Phương Pháp Western Blot - BioMedia Vietnam Group

BioMedia

nguồn ảnh: http://proteomics.case.edu/proteomics/westernblot.html

Phương pháp Western blot (hay còn được gọi là protein immunoblot) là một kỹ thuật phân tích được sử dụng rộng rãi nhằm phát hiện các proteins chuyên biệt trên các mẫu mô hay dịch chiết xuất mô. Phương pháp này sử dụng điện di trên gel để phân tách các protein còn nguyên vẹn bằng cấu trúc 3-D hay protein đã biến tính theo độ dài của mạch polypeptide. Protein này sau đó sẽ được chuyển lên màng (thường sử dụng là màng nitrocellulose hay màng PVDF), ở đó chúng được gắn bằng các kháng thể đặc hiệu với protein đích. Điện di trên gel được đưa vào hệ thống phân tích Western Blot nhằm giải quyết vấn đề của các phản ứng chéo giữa các kháng thể.

Nhiều công ty hóa chất chuyên cung cấp các kháng thể (cả kháng thể đơn dòng và kháng thể đa dòng) tương ứng vời hàng ngàn protein khác nhau. Các kháng thể thương mại thường có giá thành cao, mặc dù kháng thể không liên kết có thể tái sử dụng giữa các thí nghiệm. Phương pháp này được sử dụng nhiều trong các lĩnh vực của sinh học phân tử, miễn dịch gen và các ngành sinh học phân tử khác. Một số công cụ tìm kiếm, như là CiteAb, Antibodypedia, và SeekProducts, có thể được sử dụng để giúp các nhà nghiên cứu tìm kiếm những kháng thể thích hợp để sử dụng trong phương pháp Western Blot.

Những phương pháp liên quan khác bao gồm phương pháp lai phân tử (dot blot), hóa mô miễn dịch và hóa tế bào miễn dịch, ở đó các kháng thể được sử dụng để phát hiện các protein trên mô và tế bào bằng cách nhuộm miễn dịch, và hấp thụ miễn dịch lên liên kết enzyme (ELISA).

Các bước thực hiện

Chuẩn bị mô

Nên lấy mẫu từ toàn bộ mô hay canh trường (môi trường nuôi cấy) tế bào. Đầu tiên, xử lý mô rắn bằng phương pháp cơ học như sử dụng máy nghiền (khi lượng mẫu lớn), sử dụng máy đồng hóa (máy nghiền đồng thể) hoặc siêu âm (với số lượng mẫu nhỏ). Cũng có thể phá hủy tế bào bằng một trong các phương pháp hóa học như trên. Tuy nhiên, những mẫu virus hay mẫu lấy từ môi trường cũng có thể là nguồn protein xác định được trong Western Blot, không bắt buộc phải là nghiên cứu tế bào.

Có thể sử dụng các loại chất tẩy rửa, muối, và đệm để thúc đẩy ly giải tế bào và hòa tan protein. Thường bổ sung các chất kìm hãm protease và phosphatase để ngăn chặn sự phá hủy mẫu bằng chính các enzyme có trong mẫu. Nên tiến hành chuẩn bị mô ở nhiệt độ thấp để tránh hiện tượng biến tính protein và suy giảm (mất chức năng).

Phối hợp kỹ thuật hóa sinh và cơ học – bao gồm nhiều phương pháp lọc và ly tâm – có thể được sử dụng để phân tách các thành phần tế bào và các bào quan khác nhau

Điện di trên gel

Điện di trên gel để phân tách các protein trong mẫu. Sự phân tách này của protein dựa trên điểm đẳng điện(pI), khối lượng phân tử, điện tích, hoặc phối hợp các yếu tố trên. Đặc điểm (bản chất) của quá trình phân tách phụ thuộc vào cách xử lý mẫu và đặc điểm của bản gel. Đây là một cách rất hữu ích (hiệu quả) để xác định protein.

