Phương Pháp Phổ Khối Lượng (Mass Spectrometry - MS) - Tài Liệu Text

Có thể bạn quan tâm

Tải bản đầy đủ (.pdf) (25 trang)

Trang chủ

Giáo Dục - Đào Tạo

Cao đẳng - Đại học

Phương pháp phổ khối lượng (Mass Spectrometry - MS)

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (2.24 MB, 25 trang )

A. Lý thuyếtPhương pháp phổ khối lượng (Mass Spectrometry - MS) là một phương pháp phân tíchdụng cụ quan trọng trong phân tích thành phần và cấu trúc các chất. Bắt đầu từ cuối thế kỷXIX, Goldstein (1886) và Wein (1898) thấy rằng một chùm tia ion dương có thể tách ra khỏinhau dưới tác dụng của một điện trường và từ trường. Năm 1913, F.W Aston (nhà bác học đạtgiải Nobel năm 1922 cho các nghiên cứu đồng vị) đã nghiên cứu thấy khí neon tự nhiên gồm2 loại có khối lượng nguyên tử khác nhau (isotope) là 20 và 22 (g/mol). Hàng loạt các nghiêncứu về phương pháp phổ khối lượng như cơ chế và kỹ thuật ion hoá, thiết bị phân tích phổkhối và các ứng dụng của phương pháp phổ khối lượng trong các lĩnh vực hoá học, vật lý,sinh học, …đã được thực hiện như máy GC/MS ra đời những năm 1950, máy HPLC/MS đượcphát minh những năm 1970…Ngày nay, phương pháp phân tích phổ khối lượng có ứng dụng rộng rãi trong nhiềungành với các ứng dụng chính như: Xác định khối lượng, cấu trúc phân tử; Nhận dạng, địnhdanh và cấu trúc chuỗi peptip, protein; Nghiên cứu đồng vị; Định tính, định lượng các chấtnồng độ vết và vi lượng trong các mẫu sinh học, thực phẩm, nông thuỷ sản, môi trường...1. Cơ sở lý thuyết của phương pháp khối phổ- Phương pháp phổ khối lượng là một kỹ thuật đo trực tiếp tỷ số khối lượng và điện tíchcủa ion (m/z) được tạo thành trong pha khí từ phân tử hoặc nguyên tử của mẫu. Tỷ số nàyđược biểu thị bằng đơn vị khối lượng nguyên tử (Atomic mass unit) hoặc bằng Dalton. 1 amu= 1 Da và bằng khối lượng của nguyên tử hydro.Sơ đồ cấu tạo thiết bị khối phổ kếThí nghiệm xác định đồng vị Neon(mass spectrometer)của F.W Aston năm 1913- Các ion được tạo thành trong buồng ion hóa, được gia tốc và tách riêng nhờ bộ phậnphân tích khối trước khi đến bộ phận phát hiện (detector). Quá trình phân tích khối và pháthiện được thực hiện trong môi trường chân không (áp suất khoảng 10-5 đến 10-8 Torr).- Đối với các hợp chất hữu cơ: Cơ sở của phương pháp MS là sự ion hoá phân tử trunghoà thành các ion phân tử mang điện tích hoặc sự bắn phá, phá vỡ cấu trúc phân mảnh phân tửtrung hoà thành các mảnh ion, các gốc mang điện tích (có khối lượng nhỏ hơn) bằng các phầntử mang năng lượng cao theo sơ đồ sau:+ Ion hoá phân tử trung hoà thành các ion phân tử mang điện tích:ABCD + eÆABCD+ + 2eÆABCD2+ + 3eÆABCD-(> 95%)+ Phân mảnh phân tử trung hoà thành các mảnh ion, các gốc mang điện tích:ABCD + e*ÆABn+ + C + Dm-Sự phân mảnh phân tử trung hoà thành các mảnh ion, các gốc mang điện tích tuân theođịnh luật bảo toàn khối lượng. Năng lượng bắn phá (năng lượng ion hoá) là một yếu tố quyếtđịnh sự phân mảnh các hợp chất. Khi năng lượng bắn phá mẫu (khoảng 10eV) bằng với nănglượng ion hóa phân tử sẽ gây nên sự