Trich dan Nghiên cứu công nghệ sản xuất insulin tái tổ hợp - pdf 14 Link tải luận án tiến sỹ sinh học cho anh em Trang LỜI CẢM ƠN .............................................................................................. iDANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ..........................................................viDANH MỤC HÌNH.................................................................................. viiiDANH MỤC BẢNG ...................................................................................xiĐẶT VẤN ĐỀ..............................................................................................1CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ...................................................................51.1. Insulin và vai trò đối với cơ thể ............................................................51.2. Bệnh tiểu đường ...................................................................................81.3. Các phương pháp sản xuất insulin ......................................................101.3.1. Sản xuất insulin từ tụy tạng động vật..........................................................101.3.2. Sản xuất insulin người bằng kỹ thuật tái tổ hợp DNA ................................121.4. Sản xuất protein tái tổ hợp trong tế bào E. coli ..................................181.4.1. Đặc điểm của E. coli trong sản xuất protein tái tổ hợp...............................181.4.2. Các chủng E. coli thường dùng trong sản xuất protein tái tổ hợp ...............201.5. Các hệ thống vector biểu hiện trong E. coli .......................................241.5.1. Hệ thống pGEX biểu hiện protein dung hợp với GST ................................241.5.2. Hệ thống pET biểu hiện protein dung hợp với 6xHis ................................251.5.3. Hệ thống biểu hiện dung hợp với MBP - Hệ thống pMAL.........................271.5.4. Hệ thống IMPACT biểu hiện protein dung hợp với CBP ...........................271.6. Phương pháp lên men vi sinh vật ........................................................281.6.1. Các phương pháp lên men sản xuất protein tái tổ hợp................................281.6.2. Đặc điểm lên men mẻ .................................................................................291.6.3. Đặc điểm lên men liên tục ..........................................................................321.6.4. Đặc điểm lên men mẻ-bổ sung ...................................................................321.6.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến lên men mẻ-bổ sung chủng E. coli để sản xuấtprotein tái tổ hợp .........................................................................................341.7. Các bước xử lý sau lên men để thu nhận mini-proinsulin và insulin cóhoạt tính ..............................................................................................391.7.1. Thu nhận và làm tan thể vùi chứa mini-proinsulin .....................................391.7.2. Tái gấp cuộn mini-proinsulin tái tổ hợp......................................................401.7.3. Cắt loại đoạn peptide C để thu nhận insulin có hoạt tính ...........................431.7.4. Các bước xử lý để thu nhận protein mục tiêu từ protein dung hợp.............441.7.5. Các phương pháp tinh chế trung gian và tinh chế hoàn tất trong sản xuấtinsulin từ mini-proinsulin.............................................................................451.8. Qui trình sản xuất insulin tái tổ hợp theo mô hình mini-proinsulin.....47CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP.........................................492.1. công