Nền Tảng, Vật Liệu, Kỹ Thuật Và Cách Sử Dụng Vết Bẩn Của Wright

các Vết bẩn của Wrigth là một kỹ thuật tô màu được tạo ra bởi nhà nghiên cứu bệnh học người Mỹ James Homer Wright vào năm 1902, từ vết bẩn của Romanowsky. Vì vết bẩn của Romanowsky không ổn định, Wrigth kết hợp metanol làm dung môi và cố định.

Màu này là đa sắc, có nghĩa là nó tạo ra một số màu tùy thuộc vào cấu trúc mà thuốc nhuộm hấp thụ. Kỹ thuật nhuộm này đã được sử dụng rộng rãi để thực hiện số lượng tế bào bạch cầu khác biệt và nghiên cứu hình thái của các tế bào hồng cầu, tiểu cầu và bạch cầu trong máu ngoại vi và tủy xương..

Ứng dụng của nó rất quan trọng, vì những bất thường có thể được nhìn thấy trong các dòng tế bào khác nhau của máu, tạo điều kiện cho việc chẩn đoán các bệnh như bệnh bạch cầu hoặc nhiễm trùng do vi khuẩn hoặc ký sinh trùng.

Có lẽ đây là những ứng dụng phổ biến nhất trong đó kỹ thuật này được sử dụng, tuy nhiên chúng không phải là những ứng dụng duy nhất. Nó cũng hữu ích trong các mẫu khác ngoài máu và tủy xương, chẳng hạn như các mẫu nước mũi, chất nhầy trong phân, đờm, da, trong số những người khác..

Chỉ số

• 1 nền tảng của vết bẩn của Wright
• 2 Vật liệu
  • Chuẩn bị 2.1
  • 2.2 Dung dịch đệm
  • 2.3 Vật liệu bổ sung cần thiết để thực hiện tô màu
• 3 thành phần của vết bẩn của Wright
  • 3.1 Metanol
  • 3.2 Bộ giảm xóc
  • 3,3 Eosin (Y)
  • 3,4 xanh methylen
• 4 Kỹ thuật
• 5 tiện ích
  • 5.1 Huyết học
  • 5.2 Tiết mũi
  • 5.3 Ký sinh trùng
  • 5.4 Nhiễm trùng hô hấp
  • 5.5 Vi khuẩn học
  • 5.6 Mycology
• 6 Cấu trúc của mẫu máu được quan sát với vết bẩn của Wright như thế nào??
• 7 khuyến nghị cho nhuộm tốt
• 8 lỗi phổ biến trong tô màu Wrigth
  • 8.1 nhuộm rất nhạt
  • 8.2 Kết tủa chất tạo màu
  • 8.3 Smear với màu cực kỳ đỏ hoặc xanh
• 9 Chế độ lưu trữ
• 10 tài liệu tham khảo

Nền tảng vết bẩn của Wright

Vết bẩn của Wright được sinh ra từ vết bẩn của Romanowsky, bao gồm dung dịch rượu methyl từ thuốc nhuộm axit (eosin Y) và chất cơ bản (xanh methylen) và các sản phẩm oxy hóa của nó.

Hỗn hợp thuốc nhuộm được sử dụng trong vết bẩn của Wright gây ra hiệu ứng được gọi là Romanowsky, nghĩa là, nó cung cấp một màu tím đẹp cho hạt nhân của bạch cầu và các hạt bạch cầu trung tính, trong khi các tế bào hồng cầu được nhuộm màu hồng..

Các thành phần chịu trách nhiệm cho dải màu đặc trưng của vết bẩn của Wright là màu xanh B và eosin Y. Hiệu ứng quan sát được sẽ phụ thuộc vào sự liên kết của thuốc nhuộm với cấu trúc hóa học và sự tương tác của màu xanh B và eosin Y.

Các cấu trúc axit như axit nucleic, protein hạt nhân và tế bào chất chưa trưởng thành phản ứng của một số loại tế bào, cố định màu xanh B (thuốc nhuộm cơ bản).

Trong khi các cấu trúc cơ bản như hemoglobin, các hạt của bạch cầu ái toan phân đoạn, trong số các cấu trúc tế bào khác, cố định eosin Y (thuốc nhuộm axit).

Kết quả nhuộm màu có thể bị ảnh hưởng bởi các yếu tố khác nhau, chẳng hạn như độ pH của thuốc nhuộm Wright, dung dịch đệm và dung dịch rửa; cũng như thời gian nhuộm và sửa.