ion hóa phân tử. Nếu năng lượng ion hóa tăng lên (3050eV) sẽ bẻ gẫy một số liên kết trong phân tử, tạo ra nhiều mảnh. Đó là các ion hoặc phân tửtrung hòa có khối lượng bé hơn.Quá trình phân mảnh đặc trưng cho cấu trúc của phân tử và chỉ ra sự có mặt của nhữngnhóm chức đặc thù, cung cấp cho người phân tích những thông tin hữu ích về cấu tạo hoặcnhận dạng của chất phân tích. Quá trình phân mảnh là cơ sở giúp ta biện giải phổ, nhận dạnghoặc khẳng định cấu trúc của chất phân tích.2. Cấu tạo và nguyên lý vận hành của một phổ kế và phổ kế kết nối HPLCSơ đồ khối cấu tạo các bộ phận của một khối phổ kếMột khối phổ kế bao gồm các phộ phận chính: Bộ nạp mẫu – đưa mẫu vào (inlet), Bộ nguồnion hoá (ion source), bộ phân tích khối (mass analyzer), bộ phát hiện ion (detector) và ghi/ xửlý số liệu (data system).2.1. Bộ phận nạp mẫu:Chuyển các mẫu cần phân tích vào nguồn ion hoá của thiết bị khối phổ. Có hai phươngpháp nạp mẫu chính, tuỳ thuộc vào trạng thái vật lý của chất cần phân tích:− Nạp mẫu dạng khí: Áp dụng đối với các chất khí, chất lỏng (dễ bay hơi) bằng syringetiêm mẫu hoặc kết nối với hệ sắc ký khí (GC/MS), sắc khí lỏng (LC/MS).− Nạp mẫu trực tiếp: Áp dụng với các rắn, tinh thể, sơn hoặc keo. Mẫu đựng trong cốichuyên dụng (Φ # 1mm), gắn trên thanh đốt được đưa vào buồng chân không. Sau khi hútchân không, cối đựng mẫu được làm nguội và đưa vào buồng ion hoá, ở đâu nó được đốt nóngtừ từ cho đến khi bay hơi.Sự ra đời của các kỹ thuật ion hoá tiên tiến (ion hoá mềm) như ion hoá bằng chùm tialaser hay phản hấp thụ/ ion hoá mẫu bằng chùm tia laser (MALDI - Matrix-assisted laserdesorption/ionization) hoặc bắn phá nhanh nguyên tử (FAB - fast atom bombardment), quátrình nạp mẫu của các chất rắn không cần phải sử dụng các cối chuyên dụng và tương tự nhưquá trình nạp mẫu đối với chất khí và lỏng.Do quá trình nạp mẫu từ áp suất thường (760mmHg) vào buồng chân không cao (10-510-8 Torr) phải không được ngắt chân không của bộ phận phân tích khối (mass analyzer) vàphát hiện (detector) nên bộ phận nạp mẫu cũng như nguồn ion hoá của GC/MS và LC/MS cókhác biệt:− Với GC/MS, đầu ra của GC có thể được đưa trực tiếp vào nguồn ion hoá của khối phổkế và nguồn ion hoá được gắn liền với thiết bị phân tích khối. Giao diện kết nối giữa GC vàoMS tương đối đơn giản.Sơ đồ khối cấu tạo thiết bị GC/MS-MS (kiểu tứ cực chập ba)− Với LC/MS, đầu ra của LC là dòng dung môi pha động nếu đưa trực tiếp và toàn bộdòng dung môi vào khối phổ kế sẽ làm giảm chân không ảnh hưởng đến độ nhạy và vận hànhcủa thiết bị. Mặt khác, khi đó các ion có trong thành phần dòng dung môi dễ dàng va chạmvới các phân tử, nguyên tử trung hòa làm lệch hướng di chuyển, và bị bơm chân không củakhối phổ kế hút thải ra ngoài. Do vậy, quá trình nạp mẫu từ LC vào MS thường phải có cácgiao diện ghép nối phù hợp (đai chuyển, chia dòng, phun sương,…). Một ghép nối LC/MScần có các đặc tính: Cho phép chuyển mẫu hiệu quả và chính xác từ LC sang MS mà khônglàm phá hủy hay mất chất phân tích, loại bớt dung môi rửa giải, giảm