơ thể. + Trong quá trinh tách chiết không thể loại bỏ hết các tác nhân gây bệnh ở động vật. + Qui trình tách chiết đòi hỏi kỹ thuật cao. + Chi phí đắt (cần lượng lớn tụy để sản xuất) => giá thành cao. + Khó sản xuất lượng lớn với qui mô công nghiệp.
• 12. V/ Công nghệ sản xuất insulin tái tổ hợp trên E.coli: 1. Sinh tổng hợp insulin tái tổ hợp theo phương pháp mini proinsulin (MPI):
• 13. Bước 1: bằng kỹ thuật tách gen sử dụng trong sinh học phân tử tách được gen mã hóa proinsulin người trên NST số 11
• 14. Bước 2: Tách và thiết kế plasmid tái tổ hợp - Cắt gen mã hóa proinsulin và plasmid bằng một loại giới hạn. Nối bằng ADN ligase của phageT4. - Thiết kế các trình tự mã hóa cho các protein tín hiệu giúp vận chuyển insulin ra ngoài tế bào chất. - Nếu sử dụng mRNA tách được từ trên tiến hành như sau: + Sao mRNA tinh khiết thành cDNA nhờ enzyme phiên mã ngược và nhờ các dNTP (trong phản ứng RT – PCR). + Cài đoạn cDNA mã hóa insulin hoàn chỉnh vào plasmid đứng sau một promoter mạnh. Biến nạp vector tái tổ hợp vào E.coli.
• 15. Chủng E.coli: BL21 DNA mã hóa 8 – 12 aa TNF-α và His10 được (DE3) tổng hợp hóa học. Gen: T7 RNAP Promoter lacUV5 Cắt bằng NdeI và BamHI Plasmid T2 Chèn vào downstream T7 promoter Biểu hiện trong pET-3a Cắt bởi endonuclease Thu pT2
• 16. Gen mã hóa cho proinsulin người Plasmid PCR pT2-hPI (5 DNA overlapping, mỗi đoạn 65 – 68 base như mẫu) Cắt bằng BamHI và HindIII Chèn vào pT2 pT2-hPI
• 17. Plasmid pT2M2PI: Plasmid Gen mã hóa M2PI đem PCR pT2M2PI: (gen proinsulin người làm mẫu DNA) Cắt bằng BamHI và HindIII Chèn vào pT2 pT2M2PI
• 19. Bước 3: Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào E.coli nhờ phương pháp trộn với dung dịch ion Ca hoặc tạo lỗ xung điện. Sau quá trình biến nạp cần chọn lọc những dòng vi khuẩn mang gen mong muốn. Bước 4: Các vi khuẩn chuyển gen sau đó được đưa vào lên men. Nuôi chúng trong nồi lên men sử dụng phương pháp nuôi cấy liên tục, các chất dinh dưỡng được bổ sung thường xuyên để đảm bảo sự tăng trưởng của vi khuẩn theo hàm số mũ. Sau 20 phút có hàng triệu vi khuẩn được nhân lên qua nguyên phân. Chỉ sau 1 thời gian ngắn, sinh khối tăng lên rất nhanh và gen insulin được tổng hợp
• 20. Môi trường: Luria – Bertani - 1% (w/v) peptone - 0,5% (w/v) cao nấm men - 1% (w/v) NaCl - 0,1% (w/v) NaOH (v/v) - duy trì 200 mg/l ampicilline
• 21. Sơ đồ biểu hiện mini proinsulin trong plasmid pT2M2PI
• 22. Bước 5: Tiền tinh sạch Sau khi lên men cần tách tế bào và khử trùng nhiệt. + Dùng enzyme lizozyme phá vỡ màng tế bào sau đó dùng hỗn hợp chất tẩy rửa để tách lớp màng lipit + Bằng phương pháp ly tâm lọc và tách được proinsulin.
• 23. Bước 6: Hoạt hóa Hoạt hóa proinsulin vitro (sau tinh sạch ở dạng mạch thẳng) bằng cách xử lý dung dịch đệm, giúp nó đạt cấu trúc bậc 4 (tạo phản ứng xoắn cuộn), sau đó dùng enzyme đặc hiệu trypsin để phân cắt proinsulin. Khi đó sản phẩm thu được mới có hoạt tính cần thiết.
• 25. Phản ứng xoắn cuộn + 50mM glycine buffer  mini proinsulin tinh sạch (50 µM, 0.375 mg/l) + 2-mercaptoethanol  phản ứng cuộn xoắn (bằng 2 lượng mini proinsulin) (18h, 4oC) ↓ + H3PO4 đến pH 2.5  Dừng phản ứng ↓ Tinh sạch (Reverse-phase HPLC) ` ↓ So sánh peak với mini proinsulin xoắn cuộn với insulin
• 26. Bước 7: Hỗn hợp tinh sạch chỉ còn có insulin + Bằng phương pháp sắc ký, tách, và phương pháp miễn dịch gắn enzyme.
• 27. 2. Sinh tổng hợp insulin theo phương pháp 2 chuỗi:
• 28. Nguồn: http://www.bvdkquangnam.vn/tin-tc/thong-tin-thuc/267-insulin-va- cong-ngh-sn-xut-insulin-bng-dna-tai-t-hp-.html http://vi.scribd.com/doc/93630047/G5-miniproinsulin http://thuviensinhhoc.com/chuyen-de-sinh-hoc/cong-nghe-sinh- hoc/5296-san-xuat-thuoc-bang-cong-nghe-dna-tai-to-hop.html