KĨ THUẬT WESTERN BLOT - Tài Liệu Text - 123doc

Tải bản đầy đủ (.docx) (21 trang)

1. Trang chủ
>>
2. Luận Văn - Báo Cáo
>>
3. Y khoa - Dược

KĨ THUẬT WESTERN BLOT

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (270.56 KB, 21 trang )

KĨ THUẬT WESTERN BLOTMỤC LỤCMỞ ĐẦUCHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU PHƯƠNG PHÁP WESTERN BLOT1.1 Sơ lược về Sir Edwin Southern1.1.1 Sơ lược cá nhân1.1.2 Thành tựu1.2 Khái niệm1.3 Nguyên lí1.4 Quy trình1.4.1 chuẩn bị mẫu1.4.2 chạy điện di một chiều với SDS page1.4.3 Chuyển protein từ gen đến màng1.4.4 Lai với Antibody1.4.5 Phát hiện và phân tích hình ảnh1.5 Ưu, nhược điểm1.5.1 Ưu điểm1.5.2 Nhược điểm1.5.3 Đọc kết quả xét nghiệm western blot1.6 Hệ thống V3 Western Blot.1.7 So sánh với phương pháp ELISA1.8 Ứng dụngCHƯƠNG 2: ỨNG DỤNG2.1 Tình hình bệnh và tác hại bệnh trên thế giới và ở Việt Nam2.1.1 Tình hình nuôi tôm trên thế giới2.1.2 Tình hình nuôi tôm ở Việt Nam2.2 giới thiệu hội chứng Taura-TS2.2.1 Khái niệm2.2.2 Đặc điểm cấu trúc của gene của Taura-TS2.2.3 Biểu hiện bệnh hội chứng Taura ở tôm2.3 Các phương pháp và kĩ thuật chuẩn đoán virus Taura2.3.1 Chuẩn đoán dựa vào triệu chứng lâm sàng2.3.2 Phương pháp miễn dịch2.3.3 phương pháp chuẩn đoán mẫu dỏ gene2.4 Vật liệu và phương pháp2.4.1 Các dung dịch gốc để nhuộm màu gel2.4.2 Các dung dịch để thực hiện Western Blot2.4.3 Vật liệu2.4.3.1 Kháng thể112.4.3.2 Mẫu2.4.4 Phương pháp2.5 Kết quảKẾT LUẬNTÀI LIỆU THAM KHẢOMỞ ĐẦUVới những thành công trong công nghệ sinh học trong những năm gầnđây, trên thế giới phương hướng nghiên cứu ứng dụng trong công tác bảo vệthực vật đã có sự chuyển hướng rõ rệt. Cùng với những thành công lớn trongcông nghệ sinh học, thì các kĩ thuật về sinh học phân tử ra đời: phương phápwestern blot, PCR,…Phương pháp western blot là một kĩ thuật quan tromg đượcsử dụng trong tế bào và sinh học phân tử. Bằng cách sử dụng western blot, cácnhà nghiên cứu có thể xác định được protein cụ thể trong một hỗn hợp phứctạp có chứa các protein chiết xuất từ tế bào.CHƯƠNG 1.TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP WESTERN BLOT1.1 Sơ lược về Sir Edwin Southern1.1.1 Sơ lược cá nhân.22-Sir Edwin Southern là một nhà sinh học phân tử ngườiAnh từng đoạt giải thưởng Lasker, giáo sư danh dự tại Đạihọc Oxford và là đồng nghiệp của Trinity College, Oxford.Ông được biết đến rộng rãi nhất với việc phát minh ra blotmiền Nam, xuất bản năm 1975 và hiện là một quy trìnhthí nghiệm phổ biến và phát triển Southern blot cho DNAvào năm 1997.1.1.2 Thành tựu- Người chiến thắng trong giải thưởng quốc tế Gairdner-Foundation (1990)Trao tặng Huân Chương Hoàng gia của Hội Hoàng Gia-London (1998)Giải thưởng danh giá Albert Lasker cho nghiên cứu y họclâm sàng (2005)1.2 Khái niệm-Western blot là kĩ thuật xét nghiệm protein trênpolyacrylamide gel chuyển đến môi trường bền vững hơn-và cố định.Là kĩ thuật lai giữa protein với protein(giữa kháng nguyênvới kháng thể) protein kháng nguyên được phát hiện quaphản ứng tạo màu hoặc phát huỳnh quang.331.3 Nguyên líTrong Western Blot, một hỗn hợp protein được phân tách bằng điệndi SDS-PAGE, miếng gel được ngâm với sodium dodecyl sulfate (SDS) – làmột tác nhân biến tính protein. Các vạch protein được chuyển lên màngnitrocellulose và từng vạch protein được phát hiện bằng cách ngâmmàng cellulose với kháng thể đơn dòng và đa dòng có gắn enzyme hoặcđánh dấu phóng xạ đặc hiệu cho protein quan tâm. Nếu protein quantâm được kết hợp bởi kháng thể đánh dấu phóng xạ, vị trí của nó trêncác điểm có thể được phát hiện bằng cách chụp màng lên tấm film Xquang.1.4 Quy trình tiến hành1.4.1 Xử lí mẫu- Nên lấy mẫu từ toàn bộ mô hay canh trường (môi trường nuôi cấy) tế bào.