cụ và thiết bị .............................................................................492.1.1. Thiết bị chính dùng trong sinh học phân tử .................................................492.1.2. Thiết bị dùng trong thao tác nuôi cấy vi sinh ..............................................492.1.3. Thiết bị dùng cho tinh chế protein ..............................................................492.1.4. Thiết bị dùng xác định hàm lượng đường huyết..........................................502.2. Hóa chất và môi trường ......................................................................502.2.1. Hóa chất ......................................................................................................502.2.2. Môi trường nuôi cấy vi sinh.........................................................................552.3. Nguyên vật liệu ..................................................................................552.3.1. Chủng vi sinh vật.........................................................................................552.3.2. Plasmid ........................................................................................................562.3.3. Mồi dùng cho tổng hợp gen, tạo dòng và giải trình tự ................................562.3.4. Thang phân tử lượng dùng trong điện di .....................................................572.3.5. Các kháng thể sử dụng cho Western Blot và ELISA..................................572.4. Phương pháp .......................................................................................582.4.1. Thiết kế, tổng hợp gen mpi mã hóa 6xHis-MPI trong E. coli bằng phươngpháp PCR tái tổ hợp ....................................................................................582.4.2. Tạo dòng gen mpi trong plasmid pBlue (pBIns)..........................................612.4.3. Tái tạo dòng gen mpi vào vector biểu hiện pET-43.1a...............................622.4.4. Cảm ứng biểu hiện và xác nhận sự biểu hiện của 6xHis-MPI ...................632.4.5. Hoạt hóa chủng E. coli BL21(DE3)/pET43Ins............................................662.4.6. Khảo sát các điều kiện cảm ứng tối ưu sự biểu hiện 6xHis-MPI của chủngE. coli BL21(DE3)/pET43Ins ......................................................................662.4.7. Khảo sát thay thế trypton bằng pepton trong môi trường LB nuôi cấy E. coliBL21(DE3)/pET43Ins..................................................................................682.4.8. Khảo sát sự biểu hiện 6xHis-MPI của chủng E. coli BL21(DE3)/ pET43Ins được nuôi cấy trong môi trường LBp và LB................................................682.4.9. Khảo sát điều kiện nuôi cấy E. coli BL21(DE3)/ pET43Ins mật độ cao bằngphương pháp mẻ-bổ sung ở qui mô phòng thí nghiệm................................692.4.10. Khảo sát điều kiện lên men E. coli BL21(DE3)/ pET43Ins bằng nuôi cấymẻ-bổ sung ở qui mô pilot 30L ...................................................................702.4.11. Phương pháp thu sinh khối và đồng nhất tế bào.......................................712.4.12. Thu nhận và làm tan thể vùi chứa 6xHis-MPI .........................................722.4.13. Thu nhận và tinh chế sơ bộ 6xHis-MPI bằng sắc ký cột Ni-NTA............722.4.14. Phương pháp cắt loại bỏ 6xHis bằng CNBr để thu nhận MPI ..................722.4.15. Khảo sát các điều kiện ảnh hưởng lên sự tái gấp cuộn của MPI .............732.4.16. Tủa mini-proinsulin và insulin bằng ion kẽm kim loại.............................752.4.17. Phương pháp xử