Định Lượng Vi Sinh Vật Bằng Phương Pháp đếm Khuẩn Lạc

4.1. Phương pháp đếm trực tiếpĐếm bằng buồng đếm trên kính hiển vi. Thường áp dụng để xácđịnh mật độ vi sinh vật đơn bào có kích thước lớn như nấm men,tảo…- Ưu điểm: Quy trình này cho phép xác định nhanh chóng mật độvi sinh vật chứa trong mẫu.- Nhược điểm:Không phân biệt được tế bào sống và tế bào chếtDễ nhầm lẫn tế bào vi sinh vật với các vật thể khác trong mẫuKhó đạt được độ chính xác caoKhông thích hợp với huyền phù vi sinh vật có mật độ thấp.- Các phương pháp đếm trực tiếp sau:Đếm bằng buồng đếm hồng cầuĐếm bằng buồng đếm BreedĐếm bằng kính hiển vi huỳnh quang4.2. Phương pháp đếm khuẩn lạcPhương pháp này cho phép xác định mật độ tế bào cònsống hiện diện trong mẫu.Tế bào còn sống là tế bào có khả năng phân chia tạothành khuẩn lạc trên môi trường chọn lọc.Phương pháp này cho phép định lượng chọn lọc vi sinhvật tùy môi trường và điều kiện nuôi cấy.Trong phương pháp này cần thực hiện pha loãng mẫuthành nhiều độ pha loãng bậc 10 liên tiếp nhau.Số lượng khuẩn lạc tối ưu là trong khoảng từ 25 – 250khuẩn lạc/đĩa.Quy trình thao tác như sau:- Pha loãng mẫu theo dãy thập phân- Tạo hộp trải hay hộp đổ- Ủ ở điều kiện nhiệt độ và thời gian thích hợp- Đếm khuẩn lạc và tính kết quả. Mật độ tế bào vi sinh vật trongmẫu ban đầu được tính theo công thức sau:NA (CFU/g hay CFU/ml) =Trong đó:n1Vf1 + …+ niVfiA: số tế bào vi khuẩn trong 1g hay 1ml mẫuN: tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọnni: số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ iV: thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào trong mỗi đĩafi: độ pha loãng tương ứngVí dụ: phân tích 1g mẫu được kết quả như sauPha loãng mẫu lỏngChuẩn bị và pha loãng mẫu rắn4.3. Phương pháp MPN (phương pháp tối khả)Là phương pháp đánh giá số lượng vi sinh vật theo sốlượng vi sinh vật có xác suất lớn nhất hiện diện trong 1đơn vị thể tích mẫu. Phương pháp này có thể dùng đểđịnh lượng mọi nhóm vi sinh vật có thể được nuôi cấytrong môi trường lỏng chọn lọc và cho kết quả biểu kiếnthích hợp.Là phương pháp định lượng dựa trên kết quả định tínhcủa một loạt thí nghiệm được lặp lại ở một số độ phaloãng khác nhau (Thông thường, là lặp lại 3 lần ở 3 độpha loãng bậc 10 liên tiếp, tổng cộng: 3x3=9 ốngnghiệm). Số lượng ống nghiệm lặp lại càng cao thì độchính xác của phương pháp này càng lớn.Quy trình thực hiện phương pháp này như sau:- Cho vào các ống nghiệm có chứa môi trường thích hợpcho sự tăng trưởng của đối tượng vi sinh vật cần địnhlượng một thể tích xác định dung dịch mẫu ở 3 nồng độpha loãng liên tiếp.- Ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp.- Dựa vào kết quả biểu kiến chứng minh sự tăng trưởngcủa vi sinh vật cần kiểm định trong từng ống nghiệm(phản ứng dương tính), ghi nhận số lượng ở từng độ phaloãng.- Sử dụng số liệu này dựa vào bảng Mac Crady suy ramật độ vi sinh vật được trình bày dưới dạng sốMPN/100ml hay số MPN/1g mẫu.Bảng Mac CradyCác thử nghiệm sinh hóaNgười ta có thể định danh vi sinh vật dựa vào các đặcđiểm sinh hóa đặc trưng của loài (hay nhóm) vi sinh vậtđó.Có ba cách tiếp cận để thực hiện các thử nghiệm sinhhóa dùng cho mục đích định danh là:- Cách truyền thống.- Cách sử dụng các bộ KIT.- Dùng các thiết bị tự động.Thử nghiệm khả năng lên men:Nhằm xác định khả năng sử dụng một nguồn cacbonnhất định bởi vi sinh vật để tăng trưởng.Nguồn cacbon này được chia làm 3 nhóm: đường đơn,đường đa và rượu.Khả năng lên men được đánh giá sự làm giảm pH củamôi trường dẫn đến sự thay đổi màu của chỉ thị pH trongmôi trường.Ngoài ra, CO2 được tạo thành sẽ được bẫy lại thành bọtkhí trong ống chuông Durham làm nổi ống chuông này(môi trường lỏng) hoặc làm vỡ thạch (môi trường rắn).Được dùng để định danh các vi sinh vật đường ruột.