Đầu tiên, xử lý mô rắn bằng phương pháp cơ học như sử dụng máy nghiền (khilượng mẫu lớn), sử dụng máy đồng hóa (máy nghiền đồng thể) hoặc siêu44âm (với số lượng mẫu nhỏ). Cũng có thể phá hủy tế bào bằng một trong cácphương pháp hóa học như trên. Tuy nhiên, những mẫu virus hay mẫu lấy từ môitrường cũng có thể là nguồn protein xác định được trong Western Blot, khôngbắt buộc phải là nghiên cứu tế bào.- Có thể sử dụng các loại chất tẩy rửa, muối, và đệm để thúc đẩy ly giải tế bàovàhòatanprotein. Thườngbổsungcácchấtkìmhãmprotease và phosphatase để ngăn chặn sự phá hủy mẫu bằng chính các enzymecó trong mẫu. Nên tiến hành chuẩn bị mô ở nhiệt độ thấp để tránh hiệntượng biến tính protein và suy giảm (mất chức năng).- Phối hợp kỹ thuật hóa sinh và cơ học – bao gồm nhiều phương pháp lọc và lytâm – có thể được sử dụng để phân tách các thành phần tế bào và các bàoquan khác nhau.1.4.2 Chạy điện di một chiều với SDS page- Phổ biến của điện di gel sử dụng gel polyacrylamide và bộđệm được nạp với SDS (sodium dodecylsulfate): là mộtchất khử amionic gây biến tính protein bằng cách baoquanh bộ khung polypeptide khiến các phân tử duỗithẳng ra.55-Hỗn hợp protein được hoà tan trong dung dịch sodiumdodecyl sulfate(SDS), một chất tẩy mang điện tích âm sẽ-phá tất cả các nối không cộng hoá trị của protein ban đầu.Điện tích âm có đựơc do gắn với SDS lớn hơn rất nhiềuđiện tích của bản thân proteinban đầu; vì thế điện tíchban đầu của protein không ảnh hưởng đáng kể đến điệntích của phức hợp.Phức hợp SDS-protein sau đó sẽ là mẫuđể chạy điện di. Sau đó các mẫu được nạp vào các giếng-trong gel.Độ phân giải của SDS-Page là rất rất lớn, các phức hànhđược tách thành hàng trăm vết bang trên gel. Khi điện dikết thúc, những protein trên gel sẽ được nhìn thấy là mộtdãy các băng bằng cách nhuộm với bạc hay một chấtnhuộm màu như Coomassie blue.1.4.3 Chuyển protein từ gen đến màng- Để các protein có thể vào để phát hiện kháng thể, cácprotein được chuyển từ trong gel lên một màng-nitrocellulose hoặc polyvinylidene difluoride (PVDF).Phương pháp chính để chyển các protein và sử dụng mộtdòng điện để kéo protein gel vào protein gel vào PVDFhoặc màng nitrocellulose. Tính đồng nhất và hiệu quả tổng thể của chuyển protein từ gel màng cóthể được kiểm tra bằng cách nhuồm màng với coomassise Brilliant Bluehoặc S thuốc nhuộm ponceau. Ponceau S là phổ biến hơn của hai, do độnhạy cao hơn và độ hoà tan nước, sau này làm cho nó dễ dàng hơn đểsau đó destain và thăm dò màng.1.4.4 Lai với Antibody66- Các protein được chuyển sang màng lai nitrocellulose, giữ nguyên vị trí như đãphân tách trên gel. Rửa màng lai từ 5-10 phút trong dung dịch TBS.- Ủ trong dung dịch khoá.- sau khi rửamangf lai 2 lần TBS, 5-10 min cho mỗi lần rửa.- Ủ màng lai đã cố định protein trong 1-2 giờ với một kháng thể sơ cấp (primaryantibody) với sự kích động nhẹ. Kháng thể sơ cấp là một kháng thể đặc hiệu, sẽbám vào protein và sẽ tạo thành một phức hợp protein-kháng thể đối vớiprotein quan tâm.- Sau rửa màng lai 2-6 lần với TTBS, 5-10 min cho mỗi lần rửa.- Tiếp theo ủ màng lai với một kháng thể thứ cấp (secondary antibody) cóenzyme (alkalin phosphatase hoặc horseradish peroxidase) đi kèm trong mộttiếng có sự kích động nhẹ.