lý MPI bằng trypsin/carboxypeptidase B để thu nhậninsulin có hoạt tính ......................................................................................752.4.18. Kiểm tra cấu hình của MPI và insulin bằng phương pháp ELISA ...........762.4.19. Phân tích MPI và insulin bằng sắc ký RP-HPLC .....................................772.4.20. Giải trình tự amino acid của MPI bằng khối phổ .....................................772.4.21. Phương pháp định lượng protein...............................................................772.4.22. Phương pháp xác định tính hoạt tính của insulin tái tổ hợp......................79CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN................................................803.1. Tạo dòng tế bào E. coli có khả năng biểu hiện mini-proinsulin dunghợp với 6xHis (6xHis-MPI).................................................................803.1.1. Tổng hợp gen mpi mã hóa mini-proinsulin biểu hiện trong E. coli.............803.1.2. Tạo dòng gen mpi vào plasmid pBlue........................................................813.1.3. Tạo dòng tế bào E. coli BL21(DE3)/pET43Ins biểu hiện MPI ở dạng dunghợp 6xHis-MPI ............................................................................................833.1.4. Kiểm tra trình tự amino acid của 6xHis-MPI ..............................................873.2. Lên men E. coli BL21(DE3)/pET43Ins tổng hợp 6xHis-MPI tái tổ hợpở qui mô phòng thí nghiệm và qui mô pilot ........................................893.2.1. Hoạt hóa, nhân giống và kiểm tra khả năng biểu hiện 6xHis-MPI củachủng E. coli BL21(DE3)/pET43Ins............................................................893.2.2. Khảo sát các điều kiện biểu hiện tối ưu 6xHis-MPI của E. coliBL21(DE3)/pET43Ins..................................................................................913.2.3. Xác định điều kiện nuôi cấy mật độ cao chủng E. coli BL21(DE3)/pET43Ins ở qui mô phòng thí nghiệm.........................................................953.2.4. Nuôi cấy E. coli BL21(DE3)/pET43Ins theo cách mẻ- bổ sung ở quimô 30 L để tổng hợp 6xHis-MPI...............................................................1013.3. Thu nhận MPI có cấu hình tự nhiên..................................................1043.3.1. Thu nhận thể vùi chứa 6xHis-MPI ............................................................1043.3.2. Thu nhận 6xHis-MPI từ thể vùi.................................................................1053.3.3. Thu nhận MPI từ 6xHis-MPI .....................................................................1073.4. Thu nhận insulin từ MPI ...................................................................1113.4.1. Tái gấp cuộn MPI ......................................................................................1113.4.2. Cắt loại peptide C bằng trypsin.................................................................1163.5. Kiểm tra hoạt tính của insulin tái tổ hợp trên chuột .........................1183.6. Sơ đồ qui trình công nghệ sản xuất insulin ở qui mô pilot ................119KẾT LUẬN - ĐỀ NGHỊ...........................................................................122-1-Luận án Tiến sĩ Đặt vấn đề ĐẶT VẤN ĐỀ“Thế kỷ 21 là thế kỷ của các bệnh Nội tiết và các Rối loạn chuyển hóamà điển hình là bệnh đái tháo đường (Bệnh tiểu đường)”. Nhận xét này củanhóm chuyên gia về dự báo tình hình bệnh tật của Tổ chức Y tế thế giới đã đangtrở thành hiện thực với những con số cụ thể. Theo Tổ chức Y tế thế giới (WHO,2008) [77], hiện nay trên toàn thế giới có khoảng 180 triệu người mắc bệnh tiểuđường