Cho tới nay, phương pháp điện di được sử dụng phổ biến nhất là điện di trên gel polyacrylamide và có bổ sung sodium dodecyl sulfate (SDS). Phương pháp SDS-PAGE (điện di trên gel polyacrylamide có bổ sung SDS) giữ các polypeptide ở trạng thái biến tính sau khi chúng được xử lý với chất khử mạnh và mất đi cấu trúc bậc hai, cấu trúc bậc 3 (ví dụ, cầu disulfide [S-S] tạo nên các nhóm sulfhydryl [SH và SH]) và do đó các protein được phân tách dựa trên khối lượng phân tử. Protein trong mẫu mang điện tích âm do SDS sẽ dịch chuyển tới cực dương thông qua mạng acrylamide của bản gel (di chuyển qua mạng lưới acrylamide tới cực dương). Các protein nhỏ hơn di chuyển nhanh hơn qua màng và do đó chúng được phân tách theo khối lượng (thường sử dụng đơn vị kilodaltons, kDa). Nồng độ acrylamide xác định khả năng phân tách của gel – nồng độ càng cao thì phân tách càng tốt các protein có khối lượng phân tử nhỏ. Nồng độ acrylamide càng thấp, thì phân tách càng tốt hơn các protein có khối lượng phân tử lớn hơn. Protein di chuyển theo một hướng dọc bản gel trong hầu hết các màng lai. (Tìm hiểu thêm về phương pháp SDS- PAGE tại đây).

Các mẫu được nạp vào trong các giếng của bản gel. Thường để lại một giếng để cho chỉ thị (marker) hoặc thang chuẩn (ladder), là một sản phẩm thương mại có chứa hỗn hợp các protein với khối lượng phân tử xác định, được nhuộm để có thể tạo ra băng màu và nhìn thấy được. Khi điện thế được thiết lập trên gel, protein bắt đầu di chuyển với các tốc độ khác nhau phụ thuộc vào khối lượng phân tử của chúng. Vận tốc di chuyển khác nhau của các protein (sự khác biệt về độ di động điện di) sẽ tạo thành vạch khác nhau trên mỗi giếng.

Cũng có thể sử dụng gel hai chiều (two-dimensional (2-D) gel) để phân tách protein từ một mẫu duy nhất theo hai chiều. Theo chiều thứ nhất, protein được phân tách dựa trên điểm đẳng điện (pH tại đó protein mang điện tích trung tính), và chiều thứ hai theo khối lượng phân tử của protein.

Chuyển lên màng lai

Để protein có thể liên kết được với các kháng thể đặc hiệu, gel phải được chuyển lên màng nitrocellulose hay polyvinylidene difluoride (PVDF). Phương pháp chính để chuyển các protein được gọi là phương pháp thẩm tách điện và sử dụng một dòng điện để kéo các protein từ gel lên màng PVDF hoặc màng nitrocellulose. Các protein được di chuyển từ gel lên màng mà vẫn duy trì sự sắp xếp như trên bản gel. Một phương pháp khác (cũ) trong sự dịch chuyển protein bao gồm việc đặt màng lên trên mặt bản gel, rồi đặt tiếp một tấm giấy lọc lên trên. Đặt giấy lọc cả trong dung dịch đệm, dung dịch đệm có thể thấm lên giấy lọc bằng lực mao dẫn, và mang theo cả protein. Trên thực tế, phương pháp này không được sử dụng vì tốn nhiều thời gian, thẩm tách điện thường được sử dụng nhiều hơn.

Kết quả của một trong hai quá trình “lai thấm” (thẩm tách miễn dịch) là protein sẽ được phơi ra trên lớp bề mặt (bề mặt lớp mỏng) để tiến hành phát hiện (sẽ được trình bày bên dưới). Cả hai loại màng được chọn bởi đặc tính liên kết không đặc hiệu với protein (ví dụ, khả năng liên kết với tất cả các protein là đương đương). Liên kết protein dựa trên tương tác kị nước, cũng như tương tác điện tích giữa màng và protein. Màng nitrocellulose rẻ hơn màng PVDF, nhưng mỏng hơn và không bền nếu tái sử dụng.