- sau rửa màng lai 3-6 lần với TTBS, 5-10Min cho mỗi lần rửa.- Sau rửa màng lai lần cuối với TBS.- Tiếp tục ủ màng lai trong một hỗn hợp phản ứng đặc hiệu với enzyme. Nếumọi việc đều diễn ra một cách chính xác sẽ phát hiện thấy các băng ở bất kì nơinào có mặt phức hợp protein-kháng thể thứ cấp-enzyme hay nói cách khác là ởbất kì nơi nào có mặt protein quan tâm.- Đặt một phim nhạy cảm với tia X lên màng lai để phát hiện các điểm sang phátra do enzyme.1.4.5 Phát hiện và phân tích hình ảnh77- Phương pháp phát hiện đo màu phụ thuộc vào ủ màng lai với một chất nền cókhả năng phản ứng với các enzyme (như peroxidase) được rang buộc với cáckháng thể thứ cấp.- Phản ứng này diễn ra bằng cách chuyển đổi thuốc nhuộm hoà tan thành mộtdạng không hoà tan của một màu sắc khác tủa thành vết ngay bên cạnh cácenzyme và qua xuất hiện vết trên màng.- Các đầu dò gắn huỳnh quang được kích thích bởi ánh sang và sự phát xạ kíchthích sau đó được phát hiện bởi một photosensor như CCD máy ảnh được trangbị với các bộ lọc khí thải thích hợp chụp một hình ảnh kĩ thuật số và cho phépphân tích dữ liệu xa hơn như phân tích trọng lượng phân tử số lượng phân tử.- Phương pháp phát hiện Chemilumnescent phụ thuộc vào ủ màng lai với mộtchất nền sẽ luminesce khi tiếp xúc với reporter trên kháng thể thứ cấp. Ánh sangsau đó được phát hiện bởi phim ảnh, và gần đây hơn bởi máy ảnh CCD chụp mộthình ảnh kĩ thuật số.1.5 Ưu, nhược điểm1.5.1 Ưu điểm- Đây là một trong những phương pháp xét nghiệm giántiếp tìm kháng thể kháng kháng nguyên của virus HIV,thường làm sau nguy cơ 3 tháng và là một trong những-xét nghiệm có giá trị khẳng định.Theo tổ chức y tế thế giới quy định: để đánh giá trườnghợp (+) dương tính với HIV cần thiết phải có ít nhất 2 mẫuthử dương tính:+ Elisa + Western blot+ Hoặc IFA + Western blot- Ưu điểm nổi bật của xét nghiệm này là kháng nguyên nàocũng có thể phát hiện HIV1&2 kháng nguyên tinh chếđược điện li trong gel Polyacrylamide và được chuyển-sang giấy nitrocellulose và được ủ với huyết thanh.Hầu như các kháng thể kháng kháng nguyên của HIV đềuđược phát hiện kể cả những kháng thể của kháng nguyênquan trọng nhất:88+ Kháng thể P24 ( Kháng nguyên lõi tiền nhân của P24 và P55).+ Kháng thể kháng gen vỏ gp160 và các mảnh tạo ran ó gp 120.+ Kháng thể kháng protein màng gp41 mà hầu hết nhiễm HIV đều cóliên quan đến cấp độ lâm sang của họ.+ Kháng thể kháng các sản phẩm gen của Polymerase P31, P51, P66.+ Kháng thể đối với gen tat P14, gen nef P27, gen vif P23 và của gengag P31.P9.P7 tuy không thường xuyên xuất hiệ. Nhạy hơn Elisa vì pha loàng2log huyết thanh.1.5.2 Nhược điểm.- Nhược điểm của phương pháp xét nghiệ nay là khó và đắthơn Elisa, phụ thuộc chủ quan người đọc bằng mắtthường và đòi hỏi thời gian 24h.1.5.3 Đọc kết quả xét nghiệm western blot.- Đọc kết quả xét nghiệm Western blot :+ Kết quả dương tính khi : Theo trung tâm kiểm soát bệnh tật của Mỹ CDC: khi có kháng thểkháng vỏ và ít nhất một dải bang đặc trưng khác của HIV. Ngoàira cần có sự có mặt của P41 là đủ để kết luận (+). Theo tiêu chuẩn của y tế thế giới: (+) khi có 2 dải protein vỏ (+),Protein lõi, Protein Polymerase.+ Kết luận là âm tính: khi không có dải bang nào đặc trưng cho HIV.