pha loãng mẫu và làmmất chất phân tích; cho phép nhiều lựa chọn phương pháp cho LC và điều kiện vận hành choMS; dễ dàng bảo dưỡng và vận hành; thời gian lưu của píc sắc kí đồng nhất và giảm thiểu tốiđa sự doãng píc. Với thiết bị LC/MS, bộ phận ion hoá sẽ được thiết kế phù hợp với giao diệnkết nối LC với MS và thường được đặt ở phía ngoài MS (vùng áp suất giảm). Dòng ion hìnhthành ở nguồn ion đi vào thiết bị phân tích khối (vùng chân không) thông qua các hệ thốngmao quản kết nối.Sơ đồ khối cấu tạo thiết bị LC/MS-MS (nguồn ion hoá kiểu ESI – kết nối phun sương)Giao diện kết nối đai chuyển (moving belt)Giao diện kết nối chia dòng liên tục (nguồn ion FAB)2.2. Nguồn ion hoá (ion source):Ion hoá phân tử trung hoà thành các ion phân tử mang điện tích hoặc sự bắn phá, phânmảnh phân tử trung hoà thành các mảnh ion, các gốc mang điện tích bằng các phần tử mangnăng lượng cao. Những tiểu phân không bị ion hóa sẽ bị hút ra khỏi buồng ion qua bơm chânkhông của thiết bị MS. Các ion phân tử tạo thành sẽ được tăng tốc độ và thu gọn (hội tụ).Việc tăng tốc được thực hiện bởi một điện thế (2-10 kV), khi ra khỏi buồng ion hóa cácion phân tử có tốc độ đạt cao nhất. Việc thu gọn thành chùm ion được thực hiện bởi một điệntrường phụ để khi vào phần phân tích khối (mass analyzer) là một dòng ion tập trung, đồngnhất. Có nhiều loại nguồn ion hoá sử dụng các kỹ thuật ion hoá khác nhau được dùng trongcác máy GC/MS và LC/MS.1. Kĩ thuật ion hóa va chạm điện tử (Electron Impact ionization): Trong nguồn ionelectron tạo ra từ một sợi dây tóc đèn được đốt nóng, sau đó được tăng tốc hướng tới anode vàva chạm với các phân tử khí của mẫu phân tích được tiêm vào nguồn ion. Nếu các electron cóđủ năng lượng, khi va chạm nó sẽ làm một electron của phân tử bị bắn ra theo phương trình:R+ e- Æ R.+ + 2e-. Các ion được hình thành sau khi va chạm sẽ đi qua một điện trườngkhoảng 400 – 4000V để tăng tốc khi đi vào bộ phận phân tích khối. Tốc độ chuyển động củacác ion tỷ lệ với khối lượng của chúng. Trong kỹ thuật ion hoá va chạm điện tử, khí và cácmẫu có áp suất hóa hơi cao được nạp trực tiếp vào nguồn ion. Các mẫu lỏng hoặc rắn phảiđược làm nóng để làm tăng áp suất hóa hơi.Sơ đồ cấu tạo nguồn ion hoá kiểu va chạm điện tử2. Kĩ thuật ion hóa hóa học (Chemical ionization): Trong nguồn ion hóa hóa học, cácion được tạo ra thông qua sự va chạm của các phân tử chất phân tích với các ion sơ cấp (thuốcthử) được cho vào nguồn ion. Trong nguồn ion, đầu tiên các electron sẽ ion hóa thuốc thử(các phân tử H2, CH4, H2O, CH3OH, NH3, …) sau đó các ion của thuốc thử lại va chạm vớinhau và va chạm với phân tử trung hoà của chất cần phân tích tạo ra một môi trường ion hóaqua một loạt các phản ứng. Cả hai dạng ion âm và dương của chất phân tích sẽ được tạo rathông qua các phản ứng hóa học với các ion trong môi trường này.3. Kĩ thuật ion hóa điện trường (Field ionization): Là kĩ thuật sử dụng một điện trườngmạnh (8-12 kV) giữa hai điện cực để tạo ra các ion từ các phân tử pha khí. Các phân tử mẫu ởpha khí