Có thể kiểm tra sự đồng nhất và hiệu quả cuối cùng của quá trình chuyển protein từ gel lên màng bằng cách nhuộm màng với chất nhuộm Coomassie Brilliant Blue hoặc Ponceau S. Ponceau S thường được sử dụng nhiều hơn bởi nó có độ nhạy cao và tính tan trong nước, làm cho chất nhuộm dễ bị rửa trôi và dò màng như sẽ được mô tả ở phần sau.

Blocking

Từ khi màng được chọn có khả năng liên kết với protein, cả kháng thể và protein đích đều là protein, nên cần thực hiện các bước để ngăn chặn liên kết giữa màng và kháng thể được sử dụng để xác nhận protein mục tiêu. Ngăn chặn các liên kết không đặc hiệu bằng cách đặt màng vào dung dịch protein loãng- điển hình là albumin huyết tương bò 3-5% (BSA) hoặc sữa gầy (cả hai đều có giá thành thấp) trong Tris-Buffered Saline (TBS) hoặc I-Block, với phần trăm chất tẩy rửa nhỏ (0.1%) như Tween 20 hoặc Triton X-100. Protein trong dung dịch loãng sẽ khóa tất cả các vị trí mà protein đích chưa gắn trên màng. Do đó, khi bổ sung kháng thể, nó sẽ không thể gắn không đặc hiệu ngoài việc gắn với protein đích. Điều này làm giảm cơ bản sự nhiễu trong quá trình Western Blot, cho kết quả rõ ràng và loại trừ hiện tượng dương tính giả.

Sự phát hiện

Trong quá trình phát hiện, màng có khả năng liên kết với enzyme thông báo; enzyme này khi tác dụng với một cơ chất tương ứng, sẽ thúc đẩy phản ứng phát quang và tạo màu. Vì nhiều nguyên nhân, điều này thường diễn ra trong một quá trình gồm hai bước, mặc dù hiện nay phương pháp phát hiện một bước vẫn được áp dụng cho những ứng dụng nhất định.

Hai bước

• Kháng thể sơ cấp

Kháng thể sơ cấp được tạo ra khi cho vật chủ hay canh trường tế bào miễn dịch (môi trường nuôi cấy tế bào miễn dịch) tiếp xúc với protein quan tâm (hoặc một phần của nó). Thông thường, đây là một phần trong đáp ứng miễn dịch, kháng thể thu nhận và sử dụng như một công cụ xác định đặc hiệu mà có thể liên kết trực tiếp với protein.

Sau khi phong bế (blocking), ủ dung dịch loãng của kháng thể sơ cấp (thường sử dụng nồng độ giữa 0.5 và 5 micrograms/mL) với màng và lắc nhẹ nhàng. Thông thường, dung dịch này bao gồm dung dịch muối đệm với một lượng nhỏ chất tẩy rửa và thỉnh thoảng cũng có thêm sữa bột hoặc BSA. Dung dịch kháng thể và màng có thể được giữ và ủ lại với nhau ở cùng một nơi trong khoảng 30 phút tới qua đêm. Cũng có thể được ủ ở các nhiệt độ khác nhau, với nhiệt độ càng cao càng kích thích liên kết, cả liên kết đặc hiệu (đối với protein đích, “tín hiệu”) và protein không đặc hiệu (“nhiễu”).