+ Kết qủa không xác định: Khi những hình thái xuất hiện dải bang khác không đủ tiêu chuẩnnêu trên và phải xét nghiệm lại sau 2-3 tháng vì kháng thể khángkháng nguyên lõi (P17 P24, P55) chứng tỏ có nhiễm trùng sớmvới HIV. Bộ sinh phẩm mới đòi hỏi không một dải bang nào không (-) mớiđược coi là âm tính và phải có P24, P31, P41 hay P160 mới đượccoi là dương tính. Tỉ lệ (+) giả cũng có thể có tuy rất ít ví có người Western blot (-)nhưng nuôi cấy lại là (+). Tỉ lệ chỉ xảy ra trên khoảng 1/250 000người khi sử dụng đồng thời Elisa và Western Blot. Khuyến cáo sử sụng Elisa cùng với Western blot để khẳng địnhHIV (+)1.6 Hệ thống V3 Western Workflow99Bio-Rad’s V3 Western Workflow là một phương pháp gồm 5 bước để đơn giảnquy trình western blotting:B1: Tách biệt proteinChứa một công nghệ độc đáo được xây dựng vào hoá học gel cho phép-nhanh chóng, chất lượng cao, tách biệt protein trong thời gian ít nhất là 15 phút.- B2: Hình tượng hoá các proteinSử dụng công nghệ miễn phí vết,covalently liên kết với protein, sau 1phútkích hoạt trên một MP ChemiDoc màn hình.- B3: Chuyển proteinTrans-Blot Turbo hệ thống là một protein bộ máy chuyển giao nhanhchóng có thể Làm giảm các bước chuyển giao ít nhất là 3 phút, trong khi duy trìchuyển protein cao hiệu quả trên một loạt các khối lượng phân tử.- B4: Xác minh chuyển giao proteinChemiDoc MP màn hình kết hợp với công nghệ bẩn miễn phí cho phépxác minh ngay lập tức chuyển protein.- B5: Validate và quantitateCó thể được để xác nhận dữ liệu wedtern thấm qua bình thường hoáprotein tổng số kết hợp với protein vệ sinh.1.7 So sánh với phương pháp ELISA.1.7.1 Phương pháp Elisa (enzyme immune assay)Còn được gọi là EIA ( enzyme immune assay)- Nguyên tắc: dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữa khángnguyên và kháng thể được gắn với một enzyme bằng liênkết đồng hoá trị. Kháng nguyên được gắn bó với giếng1010plastic và kháng thể liên kết với enzyme và được gắn vớikháng nguyên. Kháng thể không gắn kháng nguyên sẽ bịrửa trôi đi. Enzyme được giữ lại và vì vậy lượng kháng thểgắn enzyme được phát hiện bằng cách cho them vào mộtcơ chất (introphenol phosphate) làm thay đổi màu dohoạt tính của enzyme. Độ màu tạo thành là tỉ lệ với lượngenzyme bám ở giếng plastic, từ đó suy ra lượng khángthể, sau đó tiếp tục suy ra lượng kháng nguyên.- Quy trình:+ phương pháp này được thiết kế cho việc phát hiện và định lượngvật chất như peptides, protein, antibodies,…+ Kĩ thuật ELISA gồm 3 thành phần tham gia phản ứng: kháng nguyê,kháng thể và chất tạo màu, được thực hiện qua 2 bước: Phản ứng miễn dịch học: là sự kết hợp giữa kháng nguyên vàkháng thể. Phản ứng hoá học: thông qua hoạt tính xúc tác của enzymelàm giải phóng oxy nguyên tử [O] từ H2O để oxy hoá chất chỉthị màu, do đó làm thay đổi màu của hỗn hợp trong dung dịchthí nghiệm+ Kĩ thuật này khá nhạy cảm và đơn giản, cho phép xác định đượckháng nguyên hay kháng thể ở một nồng độ rất thấp.1.7.2 So sánh- Phát hiện màu- Mẫu dò+ Trích từ protein của tế bào.+ Phức hợp protein-kháng nguyên sơ câp-kháng nguyên thứ cấp.+ Gắn với enzyme hoặc đánh dấu phóng xạ.+ Chạy trên gel SDS-PAGE.+ Tắc nghẽn với protein dư.+ Kháng thể đối kháng với protein X được đánh dấu phóng xạ hayenzyme.+ Trích từ kháng nguyên+ Phức hợp giữa kháng nguyên-kháng thể.+ Cho thêm chất tạo màu.1111+ Chạy trên đĩa plastic.+ Tắc nghẽn với kháng nguyên dư.+ Kháng thể gắn đặc hiệu với kháng nguyên thông qua enzyme.1.8 Ứng dụngPhương pháp western blot được ứng dụng để:- Xác định sự hoạt động của gen thông qua sự có mặt của-protein trong mô.