Do đó, mỗi bước chuẩn bị thuốc thử là rất quan trọng và phải được thực hiện cẩn thận đến từng chi tiết.

Vật liệu

Wright tô màu. Đối với 100 mL, nó là bắt buộc:

Cân 0,3 gr thuốc nhuộm Wright, đo 97 ml metanol và 3 ml glycerol.

Chuẩn bị

Trong một cái cối, đặt một lượng lớn thuốc nhuộm của Wright và từ từ thêm glycerol cho đến khi bột được hòa tan hoàn toàn..

Sau đó, metanol được thêm vào, trộn và đổ vào chai màu hổ phách.

Trước khi sử dụng dung dịch nên được lắc với các chuyển động và bộ lọc nhẹ nhàng.

Bộ đệm

Trong một lít nước cất, 3,76 g disodium hydrophosphate (Na2HPO4   2 giờ20) cộng với 2,1 gr kali dihydrogen phosphate (KH)2PO4).

Trộn thật kỹ cho đến khi tất cả các thuốc thử kết hợp được hòa tan. Điều chỉnh pH đến 7,2. Đổ vào lọ thủy tinh và giữ ở nhiệt độ phòng.

Vật liệu bổ sung cần thiết để thực hiện tô màu

Ngoài ra, các vật liệu khác được yêu cầu để thực hiện kỹ thuật tô màu, đó là: tấm mang vật hoặc che vật, cầu màu, pisetas với nước hoặc đệm để rửa, đồng hồ bấm giờ để lấy thời gian tô màu và một số vật liệu sấy (giấy thấm, gạc hoặc bông).

Thành phần vết bẩn Wright

Metanol

Rượu (methanol) phục vụ như là một cố định của phết máu vào slide.

Về cơ bản nó là một thuốc thử khử, khử nước và chất cố định đông máu. Do đó, chức năng của nó là làm đông tụ các protein và làm cho chúng không hòa tan, nhưng không làm biến tính chúng.

Methanol là thuốc thử được sử dụng rộng rãi nhất để khắc phục vết bẩn trong tất cả các phòng thí nghiệm, vì nó mang lại kết quả tốt hơn so với các chất thu được bằng ethanol. Nồng độ lý tưởng là 99%.

Bộ giảm xóc

Bộ đệm (dung dịch đệm) có chức năng điều chỉnh hoặc duy trì độ pH của thuốc nhuộm, vì độ pH được điều chỉnh thành 7.2 là điều cần thiết để cấu trúc tế bào hấp thụ thuốc nhuộm đúng cách.

Mặt khác, quá trình cố định metanol làm mất nước các tế bào và bộ đệm giúp bù nước cho chúng.

Eosin (Y)

Eosin có ái lực với các thành phần cơ bản vì nó là thuốc nhuộm axit. Hai loại eosin rất giống nhau, do đó, một trong hai loại có thể được sử dụng, thu được kết quả như nhau.

Một loại được gọi là eosin Y, eosin vàng hoặc tetrabromofluorescein và eosin B khác, erythrosin B hoặc dibromodinitrofluorescein. Tuy nhiên, eosin Y được sử dụng phổ biến nhất.

Tính chất quan trọng nhất của thuốc nhuộm này là sự phân cực âm của nó, điều này làm cho nó bị thu hút bởi các cấu trúc tế bào có điện tích dương.

Xanh methylen

Đây là màu cơ bản. Đặc tính chính của nó là metachromasia, nghĩa là không phải tất cả các cấu trúc sẽ được nhuộm cùng màu, nó phụ thuộc vào thành phần hóa học của các cấu trúc mà nó được tô màu.

Một số sẽ chuyển sang màu sáng hoặc xanh đậm và một số khác màu tím đậm hoặc nhạt.

Kỹ thuật

1-Tiến hành trải đều mẫu sao cho vẫn còn một lớp màng mỏng, trên phiến kính hoặc lớp phủ.

2-Để không khí khô trong khoảng 2 giờ.

3-Đặt vết bẩn khô lên cầu nhuộm hoặc khay nhuộm với mẫu trải đều lên trên.

4-Che tấm bằng thuốc nhuộm Wright từng giọt cho đến khi nó phủ toàn bộ bề mặt. Để trong 5 - 8 phút.

5-Thuốc nhuộm phải che phủ hoàn toàn máng trượt, không làm đổ ra các cạnh. Nếu trong thời gian tô màu nó bắt đầu bay hơi, nên đặt thêm giọt.

