PHỔ KHỐI - Dược Điển Việt Nam

Nguyên tắc

Chất phân tích được chuyển sang thể khí và ion hoá, tạo thành các ion dương hoặc âm. Phương pháp phổ khối dựa trên việc đo trực tiếp tỷ số m/z, là tỷ số giữa khối lượng m và điện tích z của ion chất phân tích. Tỷ số này được trình bày dưới dạng đơn vị khối lượng nguyên tử (1 a.m.u = 1/12 khối lượng của 12C) hay dalton (1 Da = khối lượng nguyên tử hydro).

Trong máy phổ khối, các ion được tạo thành trong nguồn ion, được gia tốc rồi được tách trong bộ phân tích trước khi đến detector. Tất cả quá trình trên được thực hiện trong một buồng được hút chân không đến khoảng 10-3 đến 10-6 Pa.

Phổ thu được biểu diễn cường độ tương đối của các ion khác nhau phụ thuộc vào tỷ số m/z của các ion đó. Tín hiệu tương ứng với một ion là một nhóm các pic tương ứng với phân bố thống kê của các đồng vị khác nhau của ion đó. Đó là hình ảnh đồng vị của ion và trong đó pic của đồng vị có cường độ lớn nhất của một nguyên tử được gọi là pic đơn đồng vị.

Từ phổ khối ta có được những thông tin định tính (xác định khối lượng phân tử và thông tin về cấu trúc có được nhờ các mảnh thu được) hay định lượng (dùng chuẩn nội hay chuẩn ngoại) với giới hạn phát hiện trong khoảng từ picomol (10-12 mol) đến femtomol (10-15 mol).

=> Tham khảo: PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ NGUYÊN TỬ PHÁT XẠ VÀ HẤP THỤ (Phụ lục 4.4) – Dược Điển Việt Nam 5.

Nạp mẫu

Cần phải đưa mẫu vào máy sao cho không ảnh hưởng nhiều đến chân không trong máy. Một phương pháp thường dùng là nạp trực tiếp mẫu lỏng; mẫu được đặt lên đầu một thanh hình tạt (trong một chén thạch anh, trên một sợi hay trên một bề mặt kim loại). Thanh này được đưa vào máy phổ khối sau khi đi qua một chốt chân không mà ở đây được duy trì một chân không đầu tiên, có áp suất trung gian giữa áp suất khí quyển và áp suất của chân không thứ hai ở trong máy.

Trong những hệ thống nạp mẫu khác, các thành phần trong hỗn hợp mẫu thử được tách trên một máy khác (như máy sắc ký) trước khi đi vào trong máy khối phổ được ghép nối với máy đó.

Sắc ký khí – khối phổ

Trong sắc ký khí – khối phổ, một đầu của cột sắc ký (mao quản hay bán mao quản) được đưa trực tiếp vào trong nguồn ion của máy khối phổ.

Sắc ký lỏng – khối phổ

Sự kết hợp sắc ký lỏng – khối phổ là kỹ thuật đặc biệt hữu ích trong việc phân tích các hợp chất phân cực, là những chất ít bay hơi hay rất dễ phân hủy bởi nhiệt, không phân tích được bằng sắc ký khí – khối phổ.

Khó khăn trong kỹ thuật sắc ký lỏng – khối phổ là làm thế nào thu được các ion ở thể khí từ pha lỏng, vì vậy cần có những giao diện đặc biệt như:

Nạp trực tiếp: Pha động từ đầu cột sắc ký đi ra, được phun sương và dung môi được bay hơi ở trước nguồn ion của máy khối phổ.

Giao diện chùm hạt: Pha động với lưu lượng tới khoảng 0,6 mL/min được phun sương và loại dung môi trong một buồng nhỏ, chỉ còn lại các hạt chất phân tích trung hòa điện đi tới nguồn ion của máy khối phổ; kỹ thuật này được dùng cho các hợp chất có độ phân cực tương đối thấp và khối lượng phân tử nhỏ hơn 1000 Da.

Giao diện băng chuyền: Pha động với lưu lượng tới khoảng 1 mL/min được đưa lên một băng chuyền; sau khi dung môi bay hơi, các chất phân tích được lần lượt đưa tới nguồn ion và được ion hóa ở đó; kỹ thuật này ít phù hợp cho các chất rất phân cực hay dễ phân hủy nhiệt.