Đánh giá mức độ hoạt động mạnh yếu của gen mục tiêu.Đánh giá độ lớn của gen mục tiêu.Định dạng protein mục tiêu.Phân tích cây trồng chuyển đổi gen.Đánh gía tính chuyên biệt của antibody.Phân tích bệnh do vi khuẩn và virus gây ra.Phân tích sự phát triển của thực vật.Trong thực tế, western blot được ứng dụng để:-Xác định bênh nhân có kháng thể chống HIV trong mẫu huyết thanh không.Western Blot sử dụng như một thử nghiệm xác minh về nhiễm viêm gan B.CHƯƠNG 2: ỨNG DỤNG2.1 Tình hình bệnh và tác hại bệnh trên thế giớivà Việt Nam2.1.1 Tìnhhìnhnuôitômtrên thếgiới.Hiện nay, nghề nuôi tôm đang trên đà phát triển mạnh vầ một trong nhữngnghành đem lại thu nhập lớn cho nền kinh tế quốc dân của một số nước trênthế giới. Tuy nhiên, nghề nuôi tôm gặp không ít khó khan do tôm mắc bệnh vàgây chết hang loạt. Một rong những bệnh nguy hiểm nhất đối với tôm nuôi hiệnnay do virus gây nên là virus hội chứng Taura (TSV). Bệnh xảy ra ở tất cẩ cácnước nuôi tôm và ảnh hưởng lớn đến nghề nuôi tôm công nghiệp trên thế giới(Nguyễn Văn Hảo,2000). Trong thời gian qua, virus hội chứng taura(TSV) đã bùngphát ở nhiều khu vực nuôi tôm trên thế giới, đặc biệt là các nước châu Mỹ1212Latinh. Vào tháng 4/2005 virus hội chứng Taura lại gây dịch lớn ở ChâuMỹ(Infofis, 6/4/2005), khiến sản lượng tôm của Venezuela sụt giảm khoảng 90%.Và dần dần virus hội chứng Taura cũng đã lây lan sang các nước Châu Á khi tômTCT được du nhập và nuôi nhiều như ở Đài Loan, Trung Quốc, Thái Lan. Năm1999/2000 TSV được phát hiện ở TCT tại Trung Quốc và Đài Loan (Tu et al., 1999;Yu và Song,2000) với 19 trường hợp thông báo cho OEI từ Đài Loan vào năm1999, dẫn đến 700.000 trường hợp và 200.000 tôm chết vào năm 2000 và dẫnđến 500.000 trường hợp vầ 50.000 tôm chết vào năm 2001.2.1.2 Tìnhhìnhnuôitôm tạiViệtNam.Việt Nam có nhiều điều kiện thuận lợi để phát triển nghề nuôi tôm biển.Sản lượng tôm xuất khẩu toàn quốc đã từng đạt 40-45 ngàn tấn/năm, chiếm gần10% sản lượng tôm Châu Á, mang lại lợi ích đáng kểcho người nuôi tôm (Lý ThịThanh Loan 2001). Cùng với sự phát triển của nghề nuôi tôm trên qui mô côngnghiệp,”dịch bệnh” tôm tại Việt Nam cũng đã bắt đầu xuất hiện ngay từ nhữngnăm đầu thập niên 90. Năm2003, bệnh hội chứng Taura đã bùng phát ở tôm thẻchân trắng, gây ảnh hưởng nghiêm trọng tại nhiều vùng nuôi như Quảng Ninh,Phú Yên, Bạc Liêu, Cà Mau.2.2 Giới thiệu về hội chứng Taura-TS.2.2.1 Kháiniệm.Tên phổ thông thường gọi là virus gây bệnh hội chứng Taura(TSV). Ngoài racó một số tên gọi khác chỉ tác nhân gây bệnh hội chứng Taura (Taura SyndromeDisease-TSD); bệnh đỏ đuôi (Red Tail Disase-RTD) (Lightner,1996).2.2.2 Đặcđiểmcấu1313trúccủagenecủaTaura-TS.TST là loại virus RNA có dạng hình khối 20 mặt, đường kính 30-32nm, Không-có vỏ envelope được sao chép trong nguyên sinh chất tế bào vật chủ.Genome của TSV có kích thước khoảng 9kb, xoắn đơn thẳng, có 10.205nucleotid, tạo chuỗi poly-A-3’, chứa hai khung đọc mở (Open ReadingFrame-ORF) lớn.2.2.3 BiểuhiệnbệnhhộichứngTaura ởTôm.Hội chứng Taura được biết là bệnh của tôm thẻ chân trắng ở giai đoạn cònnhỏ xảy xa trong khoảng 14-40 ngày sau khi thả. Tôm bị hội chứng Taura thườnglầ hội chứng loại tôm giống nhỏ, khoảng 0.05-5g , tuy nhiên tôm lớn hơn cũngcó thể bị ảnh hưởng. Quá trình diễn biến của bệnh hội chứng Taura xuất hiệnchủ yếu trong giai đoạn của một chu kì lột xác. Biểu hiện bệnh tiến triển theohai pha:+ Pha tiền cấp tính có biểu hiện: Thường thấy tôm chết hoặc hấp hối trong lưới hoặc nằm dưới đáy bể. Tôm thường yếu và mất phương hướng khi di chuyển. Biểu hiện sự lan toả vùng sắc tố đỏ làm cho toàn thân tôm có màu đỏnhạt, quạt đuôi và chân bò có màu đỏ rõ rệt và thường chết trong khilột xác.1414 Vỏ mềm, ruột trống rỗng và thường ở giai đoạn muộn của chu kì lộtxác. Là điểm nhạy cảm trong quá trình phát sinh bệnh hội chứng Taura.