Luận án Nghiên Cứu Công Nghệ Sản Xuất Insulin Tái Tổ Hợp

MỤC LỤC

Trang

LỜI CẢM ƠN .i

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT .vi

DANH MỤC HÌNH.viii

DANH MỤC BẢNG .xi

ĐẶT VẤN ĐỀ.1

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN .5

1.1. Insulin và vai tròđối với cơ thể .5

1.2. Bệnh tiểu đường .8

1.3. Các phương pháp sản xuất insulin . 10

1.3.1. Sản xuất insulin từ tụy tạng động vật.10

1.3.2. Sản xuất insulin người bằng kỹ thuật táitổ hợp DNA .12

1.4. Sản xuất protein tái tổ hợp trong tế bào E. coli.18

1.4.1. Đặc điểm của E. colitrong sản xuất protein tái tổ hợp .18

1.4.2. Các chủng E. colithường dùng trong sản xuất protein tái tổ hợp .20

1.5. Các hệ thống vector biểu hiện trong E. coli.24

1.5.1. Hệ thống pGEX biểu hiện protein dung hợp với GST .24

1.5.2. Hệ thống pET biểu hiện protein dung hợp với 6xHis .25

1.5.3. Hệ thống biểu hiện dung hợp với MBP - Hệ thống pMAL.27

1.5.4. Hệ thống IMPACT biểu hiện protein dung hợp với CBP .27

1.6. Phương pháp lên men vi sinh vật .28

1.6.1. Các phương pháp lên men sản xuất protein tái tổ hợp.28

1.6.2. Đặc điểm lên men mẻ .29

1.6.3. Đặc điểm lên men liên tục .32

1.6.4. Đặc điểm lên men mẻ-bổ sung .32

1.6.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến lên men mẻ-bổ sung chủng E. coliđể sản xuất protein tái tổ hợp .34