và ước tính con số này sẽ tăng gấp đôi vào năm 2030, chiếm khoảng 5%dân số thế giới. Đáng lo ngại hơn là các biến chứng của bệnh, cứ 10 giây có mộtngười tử vong do nguyên nhân đái tháo đường, cứ 30 giây lại có một người đáitháo đường bị cắt cụt chi và cứ mỗi ngày có 5000 người mất khả năng nhìn dobiến chứng mắt của bệnh. Mỗi năm có hơn 3,2 triệu người chết vì các bệnh liênquan tới đái tháo đường tương đương với số người tử vong vì bệnh HIV/AIDS [1]. Bệnh tiểu đường (BTĐ) đang trở thành gánh nặng cho mỗi nền kinh tế xãhội, mặc dù mỗi năm hàng nghìn tỷ đôla Mỹ được chi phí cho điều trị bệnh,nhưng chưa bao giờ và sẽ không bao giờ những chi phí lớn về kinh tế cóthể lấp đầy được những tổn thất, nhất là những mất mát về tinh thần do bệnh tậtgây ra. Thực tế đáng lo ngại hơn là tình trạng bệnh xuất hiện ngày càng nhiều từlớp trẻ [1].Ở Việt Nam, tỷ lệ người mắc BTĐ ngày càng cao và ở các thành phố lớntỷ lệ này đã tăng gấp đôi từ 2% lên 4% trong 10 năm giai đoạn 1990-2000. Sốngười mắc BTĐ hiện nay khoảng 4,5 triệu người, chiếm 5,7% dân số, trở thànhnước có tốc độ phát triển BTĐ nhanh nhất thế giới [1].Nguyên nhân của BTĐ là do thiếu insulin hay do cơ thể người bệnhkháng insulin. Insulin là một polypeptide hormone được sinh ra nhờ các tế bào βcủa tuyến tụy động vật, có vai trò điều hoà lượng đường trong máu. Phương -2-Luận án Tiến sĩ Đặt vấn đề pháp điều trị BTĐ phổ biến hiện nay là tiêm insulin định kỳ cho người bệnh. Dosố lượng người mắc BTĐ ngày càng cao nên nhu cầu sử dụng insulin càng lớn. Ởchâu Âu, lượng insulin đã tăng lên 3 lần trong vòng 12 năm từ 1995-2007. Theoước tính, nhu cầu insulin trên thế giới tăng từ khoảng 5.000kg trong năm 2007lên khoảng 16.000kg vào năm 2010, với thị trường dự tính khoảng 11,8 tỷ Mỹkim [41]. Năm 1978, lần đầu tiên các nhà khoa học của công ty công nghệ sinh họcGenetech đã dòng hóa thành công gen mã hóa cho insulin người vào vector biểuhiện trong E. coli và đã cho phép công ty Eli Lilly sử dụng kỹ thuật này để sảnxuất insulin người tái tổ hợp với tên thương mại là Humulin. Năm 1982, Humulinđã được FDA (Food & Drug Administration – Cơ quan Quản lý thuốc và thựcphẩm Hoa Kỳ) cho phép lưu hành. Hiện nay có nhiều công ty dược phẩm trênthế giới sản xuất insulin tái tổ hợp như: Eli Lilly, Novo disk, Sanofi Aventis … vớinhiều loại sản phẩm insulin khác nhau. Công nghệ sản xuất insulin hiện naythường được tiếp cận theo hai phương pháp: phương pháp một chuỗi polypeptidevà phương pháp hai chuỗi polypeptide. Công nghệ sản xuất insulin tái tổ hợpbằng phương pháp một chuỗi polypeptide bao gồm ba bước cơ bản. Đầu tiên làbước tạo dòng chủng chủ (thường là E. coli) có khả năng mang gen ngoại tổnghợp các chất tiền thân của insulin (proinsulin). Đây là khâu then chốt quyết địnhsự thành công của công nghệ do cần biến đổi các codon thích hợp để tăngcường hiệu quả biểu hiện. Tiếp theo là bước lên men, cảm ứng biểu hiện, thunhận proinsulin và xử lý để thu nhận insulin. Protein được biểu hiện dưới dạngthể vùi nằm trong tế bào chất, do vậy cần biến tính để làm tan, sau đó tiếnhành tái gấp cuộn để có proinsulin có cấu hình tự nhiên. Proinsulin tái gấp cuộnđược xử lý bằng protease cắt loại đoạn nối nội phân tử (đoạn peptide C) để thuinsulin có hoạt tính. Đối với phương pháp sản xuất theo 2 mạch polypeptide, -3-Luận án Tiến sĩ Đặt vấn đề trước hết phải tạo dòng các chủng chủ riêng rẽ mang các gen mã hóa cho 2chuỗi polypeptide khác nhau (chuỗi A, chuỗi B). Sau đó tinh chế thu nhận cácchuỗi polypeptide A và B và thực hiện phản ứng tạo cầu nối disulfide để thunhận insulin có hoạt tính. Ở Việt Nam, nhu cầu sử