• Kháng thể thứ cấp

Sau khi rửa màng để loại bỏ kháng thể sơ cấp chưa liên kết, màng tiếp tục được gắn kháng thể thứ hai (thứ cấp), được bám trực tiếp vào phần đặc hiệu theo loài của kháng thể sơ cấp. Các kháng thể có nguồn gốc động vật (hoặc canh trường hybridoma nguồn gốc động vật); kháng chuột thứ cấp sẽ liên kết với hầu hết các kháng thể sơ cấp bất kỳ nào có nguồn gốc từ chuột, điều này cho phép tiết kiệm chi phí cho toàn bộ phòng thí nghiệm bởi cso thể dùng chung một nguồn kháng thể trong sản xuất kháng thể hàng loạt, và cung cấp kết quả ổn định theo thời gian. Kháng thể này được biết đến như là kháng thể thứ cấp, và do đó nó có đặc điểm hướng đích, có xu hướng được gọi là “kháng- chuột” “kháng-dê,” vv. Kháng thể thứ cấp thường được liên kết với biotin hoặc enzyme chỉ thị như alkaline phosphatase hay horseradish peroxidase. Điều này có nghĩa là nhiều kháng thể thứ cấp sẽ liên kết với một kháng thể sơ cấp và khuếch đại tín hiệu.

Phổ biến nhất là sử dụng kháng thể thứ cấp gắn horseradish peroxidase để tách tác nhân phát quang hóa học, và sản phẩm phản ứng phát ra huỳnh quang tỷ lệ với lượng protein. Một tấm film có độ nhạy cao của film chụp ảnh được đặt vào màng, và tiếp xúc với ánh sáng từ phản ứng tạo ảnh của kháng thể liên kết lai (blot). Chi phí của phương pháp này thấp hơn tuy nhiên ít nhạy hơn khi sử dụng phương pháp nhuộm 4-chloronaphthol với 1% hydrogen peroxide; phản ứng của các gốc peroxide với 4-chloronaphthol tạo ra một vệt tím sẫm có thể chụp được ảnh mà không cần sử dụng film chụp ảnh chuyên dụng.

Như với quy trình ELISPOT và ELISA , enzyme phản ứng với cơ chất của một phân tử sẽ được chuyển đổi tạo sản phẩm phản ứng tạo màu có thể phát hiện trên màng (quan sát hình bên với các dải màu xanh).

Một phương pháp khác để phát hiện kháng thể thứ cấp sử dụng bức xạ hồng ngoại (NIR) gần liên kết với kháng thể gắn chất huỳnh quang. Ánh sáng huỳnh quang không thay đổi được tạo ra từ sự kích thích của các chất nhuộm huỳnh quang, làm cho sự phát hiện huỳnh quang chính xác hơn và là thước đo chính xác cho sự khác nhau trong tín hiệu được tạo ra bới các kháng thể được đánh dấu liên kết với các protein trong phương pháp Western Blot. Có thể định lượng protein một cách chính xác bằng các tín hiệu được tạo ra bởi lượng protein khác nhau trên màng được đo trong trạng thái tĩnh, khi so sánh với sự phát quang hóa học, trong đó ánh sáng được đo trong trạng thái động.

Phương pháp thứ ba là sử dụng đánh dấu phóng xạ thay vì enzyme đi kèm với kháng thể thứ cấp, như gắn một protein liên kết kháng thể như Protein A của Staphylococcus hay Streptavidin với chất đồng vị phóng xạ iot. Kể từ khi các phương pháp khác an toàn hơn, nhanh hơn và chi phí thấp hơn ra đời, phương pháp này hiện nay rất ít được sử dụng; tuy nhiên, một lợi thế của phương pháp này là độ nhạy của kỹ thuật chụp ảnh phóng xạ- tự động, cho phép định lượng protein với độ chính xác cao khi kết hợp cùng với phần mềm quang học (vd. Optiquant).