+ Pha mãn tính có biểu hiện: Biểu hiện kiểu tổn thương của bệnh dovi khuẩn gây ra như có nhiều điểm bị đen hoá.2.3 Các phương pháp và kỹ thuật chẩn đoánvirus Taura.2.3.1 Chẩnđoándựavàotriệuchứnglâmsàng.Ở thời kì phát bệnh tôm có màu đỏ nhợt nhạt, toàn bộ vỏ thân và ở đuôicó màu đỏ rõ rệt (bệnh đỏ thân, hồng thể) kèm theo những dấu hiệu tiêu biểumỏng vỏ, xoang tiêu hoá rỗng, tôm thường chết nhiều trong thời kì lột xác.2.3.2 Phương phápmiễndịch.Có thể sử dụng Monoclonal Antibodies (Mas) để xác định TSV ở nhữngmẫu huyết và dịch tế bào đồng thể từ tôm. Mas còn có thể áp dụng để kiểm tranhững mẫu mô đông lạnh, hoặc đã cố định. Hiện trên thị trường có sản phẩmcủa DiagXotics.2.3.3 Phương phápchẩnđoánbằng1515mẫu dògen.Nguyên lí của phương pháp là sử dụng một đoạn oligonucleotide (thiết kếtrên trình tự gene đặc hiệu của TSV) gắn với một chất chỉ thị và gọi là mẫu dò(probe). Chất chỉ thị có thể là enzyme, đồng vị hoặc chất phát huỳnh quang…Sauđó lai probe với DNA-RNA của virus. Những probe này được tổng hợp trongphòng thí nghiệm hoặc từ những nguồn thương mại. Phương pháp này có độchính xác đặc hiệu, độ nhạy lớn hơn những phương pháp chẩn đoán truyềnthống, tế bào học cổ điển.2.4 Vật liệu và phương pháp.2.4.1 Cácdungdịchgốc đểnhuộm-gel.Dung dịch nhuộm (0.025% Coomassie Brillant Blue R250; 40% methanol; 7%-acetic acid).Dung dịch giải nhuộm I (40% methanol; 7% acetic acid).Dung dịch giải nhuộm II (5% methanol; 7% acetic acid).2.4.2 Cácdungdịchgốc đểthựchiệnwestern blot.Towbin transferbuffer (25mM Tris, 192mM glycine, 20%meOH, 0.1%SDS).2.4.3.1 Kháng thể162.4.3 Vật liệu162.4.3.1-Kháng thể sơ cấp: kháng thể đa dòng tổng hợp kháng với WSSV, IHHNV,MBV, YHV (được sản tại phòng thí nghiệm Công Nghệ Tế Bào Động Vật-Viện-Sinh Học Nhiệt Đới).Kháng thể sơ cấp: kháng thể đa dòng đặc hiệu với RTV ( được sản tại phòngthí nghiệm Công Nghệ Tế Bào Động Vật-Viện Sinh Học Nhiệt Đới).- Kháng thể thứ cấp: IgG kháng huyết thanh thỏ kháng IgY, được đánh dấuenzyme Peroxidase.2.4.3.2 Mẫu- Chuẩn bị mẫu+ Protease của tôm cũng như của các loài động vật thuỷ sinh khác làprotease nội bào, nó tập trung nhiều nhất ở cơ quan tiêu hoá , sau đó dến nộitạng và cơ thịt. Đặc biệt ở tôm do đặc điểm hệ tiêu hoá nội tạng nằm ở phầnđầu nên hệ enzyme sẽ tập trung nhiều nhất ở phần đầu sau đó đến các cơ quankhác.+ Mẫu đầu và nội tạng tôm sú được phân tách từ tôm sú sống , loại40-50 con/kg được nuôi ở Cần Thơ . Tôm được chở trong thùng sục khí vềphòng thí nghiệm , rửa sạch và giất chết bằng cách trộn với đá vụn , tỷ lệ tôm/đá là 1:3, sau đó tách lấy đầu hoặc nội tạng .+Xay đầu tôm trên cối xay thịt , nghiền nhuyễn bằng cối inox với cátthạch anh đã xử lý và làm sạch . Nội tạng chỉ nghiền . Dùng dung môi (nước cất ,dung dịch muối sinh lí, đệm phosphate, đệm Tris HCl) với các tỉ lệ khác nhau ,khuấy đảo liên tục ở điều kiện nhiệt độ 0-4 độ C trong 40 phút để chiết rútenzyme , ly tâm lạnh ở 4 độ C , tốc độ 6000 vòng/phút trong 15 p để loại bỏphần cặn , thu dịch chiết (DC) . Khảo sát ảnh hưởng tỷ lẹ dung môi và loại dungmôi chiết với mẫu.