6-Sau đó thêm một lượng bằng nhau của giảm xóc, thổi một chút cho đến khi ánh kim loại đặc trưng xuất hiện. Mất 10 đến 15 phút.

7-Rửa bằng nước máy, đặt máy bay phản lực mềm cho đến khi tấm màu hồng.

8-Với một miếng gạc được tẩm cồn, loại bỏ thuốc nhuộm gắn vào mặt sau của slide.

9-Cho phép vết bẩn khô rất tốt trước khi đặt dầu ngâm để trực quan hóa nó trong kính hiển vi.

Tiện ích

Huyết học

Đó là lý tưởng để làm mờ vết máu ngoại vi, để kiểm tra phết máu dày và nghiên cứu các tế bào từ các mẫu tủy xương.

Do tính chất hóa học của sự kết hợp thuốc nhuộm này, các cấu trúc tế bào có thể dễ dàng được nhận ra, có thể phân biệt các loại tế bào khác nhau hiện tại.

Dịch tiết mũi

Kỹ thuật này rất hữu ích để xác định các tế bào của dịch tiết mũi (tế bào biểu mô, bạch cầu ái toan phân đoạn, đa hình) trong chẩn đoán viêm mũi dị ứng.

Ký sinh trùng

Theo nghĩa này, nó đã có ích cho nghiên cứu về Leishmania sp trong mô bào của mô tế bào dưới da trong loét da. Tương tự như vậy, nó được sử dụng để xác định bạch cầu trong mẫu phân (leucogram).

Trong trường hợp này, điều quan tâm là bác sĩ sẽ biết liệu bạch cầu có trong phân là do đa hình hay đơn nhân. Phát hiện này trong bản đồ phân sẽ hướng dẫn nếu đó là nhiễm trùng do vi khuẩn hoặc virus.

Mặt khác, ký sinh trùng lưu thông trong máu có thể được tìm thấy bên trong hồng cầu hoặc tự do trong huyết tương. Các ký sinh trùng truy nã là Plasmodium spp, Trypanosoma cruzii và filarias, và trong thú y, nó rất hữu ích trong việc tìm kiếm Theileria Equi và Babesia caballi, tác nhân gây bệnh của trẻ sơ sinh, đặc biệt là ở ngựa.

Vết bẩn của Wright và Giemsa có thể phân biệt hemoparaite với các thành phần tế bào bình thường. Đối với điều này, bạn có thể sử dụng hai loại chênh lệch:

Trải dài tốt

Máu lan ra như một lớp màng mỏng trên một slide. Nhuộm với vết bẩn của Wright, cho thấy các đặc điểm của hạt nhân và tế bào chất.

Thả dày

Phương pháp này được sử dụng để điều tra sự hiện diện của ký sinh trùng trong một lượng máu lớn hơn.

Đối với điều này, một giọt máu lớn được đặt trên một slide. Khi đó, bạn nên khử rung, tạo các vòng tròn lớn hơn và lớn hơn từ tâm ra ngoài, sử dụng cạnh của một slide khác.

Cuối cùng, để quan sát các ký sinh trùng trong vết bẩn dày, hồng cầu phải được lọc với nước.

Nhiễm trùng hô hấp

Ở cấp độ hô hấp, kỹ thuật này cũng hữu ích, bởi vì các tế bào có trong mẫu đờm, rửa phế quản hoặc phế quản, rất quan trọng để xác định chẩn đoán.

Tương tự như vậy, các tế bào đa hình và tế bào đơn nhân có thể được phân biệt ở đây.

Vi khuẩn học

Việc sử dụng kỹ thuật này trong vi khuẩn học còn hạn chế, vì nó không tốt cho việc nhuộm vi khuẩn, đó là lý do tại sao nhuộm màu của chúng, các kỹ thuật tạo màu chuyên dụng khác được sử dụng.

Tuy nhiên, nó đã được sử dụng để tìm kiếm các tế bào biểu mô với các cơ quan bao gồm Chlamydia trachomatis trong vết bẩn của niêm mạc niệu đạo hoặc nội tiết, mặc dù phải công nhận rằng nó không phải là phương pháp tốt nhất cho việc này.

Cũng có thể quan sát vi khuẩn loại xoắn ốc trong số các tế bào hồng cầu như Borrelia burgdorferi ở những bệnh nhân bị nhiễm bệnh, cũng như morulae hoặc cơ quan bao gồm Ehrlichia sp trong tế bào chất của tế bào lympho, bạch cầu đơn nhân hoặc bạch cầu trung tính trong một vệt máu.