Một bước

Trong lịch sử, quá trình dò được thực hiện theo hai bước bởi tạo ra kháng thể sơ cấp và kháng thể thứ cấp trong các quá trình riêng biệt là tương đối dễ. Điều này mang lại cho nghiên cứu viên và các tổ chức nghiên cứu những lợi thế rất lớn như linh động và bổ sung bước khuếch đại trong quá trình phát hiện. Với sự ra đời của phân tích protein hiệu năng cao và giới hạn thấp của sự phát hiện, tuy nhiên, người ta vẫn quan tâm đến việc phát triển hệ thống dò tìm một bước mà cho phép quá trình diễn ra nhanh hơn và ít tốn kém hơn. Điều này cần tới kháng thể dò vừa có khả năng nhận ra protein quan tâm vừa chứa nhãn có thể xác định, đầu dò thường được biết đến như là đuôi protein. Ủ đầu dò sơ cấp với màng theo cách tương tự như với kháng thể sơ cấp trong quá trình hai bước, sau đó sẵn sàng để xác định trực tiếp sau khi rửa nhiều lần.

Phương pháp Western Blot sử dụng hệ thống phát hiện phóng xạ.

Sự phát hiện / Sự hiển thị

Sau khi rửa các đầu dò không gắn lên màng, màng lai đã sẵn sàng phát hiện đầu dò đã đánh dấu và liên kết với protein quan tâm. Trong thực tế, không phải tất cả đều biểu hiện protein chỉ trên một băng trên màng. Khối lượng gần đúng được xác định bằng cách so sánh các băng nhuộm với các chỉ thị hoặc thang chuẩn khi điện di. Quá trình cũng thường được thực hiện đối với protein cấu trúc, như actin hay tubulin, mà protein dạng này không nên thay đổi giữa các mẫu. Lượng protein mục tiêu được định mức đối với các protein cấu trúc để kiểm soát giữa các nhóm. Một giải pháp tốt hơn là sự định mức tổng số protein được hiển thị với trichloroethanol hay epicocconone. Điều này thực tế đảm bảo điều chỉnh tổng số protein trên màng trong trường hợp có sai sót hoặc quá trình chuyển lên màng không được hoàn thiện.

Xác định màu

Phương pháp xác định màu phụ thuộc vào quá trình ủ của Western Blot với cơ chất phản ứng với enzyme để chỉ thị (như peroxidase) mà liên kết với kháng thể thứ cấp. Nó sẽ chuyển đổi các thuốc nhuộm hòa tan này thành dạng không tan của màu khác kết tủa ngay tại vị trí enzyme gắn và do đó làm màng hiện màu. Quá trình hiện màu dừng lại sau khi rửa chất nhuộm tan. Đánh giá mức độ biểu hiện của protein thông qua mật độ kế (nhuộm đậm tới mức nào) hay quang phổ kế.

Xác định sự phát quang hóa học

Phương pháp xác định sự phát quang hóa học phụ thuộc vào quá trình ủ của Western Blot với cơ chất phát quang khi được tiếp xúc với chất chỉ thị gắn trên kháng thể thứ cấp. Ánh sáng phát ra thu được bằng máy chụp CCD mà có thể bắt được ảnh kỹ thuật số của màng lai hoặc bằng phim ảnh. Phương pháp sử dụng phim để phát hiện màng lai đang dần dần biến mất bởi sự phi tuyến tính của hình ảnh (định lượng không chính xác). Hình ảnh được phân tích bằng mật độ kế, đo lượng tương đối protein nhuộm và định lượng kết quả theo mật độ quang. Phần mềm mới cho phép phân tích nhiều hơn các dữ liêụ như khối lượng phân tử nếu như sử dụng đúng loại chất. Các công ty lớn thường cung cấp hệ thống hình ảnh Phát quang hóa học Analytik Jena, Syngene, UVP, Azure Biosystems, UVITEC, GE và Biorad.