- Mẫu được lấy+ Virut gây hội chứng đỏ đuôi thu từ tôm sú (RTV- Pm) được nhânlên trong tế bào côn trùng SF9.+ Virut gây hội chứng đuôi thu từ tôm thẻ chân trắng (RTV- Pv) đượcnhân lên trong tế bào côn trùng SF9.2.4.4Phương pháp.1717Khá2.4.4.1 Phương pháp SDS-PAGE.- SDS Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) là phương pháp điện diprotein đứng, để phân tách được các thành phần protein theo trọng lượngphân tử .- Chuẩn bị mẫu để điện di:+Mẫu nhận trực tiếp từ phòng Công Nghệ Tế Bào Động Vật-Viện SinhHọc Nhiệt Đới.+Trong một Tube Eppendorf, trộn một thể tích (V) mẫu protein vớimột thể tích (V) 2X Treatment buffer.Đặt vào nồi đun cách thuỷ đang sôi trong 2phút. Mẫu sau khi chuẩn bị xong nên giữ trong đá bào cho đến khi thực hiện thínghiệm.+ Dùng pipette với đầu tip (cone) nhỏ, cho mẫu từ từ vào giếnggel.Luôn luôn để một giếng chứa thang protein chuẩn.-Thực hiện điện di+Đậy nắp máng điện di. Nối 2 điện cực vào bộ cấp điện.+ Bật điện bộ nguồn. Chỉnh dòng điện 100mA.+ Quan sát sự di chuyển của vạch màu trong gel điện di, nếu vạchmàu chạm đáy gel, tắt bộ điện nguồn. Quá trình điện di đã hoàn tất.+ Đổ bỏ dung dịch điện di. Gở khuôn gel ra máng. Cẩn thận gở táchgel ra khỏi khuôn gel để tiến hành nhuộm hay blotting.2.4.4.2 Phương pháp Western Blot.Sau khi thực hiện chuyển Protein lên gel SDS ta thực hiện phản ứng gắnprotein-kháng thể bằng phương pháp Western blot với những bước như sau: Tách bỏ phần stacking gel ra khỏi running gel. Ngâm running gel trong Towbintransfer buffer trong 5-15 phút để cân bằng ion. Ứng với mỗi gel, cắt giấy thấm và màng nitrocellulose cho vừa với cassetle. Làm ướt màng nitrocellulose bằng cách thả dần vào trong khay nước nước cấttrong 2-3 phút. Đặt gel lên màng rồi cho vào giữa hai tờ giấy thấm dày đã cắt ở bước 2. Sauđó kẹp chúng vào giữa hai tấm bọc nylon mềm (sponge) và kẹp vào cassette.Tất cả các thao tác này đều được phải thực hiện trong một khay chứa Towbintransfer buffer.1818 Dùng một pipette thuỷ tinh lăn lên trên để đuổi bỏ bọt khí (nếu có) giữa cáclớp. Cho dung dịch Towbin transfer buffer vào buồng để ngập hai hai lưới điện cực. Cho cassette đã chuẩn bị ở bước 4 và 5 vào buồng, chú ý đặt mặt có màngnitrocellulose gần lưới điện cực [+]. Đặt buồng lên trên máy khuấy từ. Nối hệ thống làm lạnh vào buồng. Bật máyquay từ để làm lạnh dung dịch đệm trong quá trình chuyển band.Nối buồng với bộ cấp năng. Bật bộ điện cấp năng và điều chỉnh điện thế 50V.Sau khi hoàn tất chuyển band, chuyển điện thế về zero, tắt nguồn điện.Tháo cassette và lấy màng ra khỏi hệ thống.Màng nitrocellulose này sẽ được đưa vào quy trinh phát hiện bằng phản ứngmiễn dịch. Ủ màng trong 100ml dung dịch TTBS hoặc TTBS có chứa 5% skim milk (blockingbuffer) trong một giờ ở nhiệt độ phòng hay qua đêm ở 4 độ C. Đổ bỏ dịch này, Rửa 3 lần Trong 10 phút với TTBS, tiếp tục ủ màng với TTBS cópha kháng thể đặc hiệu (primary antibody) ở độ pha loãng 1/5000. Thời gian ủlà 60 phút ở 37độ C. Rửa màng 3 lần trong 10 phút bằng TTBS. Ủ tiếp màng trong dung dịch TTBS có pha kháng thể cộng hợp ở nộng độ1/50000. Thời gian ủ là 60 phút ở 37 độ C. Rửa màng 3 làn trong 10p bằng TTBS .Sau bước này, tiến hành quá trình sinhmàu. Cho màng vào dung dịch hiện màu( pha dung dịch hiện màu bằng cách cho1mg DAB vào 4ml PBS ,trộn đều. Lọc qua giấy lọc. Sau đó cho 120ul dung dịchCoCl2 1% vào dịch lọc trên. Tiếp tục cho 3ul H2O2 vào dịch mới pha). Ủ trongtối 5- 30p cho đến khi màu xanh nâu của các band đặc hiệu hiện rõ. Rửa màng nhiều lần với nước cất. Chụp hình ngay. Nếu muốn lưu lại thì dể khôrồi gói trong giấy bạc . Mẫu được phân loại bằng điện di trên gel polyacrylamide12,5% chuyển thấmqua màng nitrocellulose blocking bằng TTBS hoăc TTBS có chứa 5% skim milk. Ủ với kháng nguyên mục tiêu trên màng với kháng thể sơ cấp. Rửa. Hiện màu. Chụp hình.2.5 Kết quả.