Các kiểu ghép nối khác (phun điện, phun nhiệt, ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển) được coi như thực chất là các kỹ thuật ion hóa và sẽ được mô tả trong phần các kiểu ion hóa.

Sắc ký chất lỏng siêu tới hạn – khối phổ

Trong kỹ thuật sắc ký chất lòng siêu tới hạn – khối phổ, pha động (thường là carbon dioxyd siêu tới hạn) khi đi qua một van chiết nóng nằm giữa cột sác ký và nguồn ion sẽ chuyển sang thể khí.

Điện di mao quản – khối phổ

Trong kỹ thuật điện di mao quản – khối phổ, dịch rửa giải từ cột mao quản được đưa vào nguồn ion và trong một số trường hợp một dung môi khác được thêm vào để đạt được lưu lượng cỡ vài μl/min. Kỹ thuật này có hạn chế là lượng mẫu nhỏ và cần dùng dung môi bay hơi.

Các kiểu ion hóa

Bắn phá điện tử

Mẫu thử ở trạng thái khí được ion hóa dưới tác động của một chùm electron có năng lượng lớn hơn năng lượng ion hóa của mẫu (thường là 70 eV). Bên cạnh các ion phân tử M+, sẽ hình thành các mảnh đặc trưng cho cấu trúc của phân tử. Kỹ thuật này bị hạn chế chủ yếu vì phải hóa hơi mẫu. Vì vậy nó không phù hợp cho các chất phân cực, dễ phân hủy nhiệt hay có khối lượng phân tử lượng lớn.

Kiểu ion hóa bằng bắn phá điện tử phù hợp cho kỹ thuật ghép nối khối phổ với sắc ký khí và đôi khi với sắc ký lỏng.

lon hóa hóa học

Trong kiểu ion hóa này, người ta dùng một thuốc thử ở thể khí như methan, amoniac, nitrogen oxyd, nitrogen dioxyd hay oxygen. Phổ khối thu được sẽ đặc trưng bởi các ion kiểu (M + H)+ hay (M – H)– hay các ion cộng hợp giữa chất phân tích và khí thuốc thử. Các mảnh hình thành ít hơn so với kiểu bắn phá điện tử. Một biến thể khác của kỹ thuật này được dùng khi chất phân tích dễ bị phân hủy nhiệt; trong trường hợp này, mẫu được đưa lên một sợi dây và bay hơi rất nhanh do hiệu ứng nhiệt Joule-Thomson (ion hóa hóa học giải hấp).

lon hóa bằng bắn phá nguyên tử nhanh (FAB) hay ion nhanh (khối phổ ion thứ cấp lỏng – LSIMS)

Trong kỹ thuật này, mẫu thử được hòa tan trong một chất nền nhớt như glycerin, rồi cho lên một bề mặt kim loại và được bắn phá bởi một chùm nguyên tử trung hòa như argon hay xenon, hoặc bằng các ion cesi động năng cao.

Kết quả là sẽ xuất hiện các ion kiểu (M+H)+ hay (M-H)–  hay các ion cộng hợp hình thành từ chất nền hay mẫu thử. Kiểu ion hóa này rất thích hợp cho các chất phân cực hay dễ phân hủy nhiệt, cho các chất có phân tử lượng tới 10000 Da. Kỹ thuật này có thể dùng kết hợp với sắc ký lỏng trong đó pha động được cho thêm 1 % đến 2 % glycerin; tuy vậy lưu lượng pha động phải rất thấp (vài μl/min).

lon hóa điện trường và khử hấp điện trường

Trong kỹ thuật này, mẫu thử được bay hơi gần một sợi dây worlfram có phủ các vi kim (ion hóa điện trường) hay được đặt lên sợi dây (giải hấp điện trường). Mẫu thử được ion hóa dưới tác động của một điện áp khoảng 10 kV đặt giữa sợi dây và một đối điện cực. Hai kỹ thuật này chủ yếu tạo nên các ion phân tử M+, các ion (M + H)+ và được dùng cho các chất có độ phân cực thấp và hay dễ phân hủy nhiệt.

lon hóa khử hấp bằng laser có nền hỗ trợ (MALDI)

Ở đây, mẫu thử trong một nền thích hợp được đặt lên một giá đỡ kim loại và được ion hóa bởi một chùm xung tia laser có bước sóng trong vùng từ tử ngoại đến hồng ngoại (các xung này rất ngắn, chỉ kéo dài trong một pico giây đến vài nano giây). Kiểu ion hóa này đóng vai trò thiết yếu trong việc phân tích các chất có khối lượng phân tử rất cao (trên 100000 Da) nhưng chỉ dùng cho các máy có bộ phân tích thời gian bay (xem thêm ở dưới đây).

