KỸ THUẬT NHUỘM MÁU TÌM KÝ SINH TRÙNG SỐT RÉT

KỸ THUẬT NHUỘM MÁU TÌM KÝ SINH TRÙNG SỐT RÉT

- Để phát hiện KST SR, tiêu bản máu phải được nhuộm. Phết máu được nhuộm càng sớm càng tốt vì việc nhuộm cũng giúp kéo dài thời gian bảo quản.

- Có nhiều cách nhuộm, trong đó có 2 cách nhuộm phổ biến nhất:

+ Nhuộm Wright, trong đó có sẵn chất cố định, việc nhuộm và cố định xảy ra đồng thời, do đó phết máu dày phải được làm vỡ hồng cầu trước khi nhuộm.

+ Nhuộm Giemsa, chất cố định và thuốc nhuộm được tách riêng, vì vậy, phết máu mỏng phải được cố định với Methanol tuyệt đối trước khi nhuộm.

- Ở Việt Nam, nhuộm Giemsa được dùng nhiều nhất.

1. DỤNG CỤ

- Ông đong có chia độ với nhiều loại khác nhau: 10ml, 50ml, 100ml

- Ông hút nhỏ giọt

- Cốc nhỏ 50 - 250ml

- Khay

- Giá để nhuộm tiêu bản hoặc bình nhuộm

- Giá đựng lam kính để hong khô tiêu bản

- Đồng hồ báo phút

- Quạt bàn loại nhỏ (để làm khô tiêu bản)

- Hộp đựng tiêu bản

- Kẹp.

2. HÓA CHẤT

- Thuốc nhuộm Giemsa (dung dịch Giemsa mẹ)

- Methanol

- Dung dịch đệm phosphat pH 7 - 7,2.

Giemsa được cung cấp trên thị trường ở 2 dạng: dạng bột hoặc dung dịch đã pha sẵn.

2.1. Cách pha dung dịch Giemsa mẹ từ dạng bột

- Thành phần:

- Giemsa bột

- Methanol 250ml

- Glycerin 2í0ml

- Cách pha:

Cho bột Giemsa vào trong cối với một ít Glycerin, dùng chày nghiền bột Giemsa với Glycerin cho tan hết bột thuốc nhuộm. Sau đó cho thêm từ từ Glycerin vào nghiền nhiều lần cho tan đều, cuối cùng cho Methanol vào.

Dung dịch Giemsa mẹ cần được đựng trong chai thủy tinh màu trung tính, bảo quản chỗ khô, mát và không có ánh sáng. Khi dùng pha loãng dung dịch Giemsa mẹ theo nồng độ quy định.

2.2. Dung dịch đệm

- Nước trung tính hoặc hơi kiềm (pH khoảng 7 - 7,2).

- Dung dịch đệm (dung dịch phosphat, pH = 7,2) gồm có:

Thời hạn sử dụng dung dịch đệm là vài tuần. Khi nào thấy có cặn thì bỏ.

3. KỸ THUẬT NHUỘM TIÊU BẢN

3.1. Chuẩn bị tiêu bản

a) Làn máu mỏng

Trước khi nhuộm phải cố định bằng Methanol. Nhúng lam máu vào bình có Methanol hoặc dùng ống hút

nhỏ Methanol để phủ kín làn máu mỏng, để tiêu bản khô. b) Giọt máu dày

Trước khi nhuộm phải phá vỡ hồng cầu, loại bỏ huyết sắc tố bằng dung dịch nhược trương vừa phải đủ để phá vỡ hồng cầu nhưng phải giữ nguyên KST SR. Dung dịch tẩy thường là dung dịch Giemsa pha loãng 1%, dung dịch đệm hay nước cất.

Phủ dung dịch nhược trương lên giọt máu dày, quan sát tới khi màu hồng của máu trôi đi, để lại trên tiêu bản 1 giọt máu màu vàng nhạt là được.

3.2. Quy trình nhuộm tiêu bản

a) Nhuộm thường quy

1 Đặt giá nhuộm trên khay nhuộm, để khay ở chỗ phẳng, sau đó đặt lam máu lên giá nhuộm, mặt có máu lên trên.

2 Pha dung dịch nhuộm Giemsa 3%: 3ml Giemsa mẹ + 97ml dung dịch đệm.

3 Phủ kín dung dịch nhuộm lên giọt máu.

4 Thời gian nhuộm là 30 - 45 phút.

5 Rửa tiêu bản bằng nước cất hoặc nước trung tính: nhúng sâu tiêu bản đã nhuộm vào khay nước rửa, lấy tiêu bản ra nhẹ nhàng. Rửa như vậy vài lần, đến khi nước rửa trong.

6 Cắm tiêu bản vào giá để hong khô tự nhiên, mặt máu quay xuống dưới để tránh bụi.

7 Chỉ khi nào tiêu bản thật khô mới soi dưới kính hiển vi hoặc cất bảo quản trong hộp đựng tiêu bản, muốn tiêu bản khô nhanh dùng quạt, không dùng nhiệt độ.

Lưu ý khi rửa tiêu bản:

- Không nên hất đổ dung dịch nhuộm đi rồi mới nhúng tiêu bản vào khay rửa, như vậy cặn thuốc nhuộm có thể bám lên tiêu bản.