Nội dung chính Show

• 1- Chuẩn bị môi trường
• 2 – Cách tiến hành
• Video liên quan

Khuẩn lạc của một loại vi khuẩn được định nghĩa là một cụm (Colony), có thể nhìn thấy được bằng mắt thường, sinh khối của vi khuẩn đó khi chúng phát triển trên bề mặt của một giá thể cứng.

Khuẩn lạc là gì

Đơn vị hình thành khuẩn lạc CFU (viết tắt từ chữ Colony form units)  là đơn vị được dùng để ước tính số lượng vi khuẩn hoặc tế bào nấm trong 1 mẫu thử nghiệm nhất định. Khi kiểm tra vi sinh vật trong một mẫu thử nghiệm bằng cách đếm khuẩn lạc có trên đĩa petri hoặc đĩa môi trường chuẩn bị sẵn (ví dụ đĩa Compact Dry), đơn vị thể hiện khuẩn lạc thường là CFU/mL, CFU/g, CFU/25g.

• Đơn vị CFU/g , CFU/25g thường dùng cho mẫu thử nghiệm dạng rắn (thực phẩm, nguyên liệu thực phẩm…)
• Đơn vị CFU/mL dùng cho mẫu thử nghiệm ở dạng dung dịch như mẫu nước nuôi trồng thủy sản, nước trái cây…

MPN  là viết tắt của Most Probable Number, nghĩa là số có xác xuất lớn nhất. MPN thường được dùng để biểu thị số lượng vi khuẩn có trong một thể tích nhất định của mẫu chất lỏng.

• CFU là đơn vị hình thành khuẩn lạc có trong 1 mẫu thử nghiệm nhất định. CFU thường được tính từ phương pháp đổ đĩa hoặc cấy trang trong khi đó MPN thường được tính toán bằng phương pháp lên men. Đối với CFU, vi khuẩn phát triển trên môi trường đặc (ví dụ như thạch), sau đó, các khuẩn lạc được đếm thủ công bằng mắt hoặc ứng dụng hiện đại.
• Đối với phép đo MPN, các mẫu được nuôi cấy trong môi trường lỏng, (ví dụ như lên men). Kết quả không dùng phương thức đếm mà là so sánh với bảng xác xuất.
• MPN và CFU tương đương nhau. Cả hai đều được công nhận bởi nhiều tổ chức quản lý và khoa học trên thế giới, trong đó có cả Cơ quan Bảo vệ Môi trường Hoa Kỳ (EPA) và Tổ chức Tiêu chuẩn hóa Quốc tế (ISO).

Với phương thức đếm khuẩn lạc thủ công, mỗi chấm khuẩn lạc đặc trưng cho loại vi khuẩn đích được đếm một lần. Để dễ kiểm soát quá trình đếm, người ta thường đặt đĩa petri lên một lưới ô. Sau đó đếm các khuẩn lạc trong mỗi ô và đánh dấu khuẩn lạc đếm được ở đằng sau của đĩa petri. Để đảm bảo chính xác, mỗi mẫu thử nghiệm cần được nuôi cấy ít nhất 3 đĩa và lượng khuẩn lạc thích hợp cho đếm thủ công là 30 tới 300 khuẩn lạc. Các đĩa có quá nhiều hoặc quá ít khuẩn lạc đều không thích hợp và cần pha loãng và cấy lại mẫu.

Đếm khuẩn lạc thủ công thường mất rất nhiều thời gian và có thể mắc phải sai số chủ quan của người đếm. Để cải thiện tình trạng này, hiện nay các phòng lab đã trang bị thêm các thiết bị đếm khuẩn lạc tự động. Nguyên lí cơ bản của máy đếm khuẩn lạc tự động là máy đếm khuẩn lạc sẽ chụp một ảnh của đĩa (petri hoặc đĩa compact dry), ứng dụng sau đó sẽ sử dụng một thuật toán để tách và đếm các khuẩn lạc có trên đĩa. Thuật toán cũng có thể gặp có khăn trong việc phân biệt các khuẩn lạc khi có quá nhiều khuẩn lạc chồng lấn. Trường hợp này cần môt ứng dụng có khả năng phân tích hiệu quả và mạnh mẽ. Đây cũng là thách thức của các chuyên gia trong việc phát triển ứng dụng này.