tiến gần tới bề mặt điện cực có điện thế (+) cao. Khi điện trường ở bề mặt này đủmạnh (107-108 Vcm-1), một điện tử của phân tử mẫu sẽ chuyển vào điện cực, kết quả là tạothành cation gốc M+. Ion này bị điện cực đẩy về phía điện cực âm với một khe nhỏ để các ioncó thể đi vào bộ phận phân tích khối. FI là kĩ thuật ion hóa mềm, các ion có nội năng thấp nênít phân mảnh. Tuy nhiên do cần sử dụng nhiệt để hóa hơi mẫu nên kĩ thuật này tương tự EI,CI là chỉ thích hợp với các hợp chất dễ bay hơi và bền với nhiệt.Sơ đồ kĩ thuật ion hóa điện trường.4. Kĩ thuật bắn phá nhanh nguyên tử (Fast Atom Bombardment): Trong kĩ thuật này,một chùm tia sơ cấp các nguyên tử/ phân tử trung hòa hoặc ion được tập trung lên bề mặt mẫuchứa hoạt chất cần phân tích (chất cần phân tích được hòa tan trong một nền là chất lỏngkhông bay hơi). Khi chùm tia sơ cấp có năng lượng cao bắn vào bề mặt dung dịch mẫu sẽ đẩyra các ion từ dung dịch đi ra. Các ion được tăng tốc nhờ điện thế để đi vào bộ phận phân tíchkhối. Kĩ thuật này không gây ra sự ion hóa mà chỉ đẩy các ion có sẵn trong dung dịch vào phakhí.Sơ đồ hình thành ion trong kỹ thuật FAB.5. Kĩ thuật phản hấp thụ và ion hoá bằng tia laser: Là kĩ thuật hiệu quả để tạo các ion ởpha khí. Các xung nhịp laser được tập trung trên bề mặt của mẫu (thường là rắn) gây chia cắtbề mặt và tạo các tiểu plasma của ion và phân tử trung tính. Chúng sẽ phản ứng với nhau ởpha hơi dày đặc gần bề mặt mẫu. Các xung laser vừa có tác dụng làm bay hơi mẫu vừa ionhóa mẫu. Một trong những kỹ thuật phản hấp thụ và ion hoá bằng tia laser được ứng dụngrỗng rãi trong nguồn ion hoá của các thiết bị là kĩ thuật MALDI (Matrix-assisted laserdesorption/ionization). Kĩ thuật ion hóa MALDI, được thực hiện qua 2 bước: Bước đầu tiên,chất phân tích được hòa tan trong dung môi chứa dung dịch chất hữu cơ phân tử nhỏ, đượcgọi là nền. Các phân tử đó phải hấp thụ mạnh ánh sáng laser. Hỗn hợp này được làm khô vàloại dung môi trước khi phân tích. Các phân tử chất phân tích được gắn vào nền để phân cáchcác phân tử đó với nhau.Sơ đồ hình thành ion trong kỹ thuật MALDI.Bước thứ hai xảy ra dưới điều kiện chân không liên quan tới sự chia cắt các phần của dungdịch rắn bởi cường độ xung nhịp laser trong thời gian ngắn. Việc chiếu laser làm nóng nhanhchóng các tinh thể bởi sự tích tụ một lượng lớn năng lượng trong pha đặc thông qua sự kíchthích các phân tử nền. Làm nóng nhanh gây ra sự thăng hoa cục bộ của tinh thể nền, gây chiacắt bề mặt tinh thể và sự phát triển của nền vào pha khí, vận chuyển chất phân tích nguyênvẹn trong chùm nền. Phản ứng ion hóa có thể xảy ra dưới điều kiện chân không trong suốt quátrình: ion hóa bằng ánh sáng trong pha khí, chuyển proton ở trạng thái kích thích, phản ứngion-phân tử,…Các ion được tạo thành sẽ được tăng tốc bởi trường tĩnh điện hướng tới chấtphân tích. Kỹ thuật MALDI ít gây phân mảnh và có khả năng giải hấp và ion hóa các phân tửrất lớn tới 100.000 Da. Có thể tạo ra cả 2 dạng ion âm hoặc dương.6. Kĩ thuật ion hóa phun sương điện (Electron