Phun điện

Kiểu ion hóa này được thực hiện ở áp suất khí quyển. Các mẫu thử trong dung dịch được đưa vào nguồn ion qua một Ống mao quản mà ở đầu ống này có một điện thế cỡ 5 kV.

Có thể dùng một khí để phun sương. Lưu lượng khí có thể từ vài μL/min đến 1 mL/min. Kỹ thuật này phù hợp cho các chất phân cực và cho việc nghiên cứu các phân tử sinh học có khối lượng tới 100000 Da. Có thể dùng trong ghép nối với sắc ký lỏng hay điện di mao quản.

Ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển (APCI)

lon hóa được thực hiện ở áp suất khí quyển nhờ tác động của một điện cực có điện thế nhiều kilo vôn đặt trên đường đi của pha động; pha động được phun sương bằng hiệu ứng nhiệt và một luồng khí nitrogen. Các ion hình thành có một điện tích và là ion kiểu (M+H)+ trong chế độ phân cực dương và kiểu (M-H)– trong phân cực âm. Kiểu ion hóa này có thể áp dụng cho kết nối với sắc ký lỏng ở lưu lượng pha động cao đến 2 mL/min. Mẫu thử trong pha động có nước, các dung môi hữu cơ và một chất điện ly dễ bay hơi (thường là amoni acetat), sau khi đi qua một mao quản kim loại có nhiệt độ được kiểm soát, được đưa vào nguồn ion dưới dạng phun sương. Lưu lượng thích hợp là trong khoảng 1 – 2 mL/min. Các ion của chất điện ly sẽ ion hóa các chất phân tích. Quá trình ion hóa này có thể được thay thế hay tăng cường bằng sự phóng điện ở khoảng 800 vôn, đặc biệt là khi tất cả là dung môi hữu cơ. Kỹ thuật này phù hợp cho việc ghép nối khối phổ với sắc ký lỏng.

Bộ phân tích khối

Các bộ phân tích khối (hay bộ phân tích) có hiệu năng khác nhau chủ yếu do hai thông số:

• Dải khối, tức là dải đo tỷ số m/z;
• Độ phân giải, tức là khả năng tách hai ion có cường độ bằng nhau và có tỷ số m/z khác nhau ΔM, và phần xen phủ giữa hai pic được đo bằng chiều cao của hõm tính theo phần trăm; ví dụ, độ phân giải (M/ΔM) là 1000 với hõm 10 % cho ta biết có thể tách hai tỷ số m/z 1000 và 1001 với dãy hõm có cường độ 10 % trên đường nền.

Tuy vậy, trong một số trường hợp (bộ phân tích thời gian bay, tứ cực hay bẫy ion) độ phân giải được định nghĩa là tỷ số giữa khối lượng phân tử và chiều rộng của pic ở nửa chiều cao (ứng với hõm 50 %).

Bộ phân tích từ và phân tích tĩnh điện

Các ion tạo thành trong nguồn ion được gia tốc bởi một điện áp V, được hội tụ về bộ phân tích từ có từ trường B hay bộ phân tích tĩnh điện có điện trường tĩnh điện E, tùy theo cấu hình của máy. Các ion này đi theo một quỹ đạo bán kính r, theo định luật Laplace:

m/z = (B2r2)/2V

Có hai kiểu quét để thu nhận và đo các ion khác nhau sinh ra trong nguồn ion: quét B với V cố định và quét V với B cố định. Bộ phân tích từ trường được tiếp nối bởi một ngăn điện có tác dụng như một bộ lọc động năng, làm tăng đáng kể độ phân giải của máy. Độ phân giải tối đa của một máy loại này (loại hai ngăn) nằm trong khoảng 10000 đến 150000 nhờ đó, trong hầu hết các trường hợp, cho phép tính toán đủ chính xác các tỷ số m/z để xác định được thành phần nguyên tố của các ion. Với các ion có điện tích bằng 1, dải khối là từ  2000 Da đến 15000 Da. Một số ion có thể phân hủy nhanh chóng vì là kết quả của sự chuyển dịch kém bền hoặc do va chạm với một khí trong những vùng vô trường giữa nguồn ion và detector [phân ly do hoạt hóa bởi va chạm (CAD)].