Nhằm giảm bớt thời gian và sai số khi đọc kết quả thủ công. Cùng với giải pháp đĩa môi trường chuẩn bị sẵn CompactDry™. Hãng Nissui đã phát triển ứng dụng bactLAB đếm khuẩn lạc trên smart phone đơn giản và hiệu quả.  Đây là phần mềm ứng dụng thay thế cho các máy đếm khuẩn lạc cồng kềnh trước đây. Bạn chỉ cần tải ứng dụng này trên CH PLay (trên hệ điều hành Android) hoặc hệ điều hành iOS của Apple với từ khóa "@bactlab. Tạo tài khoản trên ứng dụng bactLAB đơn giản bằng email và sử dụng.

 

Loading Preview

Sorry, preview is currently unavailable. You can download the paper by clicking the button above.

Phương pháp này có độ nhạy cao, định lượng vi sinh vật ở mật độ thấp. Có thể định lượng các vi sinh vật kích thước nhỏ, di động.

Sau đây là cách đếm khuẩn lạc:

1- Chuẩn bị môi trường

Hòa tan các thành phần môi trường trong nước, phân phối môi trường vào chai thích hợp. Khử trùng ở 121oC 1atm trong 15 phút. Trước khi kiểm tra vi sinh vật cần làm tan chảy hoàn toàn môi trường agar bằng nhiệt (bếp điện hoặc lò viba)

Môi trường nuôi cấy vi sinh

(Lưu ý: Khi môi trường agar tan được 1/3 nên lắc chai môi trường để giúp thoát khí bên trong chai. Khi lắc nên tránh để môi trường chạm vào nút bông)

2 – Cách tiến hành

Mọi việc chuẩn bị và các thao tác bằng tay cần được thực hiện với kỹ thuật vô trùng. Và dùng dụng cụ cần được vô trùng để tránh nhiễm vi sinh vật từ các nguồn bên ngoài vào mẫu.

Đối với các mẫu rắn:

Bước 1:

Cân 25g mẫu vào bình Erlen chứa 225 ml dung dịch pha loãng đã khử trùng để được độ pha loãng 10-1.

(Lưu ý: Sau khi hòa mẫu vào dung dịch pha loãng, nên đồng nhất mẫu trên máy lắc trong 20 – 30 phút trước khi tiếp tục pha loãng nồng độ 10-2)

Bước 2:

Hút 1ml dịch pha loãng ở nồng độ 10-1 lần lượt vào dãy ống nghiệm 9ml để được các nồng độ pha loãng 10-2, 10-3,10-4,…,10-n tùy theo yêu cầu.

(Lưu ý: Trước khi pha loãng nồng độ tiếp theo nên votex độ pha loãng trước đó để đồng nhất mẫu.)

Bước 3:

Hút 1ml dịch pha loãng ở từng nồng độ cho vào đĩa petri.

(Lưu ý: Nên kiểm tra ở 3 nồng độ pha loãng)

Bước 4:

Thêm vào mỗi đĩa petri khoảng 12 – 15 ml môi trường thạch ở nhiệt độ từ 44 – 47oC. Trộn đều dịch pha loãng với môi trường bằng cách xoay đĩa petri và để hỗn hợp đông đặc lại bằng cách đặt các đĩa petri trên bề mặt nằm ngang ở nơi mát.

(Lưu ý: Tránh để môi trường thạch xuất hiện bọt khí khi đổ đĩa)

Sau khi hỗn hợp đông đặc hoàn toàn, lật ngược các đĩa đã chuẩn bị và đặt vào tủ ấm ở (30 ± 1)oC. Ủ trong 48 giờ.

Sau giai đoạn ủ, giữ lại các đĩa có số khuẩn lạc từ 25 đến 300 khuẩn lạc. Khi đếm khuẩn lạc, chỉ đếm những khuẩn lạc đặc trưng cho chủng vi sinh đang quan tâm, tránh đếm nhầm bọt khí và các hạt không hòa tan trên mặt thạch.

Tính số lượng N vi sinh vật có trong mẫu thử theo trung bình khối lượng từ hai độ pha loãng liên tiếp bằng cách sử dụng Công thức:

Trong đó:

∑C là tổng số khuẩn lạc đếm được trên hai đĩa được giữ lại từ 2 độ pha loãng liên tiếp. Trong đó ít nhất một đĩa chứa tối thiểu 10 khuẩn lạc.

n là số lượng đĩa petri được lựa chọn để tính tổng số khuẩn lạc

V là thể tích mẫu được đưa vào mỗi đĩa, tính bằng ml

d là độ pha loãng tương ứng.

Để mua Môi trường nuôi cấy vi sinh, quý bà con vui lòng liên hệ:

CÔNG TY CỔ PHẦN ĐẦU TƯ THƯƠNG MẠI DỊCH VỤ TIN CẬY

Địa chỉ: Số 4, Đường số 3, Khu Đô Thị Vạn Phúc – Quốc lộ 13, P.Hiệp Bình Phước, Q.Thủ Đức, Tp.HCM

Điện thoại: (028) 2253 3535 – 0165 887 1302 – 0909 307 123 – 0903 908 671

Email: ; ; .