Phương Pháp Giải Trình Tự Của Axit Nucleic - VOER

Phương pháp hóa học của Maxam-Gilbert

Vào năm 1977, Maxam và Gilbert lần đầu tiên phát minh ra phương pháp giải trình tự gen bằng phương pháp hóa học. Nguyên tắc của phương pháp là dựa trên phản ứng hóa học thủy giải đặc hiệu, các DNA không tự xoắn lại với nhau, tạo thành tập hợp nhiều phân đoạn có kích thước khác nhau.

Trước hết, phân tử DNA được đánh dấu đồng vị phóng xạ P32 ở đầu 5’ của mạch đơn, tạo những đoạn đánh dấu có thể phát hiện bằng hình phóng xạ. Xử lí hóa học đặc hiệu phân hủy đặc trưng một loại nucleotide của mạch DNA đã đánh dấu phóng xạ, tạo các đoạn oligonucleotide có chiều dài hơn kém nhau 1 nucleotide được phát hiện bằng điện di. Kết qủa các phản ứng hóa học xử lí mạch DNA được phát hiện bằng điện di trên gel polyacriamid có thể xác định được trình tự mạch đơn.

Mạch đơn đã đánh dấu phóng xạ có thể xử lí theo 4 nhóm phản ứng

- Nhóm phản ứng thứ nhất xử lí mạch đơn DNA bằng dimethyl sulphat làm đứt mạch tại G.

- Nhóm phản ứng thứ hai xử lí mạch đơn DNA bằng axit (pH=2) gây đứt mạch đơn tại A hoặc G.

- Nhóm phản ứng thứ ba xử lí mạch đơn DNA bằng hydrazin gây đứt mạch đơn tại T và C.

- Nhóm phản ứng thứ 4 xử lí mạch đơn DNA bằng hydrazin với nồng độ muối cao làm đứt mạch đơn tại C.

Kết quả: Các phản ứng tạo thành các đoạn DNA cắt ngẫu nhiên, có kích thước khác nhau. Điện di trên gel polyacriamid (Hình 7-5), đọc kết quả điện di bằng máy phóng xạ tự ghi ta thu được trình tự nucleotide của mạch đơn DNA.

Đoạn mạch đơn DNA đánh dấu phóng xạ P 32 size 12{ {} rSup { size 8{"32"} } } {}, đầu 5` ở nucleotide A có trình tự : 5`−P 32 size 12{ {} rSup { size 8{"32"} } } {}ACACTG

Sau khi xử lí bằng phương pháp hóa học và cắt mạch đơn nói trên ta thu được các phân đoạn sau

Tổng hợp các kết quả, ta thu được trình tự các nucleotide trên mạch đơn DNA, từ đó ta biết được trình tự sắp xếp các nucleotide của gen.