Xem xét những sự phân hủy này là rất có ích cho việc xác định cấu trúc cũng như đặc tính của một chất cụ thể trong hỗn hợp, việc xem xét này cần đến kỹ thuật khối phổ tiếp nối. Có nhiều kỹ thuật như vậy có thể áp dụng, tùy theo sự phân hủy xảy ra ở vùng nào:

• Kiểu ion con (xác định các ion phân hủy của ion mẹ): B/E = hằng số, gọi là MIKES (Mass-analysed lon Kinetic Energy Spectroscopy – Phổ động năng ion phân tích khối);
• Kiểu ion mẹ (xác định tất cả các ion mà khi phân hủy cho một ion có tỷ số m/z xác định): B2/E = hằng số;
• Kiểu mất mảnh trung hòa (kiểu mảnh mất, neutral-loss mode, phát hiện tất cả các ion cùng mất một mảnh): B/E(1-E/E0)1/2 = hằng số, trong đó E0 là điện áp nền của ngăn điện.

Bộ phân tích tứ cực

Bộ phân tích này Gồm có bốn thanh kim loại song song hình trụ hay có tiết diện hình hyperbol. Chúng được đặt đối xứng hai bên đường đi của các ion; các cặp đối diện với nhau qua trục đối xứng của các thanh điện cực thì được nối điện với nhau. Điện thế của hai cặp thanh điện cực là đối nhau. Điện thế này là tổ hợp của một thành phần một chiều và một thành phần xoay chiều.

Các ion hình thành trong nguồn ion được truyền đi và tách bằng cách thay đổi thế đặt trên các điện cực sao cho tỷ số giữa thế một chiều và thế xoay chiều là hằng số. Bộ tứ cực thường có dải khối từ 1 a.m.u. đến 2000 a.m.u., một số có thể tới 4000 a.m.u.. Mặc dù các bộ tứ cực có độ phân giải thấp hơn các bộ phân tích từ, nhưng chúng cho ta hình ảnh đơn đồng vị của các ion một điện tích trên toàn dải phổ. Có loại dùng bộ phân tích gồm ba tứ cực xếp nối tiếp nhau Q1, Q2, Q3 (gọi là bộ ba tứ cực hay tứ cực chập ba) để ghi phổ.

Tứ cực Q2 là ngăn để cho các ion va chạm, tạo ra các ion mảnh nhỏ hơn, như vậy thực ra Q2 không có vai trò phân tích; khí dùng cho va chạm thường là khí argon.

Các kiểu quét thông dụng nhất là:

• Kiểu ion con: Q1 tách lấy ion có m/z, ion này được đưa vào Q2 và được phân mảnh do va chạm, các mảnh tạo thành được phân tích trong Q3;
• Kiểu ion mẹ: Q1 quét một dải khối xác định, Q3 chỉ lọc lấy một ion có m/z nhất định. Như vậy chỉ những ion nào phân hủy sinh ra mảnh ion chọn bởi Q3 là được phát hiện;
• Kiểu mảnh mất: Q1 và Q3 quét một dải khối nào đó trong khoảng tương ứng với các ion mất một mảnh đặc trưng cho một chất hay một nhóm chất.

Cũng có thể ghi phổ khối dùng phối hợp bộ tứ cực với bộ phân tích từ hay tĩnh điện; đó là các máy khối phổ lai.

Bộ phân tích bẫy ion

Bộ phân tích này về nguyên tắc cũng giống như bộ tứ cực, nhưng sử dụng điện trường ba chiều. Bộ phân tích kiểu này cho phép thu được phổ các ion hình thành qua nhiều thế hệ (MSn) hay gọi là phổ MS nhiều lần.

Bộ phân tích cộng hưởng cyclotron ion

Ở đây, các ion hình thành trong một ngăn và được đưa vào một từ trường đều, mạnh, chuyển động trên quỹ đạo tròn với tần số có thể tỷ lệ thuận với tỷ số m/z của chúng nhờ áp dụng thuật toán chuyên hóa Fourrier.

Hiện tượng này được gọi là cộng hưởng cyclotron ion. Các bộ phân tích kiểu này gồm có những nam châm siêu dẫn và có độ phân giải cao (tới 1000000 và hơn nữa) cũng như cho ta phổ MSn, nhưng đòi hỏi phải có chân không cao tức là áp suất rất thấp (cỡ 10-7 Pa).