- Tránh rửa tiêu bản giọt máu dày dưới vòi nước, vì có thể làm bong giọt máu.

b) Nhuộm nhanh

- Quy trình nhuộm giống như trên, nhưng pha dung dịch nhuộm Giemsa 10%: 10ml Giemsa mẹ + 90ml dung dịch đệm.

- Thời gian nhuộm là 5 - 10 phút.

Có thể nhuộm tiêu bản trong bình nhuộm:

- Đổ đầy dung dịch nhuộm vào bình.

- Xếp tiêu bản máu đã cố định (giọt máu mỏng) hoặc đã làm vỡ hồng cầu (giọt máu dày) vào bình để nhuộm.

4. NHẬN XÉT TIÊU BẢN NHUỘM TỐT

Tiêu bản nhuộm tốt, khi xem dưới kính hiển vi thấy như sau:

- Tiêu bản sạch, không cặn, không bụi.

- Hồng cầu bắt màu xanh tím hoặc xanh da trời, hoặc có màu hồng nhạt. Nếu có hồng cầu bị nhiễm KST SR, thấy có những hạt sắc tố và hạt đặc hiệu (hạt Schuffner, hạt Maurer).

- Bạch cầu đơn nhân có màu xanh tím.

- Tế bào chất của bạch cầu lympho có màu xanh lơ nhạt.

- Bạch cầu ái toan có những hạt màu đồng đỏ rõ.

- Bạch cầu đa nhân trung tính có những hạt to nhỏ, không đều, màu xanh lơ tới đỏ.

- KST SR có hình thể rõ ràng: nhân thường bắt màu đỏ sẫm hoặc đỏ tía, tế bào chất bắt màu xanh lơ, hạt sắc tố của ký sinh trùng bắt màu tím sẫm hoặc màu nâu đen.

5. BẢO QUẢN TIÊU BẢN

Tiêu bản nếu lưu lại lâu dài cần bảo quản tốt. Khi soi KST SR xong phải lau sạch dầu trên tiêu bản bằng cách úp tiêu bản lên giấy thấm để loại bớt dầu, sau đó nhỏ 1 - 2 giọt xylen lên phía trên giọt máu rồi dùng khăn vải mềm, mỏng, sạch, lau nhẹ cho sạch. Tiêu bản để chỗ không có ánh sáng, tốt nhất là để trong hộp gỗ.

CÂU HỎI LƯỢNG GIÁ

1. Anh (chị) hãy liệt kê những dụng cụ cần để nhuộm tiêu bản máu bằng Giemsa.

2. Mô tả quy trình nhuộm Giemsa tiêu bản máu mỏng và dày.

3. Anh (chị) cho biết yếu tố nào làm cho tiêu bản nhuộm được đẹp, thấy rõ các chi tiết của KST SR.

4. Nêu tiêu chuẩn của một tiêu bản nhuộm đẹp.

Nhuộm tiêu bản giọt máu mỏng

Stt	Thao tác	Yêu cầu phải đạt
1	Chuẩn bị dụng cụ và hóa chất để nhuôm tiêu bản máu.	Dụng cụ và hóa chất đầy đủ để nhuộm tiêu bản giọt máu dày.
2	Cố định tiêu bản máu bằng cồn Methanol.	Nhúng trọn phần máu trải, không để lan ra giọt máu dày.
3	Pha dung dịch nhuộm.	Pha đúng công thức.
4	Nhuộm tiêu bản: - Đặt tiêu bản lên giá nhuộm hoặc vào bình nhuộm. - Phủ dung dịch Giemsa đã pha loãng lên giọt máu.	- Tiêu bản phải nằm bằng phẳng trên giá, không nghiêng. - Thuốc nhuộm phủ kín giọt máu, không tràn ra, chảy xuống khay.
5	Thời gian nhuộm.	Đúng quy định.
6	Rửa tiêu bảnbằng nước trung tính, hoặc nước cất/ nước máy.	Sạch cặn, không có váng kim loại.
7	Để tiêu bản khô trên giá đỡ.	Giọt máu khô tự nhiên, không bị trầy sướt.

Nhuộm tiêu bản giọt máu dày

Stt	Thao tác	Yêu cầu phải đạt
1	Chuẩn bị dụng cụ và hóa chất để nhuộm tiêu bản máu.	Dụng cụ và hóa chất đầy đủ để nhuộm tiêu bản giọt máu dày.
2	Pha dung dịch tẩy phá vỡ hồng cầu.	Pha đúng công thức.
3	Tẩy phá vỡ hồng cầu.	Tiêu bản máu sau khi bị phá vỡ hồng cầu có màu trắng hơi đục hoặc có màu vàng nhạt.
4	Pha dung dịch nhuộm.	Pha đúng công thức.
5	Nhuộm tiêu bản: - Đặt tiêu bản lên giá nhuộm hoặc vào bình nhuộm. - Phủ dung dịch Giemsa đã pha loãng lên giọt máu.	- Tiêu bản phải nằm bằng phẳng trên giá, không nghiêng. - Thuốc nhuộm phủ kín giọt máu, không tràn ra, chảy xuống khay.
6	Thời gian nhuộm.	Đúng quy định.
7	Rửa tiêu bản bằng nước trung tính, hoặc nước cất/ nước máy.	Sạch cặn, không có váng kim loại.
8	Để tiêu bản khô trên giá đỡ.	Giọt máu khô tự nhiên, không bị bong tróc hoặc trầy sướt.