Tìm Hiểu Thêm Về Kĩ Thuật Western Blot - Đông Y Vạn An

Có thể bạn quan tâm

Tìm hiểu thêm về kĩ thuật Western Blot

on May 18, 2016 Western Blot là một kỹ thuật phân tích được sử dụng rộng rãi nhằm phát hiện các protein chuyên biệt trên các mẫu mô hay dịch chiết xuất mô. 1. Nguyên lý Western Blot là kỹ thuật lai giữa protein với protein (Kháng nguyên – Kháng thể). Protein kháng nguyên được phát hiện qua phản ứng tạo màu hoặc phát huỳnh quang 2. Các bước thực hiện:

Bước 1: Xử lý mẫu Lấy mẫu từ toàn bộ mô hay môi trường nuôi cấy tế bào. Đầu tiên, xử lý mô rắn bằng phương pháp cơ học . Những mẫu virus hay mẫu lấy trừ trong môi trường nuôi cấy cũng có thể là nguồn protein xác định được trong Western Blot. Thêm các loại chất tẩy rửa, muối và dung dịch đệm để ly giải tế bào và hòa tan protein Bước 2: Điện di trên gel Điện di trên gel để phân tách các protein trong mẫu. Sự phân tách này của protein dựa trên điểm đẳng điện, khối lượng phân tử, điện tích hoặc phối hợp các yếu tố trên. Bước 3: Chuyển protein gel lên màng lai Để các protein có thể phát hiện được kháng thể thì protein phải được chuyển từ gel lên màng lai. Phương pháp chính để chuyển các protein được gọi là phương pháp thẩm tách điện là sử dụng một dòng điện để kéo các protein từ gel lên màng PVDF hoặc màng nitrocellulose. Các protein được chuyển lên màng mà vẫn duy trì sự sắp xếp như trên bản gel. Kết quả là protein sẽ được phơi ra trên lớp mỏng bề mặt để tiến hành xác định Bước 4: Xử lý màng lai (Blocking) Do kháng thể và protein đích đều là protein, nên thường thực hiện các bước để ngăn chặn liên kết giữa màng và kháng thể được sử dụng để xác định protein mục tiêu. Việc ngăn chặn các liên kết không đặc hiệu bằng cách đặt màng vào dung dịch protein loãng albumin huyết tương bò 3-5 % (BSA) hoặc sữa bột không béo trong Tris – Buffered saline (TBS). Protein trong dung dịch loãng sẽ gắn với màng ở tất cả các vị trí mà protein đích chưa gắn vào. Do đó khi kháng thể được bổ sung vào, sẽ không còn chỗ bám trên màng ngoại trừ các vị trí liên kết đặc hiệu với protein đích. Điều này làm giảm nhiễu cơ bản trong sản phẩm cuối cùng của Western Blot, cho kết quả rõ ràng và ngoại trừ hiện tượng dương tính giả.

Bước 5: Quá trình lai và phát hiện vị trí lai Để phát hiện các protein chuyên biệt, màng được dò protein quan tâm bằng kháng thể đã biến đổi có khả năng liên kết với enzyme thông báo, enzyme này khi kết hợp với một cơ chất tương ứng sẽ thúc đẩy phản ứng hấp thụ quang và tạo màu. Quá trình này diễn ra gồm 2 bước: - Màng lai đã cố định protein được lai với kháng thể sơ cấp. Kháng thể sơ cấp là một kháng thể đặc hiệu được tao ra khi cho vật chủ hay môi trường nuôi cấy tế bào miễn dịch tiếp xúc với protein quan tâm. - Sau khi rửa màng để loại bỏ kháng thể sơ cấp chưa liên kết, màng tiếp tục gắn kháng thể thứ hai (kháng thể thứ cấp) có gắn enzyme (thường sử dụng horseradish peroxidase). Tiếp tục ủ màng lai trong một hỗn hợp phản ứng đặc hiệu với enzyme. Đặt 1 tấm phim ngạy cảm với tia X lên màng lai để phát hiện các điểm sáng phát ra do enzyme. Có thể sử dụng nhiều phương pháp để phát hiện kháng thể thứ cấp: sử dụng bức xạ hồng ngoại gần liên kết với kháng thể gắn chất huỳnh quang, sử dụng đánh dấu phóng xạ 3. Ứng dụng:

Xác định sự hoạt động của gel thông qua sự có mặt của protein trong mô
Nhận dạng protein mục tiêu
Đánh giá tính chuyên biệt của kháng thể
Phân tích bệnh do vi khuẩn và virus gây ra: thử nghiệm khẳng định HIV, viêm gan B
xét nghiệm chẩn đoán chính xác các bệnh ký sinh trùng trên người.

ung-dung-trong-y-hoc

Ứng dụng công nghệ sinh học trong Y Dược

Thế giới đang bước vào thời đại khoa học công nghệ với mục tiêu nâng cao chất lượng cuộc sống, trong đó sức khỏe là lĩnh vực quan trọng nhất. Các công trình nghiên cứu khoa học - công nghệ sinh học trong Y Dược học trong thời gian gần đây đã góp phần đưa y học Việt Nam sánh tầm thế giới. 1 . Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong chẩn đoán bất thường phôi thai, bệnh di truyền, bệnh ung thư Các bất thường trên gene gây các bệnh nguy hiểm trong lúc mang thai. Bệnh di truyền và bệnh ung thư đã được chẩn đoán chính xác nhờ các kỹ thuật sinh học phân tử. Một số kỹ thuật gồm khuếch đại gene, giải trình tự gene, phân tích sự đa hình, phân tích nhiễm sắc thể, ... Các bệnh thường gặp gồm: bệnh Thalassemia, hội chứng Down, bệnh Hemophilia, đột biến ở các gene AZF gây hiếm muộn ở nam do mất khả năng sản sinh tinh trùng, đột biến ở gene egfr và kras dẫn đến sự kháng thuốc ở bệnh nhân ung thư dạ dày – tá tràng. Việc chẩn đoán này đã giúp hạn...

Kỹ thuật AFLP (chỉ thị phân tử)

Kỹ thuật AFLP AFLP được định nghĩa là sự đa hình các đoạn cắt khuếch đại, là kỹ thuật kết hợp giữa RFLP và PCR. AFLP sử dụng enzyme cắt giới hạn cắt DNA bộ gen, sử dụng những phân đoạn DNA làm khuôn cho phản ứng khuếch đại PCR. AFLP có thể dùng để phân biệt các cá thể rất gần nhau, thậm chí ngay cả những dòng đẳng gen. Sự khác nhau trong chiều dài các đoạn khuếch đại có thể do những thay đổi của các base trong vùng trình tự mồi, hoặc thêm, mất đoạn ở giữa hai vị trí cắt. Nguyên lý: RE sử dụng trong AFLP là một cặp enzyme, một enzyme cắt thường xuyên (tạo ra những trình tự nhỏ) và một enzyme cắt không thường xuyên Cặp enzyme thường được dùng nhất là EcoRI – MseI. Sau khi cắt bằng cặp enzyme này, một trình tự nối mạch đôi (adaptor) sẽ được gắn vào hai đầu đoạn DNA cắt bằng enzyme ligase. Đoạn adaptor gồm 2 phần: phần trình tự lõi và phần trình tự đặc hiệu cho vị trí cắt enzyme. Mồi của phản ứng PCR được thiết kế dựa trên trình tự adaptor và chứa một...

Từ khóa » Nguyên Lý Kỹ Thuật Western Blot

Tìm Hiểu Thêm Về Kĩ Thuật Western Blot - Đông Y Vạn An