Xác định Sự Sinh Trưởng Của Vi Sinh Vật - .vn

Xác định số lượng tế bào

Phương pháp đơn giản nhất để xác định số lượng tế bào là đếm trực tiếp dưới kính hiển vi. Dùng các phòng đếm để đếm vừa nhanh chóng, dễ dàng, lại rẻ tiền nhất, lại có thể quan sát thấy kích cỡ và hình dáng tế bào. Thường dùng phòng đếm Petroff-Hausser để đếm tế bào động vật nguyên sinh. Dùng phòng đếm hồng cầu có thể đếm được các tế bào nhân nguyên thủy cũng như tế bào nhân thật. Với tế bào nhân nguyên thủy cần nhuộm màu hoặc là dùng kính hiển vi tương phản pha hay kính hiển vi huỳnh quang (phase-constrast or fluoresence microscope) để dễ quan sát hơn. Phòng đếm có cấu trúc để có một độ sâu nhất định lại có chia ra thành các ô nhỏ (hình 5). Khi đếm số lượng ta đưa dịch pha loãng vào phòng đếm, đậy lá kính (lamelle/ cover glass) lên trên, sau đó tiến hành đếm số lượng dưới kính hiển vi. Khuyết điểm của phương pháp này là không xác định được với các mẫu có số lượng vi khuẩn quá nhỏ, độ chính xác cũng không cao vì không phân biệt được giữa tế bào sống và tế bào chết.

Với động vật nguyên sinh, vi tảo và nấm men có thể dùng máy đếm điện tử như loại máy Coulter Counter để xác định số lượng. Nguyên lý là hai bên mỗi lỗ nhỏ có điện cực và nối điện. Khi tế bào trong dịch huyền phù đi qua lỗ nhỏ thì cứ mỗi tế bào đi qua thì điện trở lại tăng lên (hoặc tính dẫn điện giảm xuống) và sinh ra một tín hiệu điện, máy đếm sẽ tự động ghi số. Kết quả xác định của loại máy này khá chính xác, có thể ứng dụng rộng rãi để xác định số lượng hồng cầu và bạch cầu, nhưng phương pháp này không thích hợp xác định số lượng vi khuẩn vì dễ bị can thiệp bời các hạt nhỏ và các vật chất dạng sợi trong mẫu vật.

Cả hai phương pháp nói trên đều không phân biệt được tế bào sống và tế bào chết. Để xác định số lượng tế bào sống người ta thường dùng phương pháp cấy dịch pha loãng lên bề mặt môi trường thạch đĩa. Sau khi nuôi cấy mỗi vi khuẩn sẽ tạo thành 1 khuẩn lạc. Ví dụ ở độ pha loãng 1 x 10-6 đếm được 150 khuẩn lạc thì có nghĩa là mật độ vi khuẩn trong mẫu là 1,5 x 108.

Dùng dụng cụ đếm khuẩn lạc càng thêm thuận tiện. Phương pháp này cho biết số lượng các tế bào sống của vi sinh vật. Phương pháp này đơn giản, nhạy cảm và thích hợp ứng dụng rộng rãi để xác định số lượng vi sinh vật sống khi phân tích các mẫu thực phẩm, nước, đất...Tuy nhiên kết quả cũng chịu ảnh hưởng của một số nhân tố. Nếu vi khuẩn dính thành khối không tách rời nhau ra thì kết quả thu được là thấp hơn thực tế., vì mỗi khuẩn lạc không phát triển từ một tế bào riêng rẽ. Vì vậy kết quả thu được từ phương pháp này được coi là số đơn vị hình thành khuẩn lạc (CFU-colony forming unit). CFU không hoàn toàn phù hợp với số tế bào sống trong mẫu vật. Trong quá trình sử dụng phương pháp này nên sử dụng độ pha loãng nào cho số khuẩn lạc xuất hiện trên đĩa chỉ nằm trong phạm vi khoảng 30-300 mà thôi. Đương nhiên môi trường dinh dưỡng không thể đáp ứng chung cho mọi loại vi sinh vật, do đó kết quả thu được bao giờ cũng thấp hơn thực tế. Khi trộn thạch với dịch pha loãng thì thạch đã đủ nguội để không làm chết vi khuẩn hay làm thương tổn với một số loại mẫn cảm với nhiệt độ. Việc cấy cấy dịch pha loãng trên bề mặt rồi dàn đều bằng que gạt thủy tinh thường cho kết quả cao hơn về số lượng vi sinh vật so với phương pháp trộn với môi trường thạch chưa đông.

Để xác định số lượng vi sinh vật còn có thể nuôi cấy giấy lọc đã lọc dịch pha loãng mẫu vật. Phương pháp này gọi là phương pháp màng lọc (membrane filter). Dùng một thiết bị lọc đặc biệt đặt vừa một giấy lọc hình tròn có các lỗ nhỏ hơn kích thước vi khuẩn và các vi sinh vật khác. Sau khi lọc đặt giấy lọc lên môi trường thạch thích hợp hoặc thấm ướt màng lọc bằng dịch môi trường thích hợp rồi để nuôi cấy 24 giờ. Đếm số khuẩn lạc mọc trên giấy lọc để tính ra mật độ vi khuẩn sống có mặt trong mẫu vật (hình 7)

Phương pháp này thích hợp để sử dụng phân tích vi sinh vật trong nước. Có thể dùng các môi trường khác nhau thích hợp với các nhóm vi sinh vật khác nhau (hình 8)

Phương pháp màng lọc còn dùng để đếm trực tiếp vi khuẩn. Dịch mẫu vật được lọc qua một màng polyCarbonate màu đen. Vi khuẩn trên màng lọc được nhuộm màu huỳnh quang bằng thuốc nhuộm acridine da cam hoặc DAPI (diamidino-2-phenylindole). Quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang có thể thấy các tế bào vi sinh vật hiện lên màu da cam hay màu lục trên một nền đen. Hiện đã có những kit thương mại cho phép phân biệt tế bào sống và tế bào chết khi kiểm tra.