Bệnh học

các Histoplasma capsulatum là một loại nấm gây bệnh thường được chẩn đoán bằng cách quan sát bằng kính hiển vi các mẫu mô khác nhau, nhuộm màu với vết bẩn của Wright.

Cấu trúc của mẫu máu được quan sát như thế nào với vết bẩn của Wright?

Khuyến nghị nhuộm màu tốt

Mở rộng các mẫu máu nên được sấy khô tự nhiên. Các vết bẩn phải càng mỏng càng tốt để có được sự cố định tốt hơn của thuốc nhuộm và tránh quá nhiệt.

Để nhuộm chất lượng cao, nên thực hiện nhuộm trong hai giờ sau khi chuẩn bị phết. Mặt khác, mẫu lý tưởng là máu mao mạch, không có chất chống đông máu.

Tuy nhiên, nếu máu tĩnh mạch được sử dụng, nó nên được sử dụng như thuốc chống đông máu EDTA và không phải là heparin, vì sau này có thể làm biến dạng cấu trúc tế bào.

Để ngăn chặn sự hư hỏng của chất màu đã chuẩn bị nên được lưu trữ ở những nơi khô ráo.

Trong quá trình giặt, nên sử dụng nước được điều chỉnh độ pH trung tính.

Cuối cùng, nên thường xuyên kiểm tra các phương pháp nhuộm được sử dụng trong phòng thí nghiệm.

Điều này được thực hiện bằng cách nhuộm các mẫu hoặc các mẫu mở rộng, như một sự kiểm soát chất lượng. Bước này rất quan trọng, vì điều này đảm bảo rằng việc nhuộm màu được chuẩn bị đúng cách và thời gian tô màu được chuẩn hóa tốt.

Nếu bảng mẫu có màu xấu, thì có những vấn đề phải được giải quyết.

Những lỗi thường gặp trong tô màu Wrigth

Nhuộm rất nhạt

Vết bẩn rất nhạt, thường là do thời gian nhuộm rất ngắn hoặc rửa rất phóng đại. Nó được sửa chữa bằng cách kéo dài thời gian tiếp xúc với thuốc nhuộm hoặc giảm thời gian giặt.

Thuốc nhuộm kết tủa

Sự hiện diện của chất kết tủa thuốc nhuộm trong vết bẩn có thể có một số nguyên nhân, tuy nhiên, những nguyên nhân thường gặp nhất là: sử dụng thuốc nhuộm không được lọc, nhuộm màu trên các cây cầu màu không đều, sử dụng các tấm bẩn với bụi hoặc dầu mỡ Kết thúc nhuộm.

Smear với màu cực kỳ đỏ hoặc xanh

Bộ đệm chịu trách nhiệm cho độ pH của chất màu. Thuốc nhuộm có độ pH dưới chỉ định (axit) sẽ dẫn đến vết bẩn rất đỏ.

Nếu độ pH của thuốc nhuộm ở trên (kiềm) sẽ thu được một vệt cực kỳ xanh.

Chế độ lưu trữ

Thuốc thử nên được bảo quản ở nhiệt độ phòng.

Tài liệu tham khảo

1. Gutiérrez V. Nghiên cứu so sánh giữa phương pháp nhuộm Wright và xét nghiệm Elisa để chẩn đoán Ehrlichiosis canina tại thành phố San Pedro Sula, Honduras. Năm 2008 Luận văn bằng để áp dụng cho chức danh Bác sĩ thú y. Đại học San Carlos de Guatemala.
2. López-Jácome L, Hernández-Durán M, Colín-Castro C, Ortega-Peña S, Cerón-González G, Franco-Cendejas F. Nhuộm cơ bản trong phòng thí nghiệm vi sinh. Nghiên cứu về người khuyết tật. 2014; 3 (1): 10-18.
3. "Vết bẩn của Wright." Wikipedia, bách khoa toàn thư miễn phí. Ngày 18 tháng 5 năm 2018, 12:05 UTC. Ngày 8 tháng 12 năm 2018, 20:37
4. Calderón A, Cardona J, Vergara Ó. Tần suất của Babesia spp. ở ngựa của montería, Córdoba (Colombia). Rev. udcaactual chia sẻ bệnh nhân.  2013; 16 (2): 451-458.
5. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A (2009). Chẩn đoán vi sinh của Bailey & Scott. 12 ed. Argentina Panamericana S.A Biên tập.
6. Retamales E, Mazo V. Viện Y tế Công cộng Chính phủ Chile. Khuyến cáo nhuộm vết máu để đọc công thức máu.