- Giếng 1: Thang protein chuẩn Low Range.1919- Giếng 2,3: Dịch siêu ly tâm tế bào nhiễm RTV từ tôm sú thu ở Long An (RTVPmLA/SLT).- Giếng 4,5: Dịch tế bào (DTB) Sf9.- Giếng 6,7: DTB nhiễm RTV từ tôm sú thu ở Cần Giờ bị bệnh (RTV-PmCG).- Giếng 8: DTB nhiễm virus thu từ tôm sú long An bị bệnh RTV (RT-PmLA)- Giếng 9,10: DTB nhiễm RTV từ tôm thẻ chân trắng (RTV-PvM). Nhận xét: Kết quả cho thấy một số vạch protein từ gel điện di đã đượcthể hiện trên màng lai này. Đó là các protein gắn đặc hiệu với kháng thể.Kết qủa xác định được một số vạch protein từ các mẫu nhiễm virus khácso với mẫu tế bào đối chứng.KẾT LUẬN1. Western blot là một kĩ thuật phân tích được sử dụng rộng rãi để phát triểncác protein cụ thể trong các mẫu.2. Sử dụng điện di gen tách các protein có nguồn gốc biến tính bằng chiều dàicủa chuỗi polypeptide hoặc bởi cấu trúc 3-D của protein.3. Các protein đó được chuyển giao cho một màng, nơi đang thăm dò (pháthiện) bằng cách sử dụng các kháng thể đặc hiệu vớiprotein.4. Western blot còn được sử dụng trong các lĩnh vực sinh học phân tử, hoásinh, immuunogenetics và các ngành sinh học phân tử khác.TÀI LIỆU THAM KHẢO1. />tbm=isch&sa=1&ei=BiYoW93aAcG0rQGwmYygDQ&q=V3+WESTERN+WORKFLOW&oq=V3+WESTERN+WORKFLOW&gs_l=img.3...3209.5230.0.5759.10.10.20200.0.0.0.171.1292.0j10.10.0....0...1c.1.64.img..0.0.0....0.TzZGgSOjXmI#imgdii=1adfEMp_sRPw2M:&imgrc=F3hLYSy7Cal4CM:12. />3. />4. />%E1%BB%87-dna-t%C3%A1i-t%E1%BB%95-h%E1%BB%A3p-c%C3%B4ng-ngh%E1%BB%87-sinh- h%E1%BB%8Dc?p=852.5.1.1PhưpháPAG2121

Tài liệu liên quan

• Các kĩ thuật của Visual C++.pdf
  • 10
  • 849
  • 1
• Một số biện pháp marketing nhằm mở rộng thị trường của công ty ứng dụng công nghệ kĩ thuật Hạ Long.doc.DOC
  • 31
  • 1
  • 5
• Thực trạng bảo hiểm kĩ thuật ở VINARE.doc.DOC
  • 66
  • 440
  • 0
• Các giải pháp huy động vốn cho phát triển cơ sở hạ tầng kĩ thuật ở quận Hoàng Mai,thành phố Hà Nội.DOC
  • 30
  • 1
  • 0
• TỔNG QUAN VỀ ĐẶC ĐIỂM KINH TẾ - KĨ THUẬT VÀ TỔ CHỨC BỘ MÁY QUẢN LÍ HOẠT ĐỘNG SẢN XUẤT KINH DOANH CỦA CÔNG TY CỔ PHẦN KIẾN TRÚC VÀ CÔNG NGHỆ TIẾN BỘ (AATC).DOC
  • 43
  • 1
  • 4
• TỔNG QUAN VỀ ĐẶC ĐIỂM KINH TẾ - KĨ THUẬT VÀ TỔ CHỨC BỘ MÁY QUẢN LÍ HOẠT ĐỘNG SẢN XUẤT KINH DOANH CỦA CÔNG TY CỔ PHẦN VẬN TẢI Ô TÔ ĐIỆN BIÊN.DOC
  • 35
  • 1
  • 4
• Thực trạng kế toán tiền lương và các khoản trích theo lương tại công ty cổ phần phát triển kĩ thuật thương mại.DOC
  • 30
  • 571
  • 1
• Một số giải pháp nâng cao hiệu quả hoạt động kinh doanh nhập khẩu tại Công ty TNHH Thương mại và Dịch vụ kĩ thuật Tân Long.doc
  • 67
  • 1
  • 7
• Vốn lưu động và các giải pháp tài chính nhằm nâng cao hiệu quả tổ chức sử dụng vốn lưu động tại công ty TNHH dịch vụ và kĩ thuật ô tô HC.doc
  • 71
  • 1
  • 7
• Nâng cao chất lượng công tác đào tạo và phát triển công nhân kĩ thuật của tập đoàn công nghiệp tàu thuỷ Việt Nam.docx
  • 64
  • 664
  • 5

Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

(263.71 KB - 21 trang) - KĨ THUẬT WESTERN BLOT Tải bản đầy đủ ngay ×