dụng insulin rất cao, tuy nhiên toàn bộ nguồninsulin sử dụng cho bệnh nhân mắc BTĐ đều phải nhập ngoại nên vừa gây tốnkém ngoại tệ vừa không chủ động được nguồn thuốc để đáp ứng chữa trị kịp thờicho bệnh nhân. Để đảm bảo cho điều trị toàn bộ bệnh nhân mắc BTĐ hàng ngàyvới liều dùng 0,5-1,0 U/kg trọng lượng cơ thể trong một ngày [78], thì Việt Namcần nhập ngoại khoảng từ 120-240 triệu U/ năm, tương đương 420-840 kginsulin/ năm (100U =3,5 mg). Năm 2001, giấy phép độc quyền sản xuất insulintái tổ hợp chính thức hết hiệu lực, mở ra cơ hội lớn cho các nước đang phát triểntrong đó có Việt Nam, có thể tiếp cận được công nghệ hiện đại để phát triển quitrình sản xuất insulin người tái tổ hợp trong nước, mang lại triển vọng góp phầngiải quyết khó khăn trên. Mặc dù bản quyền sản xuất insulin bằng công nghệ DNA tái tổ hợp đãhết hạn tuy nhiên các công ty dược phẩm vẫn tiếp tục giữ những bí quyết côngnghệ có tính thế mạnh của công ty nên rất khó tiếp cận để có được qui trìnhcông nghệ đầy đủ nhằm sản xuất insulin. Do vậy, cần nghiên cứu xây dựngqui trình công nghệ riêng dựa trên những thông tin đã công bố và trình độ côngnghệ sẵn có để tiến đến việc sản xuất insulin trong nước đáp ứng được yêu cầuđặt ra. Năm 2007, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học quốc gia Thànhphố Hồ Chí Minh được giao nhiệm vụ thực hiện đề tài cấp nhà nước “Nghiêncứu công nghệ sản xuất insulin tái tổ hợp điều trị bệnh đái tháo đường”, mã số -4-Luận án Tiến sĩ Đặt vấn đề KC.04.09/06-10. Nội dung nghiên cứu của luận án là thực hiện một phần trongnội dung của đề tài cấp nhà nước này. Về mặt khoa học, mục tiêu của luận án nhằm bước đầu nghiên cứu quitrình tổng hợp insulin người tái tổ hợp theo phương pháp một chuỗi polypeptidetrong E. coli bao gồm tạo dòng E. coli tái tổ hợp biểu hiện mini-proinsulin, lênmen, tái gấp cuộn mini-proinsulin và xử lý để tạo insulin có hoạt tính. Ý nghĩathực tiễn của đề tài là ứng dụng công nghệ gen, công nghệ lên men và côngnghệ protein để tạo ra chế phẩm insulin có hoạt tính dùng làm thuốc trị bệnhtiểu đường.Luận án tập trung nghiên cứu cụ thể các vấn đề sau:- Tạo chủng E. coli tái tổ hợp có mang vector biểu hiện mini-proinsulin táitổ hợp của người.- Xây dựng qui trình lên men nuôi cấy chủng E. coli tái tổ hợp biểu hiệnmini-proinsulin.- Thiết lập qui trình thu nhận và tinh sạch mini-proinsulin từ tế bào chủngE. coli.- Xây dựng qui trình tái gấp cuộn mini-proinsulin và xử lý thu nhận insulincó hoạt tính.- Thử nghiệm hoạt tính insulin tái tổ hợp trên chuột. downloadx... Yêu cầu Download Tài liệu, ebook tham khảo khác
Nghiên cứu phản ứng ghép cặp của tác chất gilman Di-n-Butil đồng litium với Halogenur Alkil
Khảo sát thành phần hóa học của cao cloroform của hoa cây cúc cánh giấy zinnia elegansjacq., họ cúc (asteraceae)
Khảo sát tinh dầu gỗ dó bầu Aquilaria crassna, Pierre ex. Lecomte
Tính ổn định và bền vững của một số tính chất hệ động lực tuyến tính
Khảo sát thành phần hóa học của vỏ cây gỏi (garcinia ferrea pierre)
Khảo sát thành phần hóa học rễ cây đinh lăng lá tròn Polyscias balfouriana bail. họ nhân sâm (araliaceae)
Luận án Xây dựng mô hình đồng quản lý tài nguyên môi trường tại khu bảo tồn biển Cù Lao Chàm tỉnh Quảng Nam
Luận án Số phức và ứng dụng trong chiến lược giải toán bậc trung học phổ thông
Phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất từ rễ cây sắn thuyền (syzygium resinosum (gagnep) merr. et perry)
Khảo sát mối quan hệ định lượng giữa cấu trúc và hoạt tính của các dẫn xuất N-Acylpiperidine
Hệ thống tự động tổng hợp link tải tài liệu, ebook miễn phí cho các bạn sinh viên tham khảo.