Bộ phân tích thời gian bay

Ở đây, các ion hình thành trong nguồn ion được gia tốc ở điện áp 10 kV đến 20 kV. Chúng đi qua một bộ phận tích gồm ống vô trường thường được gọi là ống bay, dài khoảng 25 cm đến 1,5 m. Thời gian t cần cho một ion đi đến detector tỷ lệ thuận với căn bậc hai của tỷ số m/z. Về lý thuyết, dải khối của bộ phân tích này là vô hạn; nhưng trên thực tế nó bị hạn chế bởi sự ion hóa hay phương pháp khử hấp. Bộ phân tích thời gian bay chủ yếu dùng cho các chất có khối lượng phân tử cao (đến vài trăm ngàn dalton).

Kỹ thuật này rất nhạy (đến vài picomol). Độ chính xác của phép đo và độ phân giải có thể được cải thiện nếu dùng gương tĩnh điện (reflection).

Thu nhận tín hiệu

Chủ yếu có ba kiểu thu tín hiệu.

Kiểu toàn phổ

Toàn bộ tín hiệu thu được trên một dải khối được ghi lại. Phổ trình bày sự phụ thuộc của cường độ tương đối của các ion khác nhau vào tỷ số m/z của các ion đó. Kết quả thu được chủ yếu có ý nghĩa định tính. Việc sử dụng thư viện phổ đối chiếu cho phép ta định tính nhanh chóng.

Kiểu đo mảnh (theo dõi ion chọn lọc)

Tín hiệu thu được là của một ion (theo dõi một ion, SIM) hay nhiều ion (theo dõi nhiều ion, MIM) đặc trưng cho chất được phân tích. Giới hạn phát hiện có thể được thu nhỏ đáng kể trong kiểu thu tín hiệu này. Có thể tiến hành các phép thử định lượng hay bán định lượng nhờ dùng các chất chuẩn ngoại hay chuẩn nội (ví dụ, dùng chuẩn deuteri hóa). Không thể tiến hành các phép thử này với các bộ phân tích thời gian bay.

Kiểu đo mảnh phố khối hai lần (theo dõi nhiều phản ứng, MRM)

Kiểu đo này cho phép theo dõi chọn lọc sự phân hủy đơn phân tử hay đôi phân tử của một tiền ion đã chọn, đặc trưng cho chất phân tích. Độ chọn lọc và tính đặc hiệu của kiểu thu tín hiệu này cho phép đạt đến độ nhạy rất cao làm cho kiểu đo này trở thành một phép đo thích hợp nhất trong các nghiên cứu định lượng nếu dùng chất chuẩn nội thích hợp (như chuẩn deuteri hóa). Kiểu phân tích này có thể thực hiện trên máy có ba tứ cực ghép nối tiếp, các bộ phân tích bẫy ion hay cộng hưởng cyclotron.

=> Đọc thêm: PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ HUỲNH QUANG (Phụ lục 4.3) – Dược Điển Việt Nam 5.

Hiệu chuẩn

Việc hiệu chuẩn cho phép ta gán một giá trị m/z tương ứng với một tín hiệu thu được. Trên nguyên tắc, việc hiệu chuẩn được thực hiện nhờ sử dụng một chất đối chiếu. Nếu dùng chuẩn ngoại, phổ chất đối chiếu được ghi riêng; nếu dùng chuẩn nội thì chất đối chiếu được trộn với chất đem thử. So ion hay số điểm chuẩn cần thiết (để việc hiệu chuẩn đáng tin cậy) phụ thuộc vào kiểu bộ phân tích và độ chính xác mong muốn, ví dụ như khi dùng bộ phân tích từ thì càng làm nhiều điểm càng tốt vì ở đây tỷ số m/z biến đổi theo hàm số mũ với giá trị từ trường.

Phát hiện tín hiệu và xử lý dữ liệu

Các ion sau khi được tách trong bộ phân tích, được chuyển thành tín hiệu điện trong một hệ thống phát hiện như một nhân quang hay một nhân electron. Các tín hiệu được khuếch đại trước khi được chuyển lại thành tín hiệu số để xử lý dữ liệu cho phép hiệu chuẩn, dựng thành phổ, tự động định lượng, lưu trữ, đưa vào thư viện phổ hay sử dụng thư viện phổ. Máy tính được dùng để kiểm soát các thông số vật lý điều hành hoạt động của cả hệ thống máy.