1.7. Các bước xử lý sau lên men để thu nhận mini-proinsulin và insulin có hoạt tính .39

1.7.1. Thu nhận và làm tan thể vùi chứa mini-proinsulin .39

1.7.2. Tái gấp cuộn mini-proinsulin tái tổ hợp .40

1.7.3. Cắt loại đoạn peptide C để thu nhận insulin có hoạt tính .43

1.7.4. Các bước xử lý để thu nhận protein mục tiêu từ protein dung hợp .44

1.7.5. Các phương pháp tinh chế trung gian và tinh chế hoàn tất trong sản xuất insulin từ mini-proinsulin.45

1.8. Qui trình sản xuất insulin tái tổ hợp theo mô hình mini-proinsulin.47

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP .49

2.1. Dụng cụ và thiết bị .49

2.1.1. Thiết bị chính dùng trong sinh học phân tử .49

2.1.2. Thiết bị dùng trong thao tác nuôi cấy vi sinh .49

2.1.3. Thiết bị dùng cho tinh chế protein .49

2.1.4. Thiết bị dùng xác định hàm lượng đường huyết.50

2.2. Hóa chất và môi trường .50

2.2.1. Hóa chất .50

2.2.2. Môi trường nuôi cấy vi sinh.55

2.3. Nguyên vậtliệu .55

2.3.1. Chủng vi sinh vật.55

2.3.2. Plasmid .56

2.3.3. Mồi dùng cho tổng hợp gen, tạodòng và giải trình tự .56

2.3.4. Thang phân tử lượng dùng trong điện di .57

2.3.5. Các kháng thể sử dụng cho Western Blot và ELISA .57

2.4. Phương pháp .58

2.4.1. Thiết kế, tổng hợp gen mpimã hóa 6xHis-MPI trong E. colibằng phương pháp PCR tái tổ hợp .58

2.4.2. Tạo dòng gen mpitrong plasmid pBlue (pBIns).61

2.4.3. Tái tạo dòng gen mpivào vector biểu hiện pET-43.1a.62

2.4.4. Cảm ứng biểu hiện và xác nhậnsự biểu hiện của 6xHis-MPI .63

2.4.5. Hoạt hóa chủng E. coliBL21(DE3)/pET43Ins .66

2.4.6. Khảo sát các điều kiện cảm ứng tối ưu sự biểu hiện 6xHis-MPI của chủng

E. coliBL21(DE3)/pET43Ins .66

2.4.7. Khảo sát thay thế trypton bằng pepton trong môitrường LB nuôi cấy E. coli

BL21(DE3)/pET43Ins.68

2.4.8. Khảo sát sự biểu hiện 6xHis-MPI của chủng E. coli BL21(DE3)/ pET43Ins

được nuôi cấy trong môi trường LBp và LB. 68

2.4.9. Khảo sát điều kiện nuôi cấy E. coliBL21(DE3)/ pET43Ins mật độ cao bằng

phương pháp mẻ-bổ sung ở qui mô phòng thí nghiệm .69

2.4.10. Khảo sát điều kiện lên men E. coliBL21(DE3)/ pET43Ins bằng nuôi cấy

mẻ-bổ sung ở qui mô pilot 30L .70

2.4.11. Phương pháp thu sinh khối và đồng nhất tế bào. 71

2.4.12. Thu nhận và làm tan thểvùi chứa 6xHis-MPI .72

2.4.13. Thu nhận và tinh chế sơ bộ 6xHis-MPI bằng sắc ký cột Ni-NTA.72

2.4.14. Phương pháp cắt loại bỏ 6xHis bằng CNBr để thu nhận MPI .72

2.4.15. Khảo sát các điều kiện ảnh hưởng lên sự tái gấp cuộn của MPI .73

2.4.16. Tủa mini-proinsulin và insulin bằng ion kẽm kim loại.75

2.4.17. Phương pháp xử lý MPI bằng trypsin/carboxypeptidase B để thu nhận insulin có hoạt tính .75

2.4.18. Kiểm tra cấu hình của MPI và insulin bằng phương pháp ELISA . 76

2.4.19. Phân tích MPI và insulin bằng sắc ký RP-HPLC .77

2.4.20. Giải trình tự amino acid của MPI bằng khối phổ .77

2.4.21. Phương pháp định lượng protein .77

2.4.22. Phương pháp xác định tính hoạt tính của insulin tái tổ hợp.79

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN.80

3.1. Tạo dòng tế bào E. colicó khả năng biểu hiện mini-proinsulin dung

hợp với 6xHis (6xHis-MPI).80

3.1.1. Tổng hợp gen mpimã hóa mini-proinsulin biểu hiện trong E. coli.80

3.1.2. Tạo dòng gen mpivào plasmid pBlue .81

3.1.3. Tạo dòng tế bào E. coliBL21(DE3)/pET43Ins biểu hiện MPI ở dạng dung hợp 6xHis-MPI .83

3.1.4. Kiểm tra trình tự amino acid của 6xHis-MPI .87

3.2. Lên men E. coliBL21(DE3)/pET43Ins tổng hợp 6xHis-MPI tái tổ hợp

ở qui mô phòng thí nghiệm và qui mô pilot .89

3.2.1. Hoạt hóa, nhân giống và kiểm tra khả năng biểu hiện 6xHis-MPI của

chủng E. coliBL21(DE3)/pET43Ins.89

3.2.2. Khảo sát các điều kiện biểu hiện tối ưu 6xHis-MPI của E. coli

BL21(DE3)/pET43Ins.91

3.2.3. Xác định điều kiện nuôi cấy mật độ cao chủng E. coliBL21(DE3)/

pET43Ins ở qui mô phòng thí nghiệm .95

3.2.4. Nuôi cấy E. coliBL21(DE3)/pET43Ins theo phươngthức mẻ- bổ sung ở qui

mô 30 L để tổng hợp 6xHis-MPI.101

3.3. Thu nhận MPI có cấu hình tự nhiên. 104

3.3.1. Thu nhận thể vùi chứa 6xHis-MPI .104

3.3.2. Thu nhận 6xHis-MPI từ thể vùi.105

3.3.3. Thu nhận MPI từ 6xHis-MPI .107

3.4. Thu nhận insulin từ MPI .111

3.4.1. Tái gấp cuộn MPI .111

3.4.2. Cắt loại peptide C bằng trypsin.116

3.5. Kiểm tra hoạt tính của insulin tái tổ hợp trên chuột .118

3.6. Sơ đồ qui trình công nghệ sản xuất insulin ở qui mô pilot .119

KẾT LUẬN - ĐỀ NGHỊ.122

DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN .124

TÀI LIỆU THAM KHẢO .125

PHỤ LỤC.132