Xác định phóng xạ

Phương pháp đánh dấu phòng xạ không cần cơ chất enzyme, nhưng hơn thế, phải đặt film X-quang trực tiếp trước màng lai, mà được phát triển như là phơi nó lên dấu phóng xạ và tạo vùng tối tương tứng với băng protein quan tâm (quan sát hình ảnh bên phải). Tầm quan trọng của phương pháp đánh dấu phóng xạ đang giảm dần bởi sự nguy hiểm của phóng xạ, chi phí cao, ảnh hưởng lớn đến sức khỏe và sự an toàn của người sử dụng, và thường được thay thế bằng ECL (tăng cường phát quang hóa học) là một sự lựa chọn hữu ích.

Xác định huỳnh quang

Đầu dò đánh dấu huỳnh quang được kích thích bằng ánh sáng và xác định ánh sáng phát ra bằng cảm biến quang như máy chụp CCD được trang bị bộ lọc ánh sáng tương ứng mà thu được hình ảnh kỹ thuật số của màng lai và có thể tiến hành phân tích hơn nữa về khối lượng phân tử và phân tích định lượng trên màng lai. Phương pháp đánh dấu huỳnh quang được xem xét như là phương pháp tốt nhất để định lượng nhưng độ nhạy kém hơn phương pháp phát quang hóa học.

Dò thứ cấp

Một sự khác biệt lớn giữa màng nitrocellulose và màng PVDF liên quan đến khả năng hỗ trợ “việc tách” loại các kháng thể và tái sử dụng màng cho kháng thể đầu dò tiếp theo. Trong khi có nhiều quy trình tốt thiết lập để tách loại kháng thể trên màng nitrocellulose, sự bền vững hơn của màng PVDF cho phép sự tách loại dễ dàng hơn, và tái sử dụng được nhiều hơn trước khi thí nghiệm bị giới hạn bởi sự nhiễu trên nền. Một điểm khác biệt nữa là không giống như màng nitrocellulose, màng PVDF phải được lắc trong ethanol 95%, isopropanol hay methanol trước khi sử dụng. Màng PVDF thường có xu hướng dày hơn và khả năng chống lại các yếu tố gây hại cao hơn trong quá trình sử dụng.

Điện di trên gel 2-D

Phương pháp điện di SDS-PAGE 2- chiều sử dụng các nguyên tắc và kỹ thuật trình bày ở trên. Như tên gọi phương pháp điện di SDS-PAGE 2- chiều, liên quan đến việc di chuyển của các polypeptides theo 2 chiều. Thí dụ, theo chiều thứ nhất, các polypeptide sẽ được phân tách dựa trên điểm đẳng điện, trong khi theo chiều thứ hai, các polypeptide được phân tách dựa theo trọng lượng phân tử của chúng. Điểm đẳng điện của protein nhất định được xác định bởi số lượng tương đối các amino acid tích điện dương (thí dụ. lysine, arginine) và các amino acid tích điện âm (thí dụ. glytamate, aspartate), với các amino acid tích điện âm góp phần tạo nên điểm đẳng điện thấp và các amino acid tích điện dương góp phần tích cực tạo nên điểm đẳng điện cao. Các mẫu cũng có thể được phân tách đầu tiên trong điều kiện không rút gọn sử dụng SDS- PAGE và dưới điều kiện rút gọn ở chiều thứ hai, làm tách rời liên kết disulfide mà có vai trò giữ các tiểu đơn vị với nhau. SDS-PAGE cũng có thể kết hợp với ure – PAGE tạo nên một gel hai chiều.

Về nguyên tắc, phương pháp này cho phép phân tách tất cả các protein tế bào trên một gel lớn duy nhất. Một ưu thế lớn của phương pháp này là nó thường phân biệt sự khác nhau giữa các đồng dạng của một loại protein riêng biệt- thí dụ một protein đã được phosphoryl hóa (bằng cách bổ sung nhóm tích điện âm). Protein đã được phân tách ra có thể được cắt ra khỏi gel và sau đó được phân tích bằng phương pháp quang phổ khối để xác định potein.

Dịch và tổng hợp BioMedia VN