Spray Ionization): ESI là một kỹ thuậtion hóa được ứng dụng cho những hợp chất không bền nhiệt, phân cực, có khối lượng phân tửlớn. ESI có khả năng tạo thành những ion đa điện tích (dương hoặc âm, tùy thuộc vào áp cựcđiện thế), được xem là kỹ thuật ion hóa êm dịu hơn APCI, thích hợp cho phân tích các hợpchất sinh học như protein, peptide, nucleotide… hoặc các polyme công nghiệp như polythylenglycol. Trong ESI, tại đầu ống dẫn mao quản, dưới ảnh hưởng của điện thế cao và sự hỗ trợcủa khí mang, mẫu được phun thành những hạt sương nhỏ mang tích điện tại bề mặt. Khí ởxung quanh các giọt này tạo nhiệt năng làm bay hơi dung môi ra khỏi giọt sương, khi đó, mậtđộ điện tích tại bề mặt hạt sương gia tăng. Mật độ điện tích này tăng đến một điểm giới hạn(giới hạn ổn định Rayleigh) để từ đó hạt sương phân chia thành những hạt nhỏ hơn vì lực đẩylúc này lớn hơn sức căng bề mặt. Quá trình này được lặp lại nhiều lần để hình thành nhữnghạt rất nhỏ. Từ những hạt rất nhỏ mang điện tích cao này, các ion phân tích được chuyểnthành thể khí bởi lực đẩy tĩnh điện sau rồi sau đó đi vào bộ phân tích khối. Trong kỹ thuậtESI, phân tử nhất thiết phải được biến thành chất điện ly, tan trong dung dịch dùng để phunsương. Điều này phụ thuộc vào: dung môi sử dụng, pKa của chất điện ly và pH của dung dịch.Sơ đồ tạo ion dương bằng nguồn ESI7. Kĩ thuật ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển (APCI – Atmospheric pressurechemical ionization): APCI dựa trên phản ứng ion-phân tử ở pha khí. APCI chủ yếu sử dụngcho các chất phân cực hoặc không phân cực có khối lượng phân tử dưới 1500 Da và thườngtạo ion điện tích đơn. Chất phân tích trong dung dịch được đưa trực tiếp hoặc qua cột sắc kýlỏng ở tốc độ 0,2-1,0 mL/phút vào bộ phận phun sương, tạo ra sương mỏng nhờ dòng khínitrogen tốc độ cao. Các giọt sương sau đó được làm nóng để loại dung môi và được chuyểntới một điện cực phóng hồ quang (corona needle) để ion hóa. Tại đây có sự trao đổi proton đểbiến thành ion dương [M+H]+ và trao đổi electron hoặc proton để biến thành ion âm [M–H]-.Sau đó, các ion sẽ được đưa vào bộ phân tích khối. APCI là kỹ thuật ion hóa thường được sửdụng để phân tích những hợp chất có độ phân cực trung bình, phân tử lượng nhỏ, dễ bay hơi.Sơ đồ tạo ion dương bằng nguồn APCI8. Kĩ thuật ion hóa ánh sáng ở áp suất khí quyển (APPI – Atmospheric PressurePhotoionization): APPI sử dụng các photon để ion hóa các phân tử pha khí. Mẫu trong dungdịch được bay hơi nhờ phun sương nhiệt, sau đó chất phân tích tương tác với các photon phátra từ một đèn. Các photon đó gây ra một loạt các phản ứng ở pha khí dẫn đến ion hóa mẫu.Sơ đồ tạo ion bằng nguồn APPICác kỹ thuật ion hoá như EI, CI và FI thường được sử dụng trong các máy GC/MS; còn cáckỹ thuật FAB, MALDI, ESI, APCI thường được sử dụng trong các máy LC/MS.2.3. Bộ phận phân tích khối (mass analyzer):Các ion hình thành ở nguồn ion hoá có khối lượng m và điện tích z (tỷ số m/z được gọilà số khối) sẽ đi vào bộ phận phân tích khối. Bộ phận phân tích khối được coi là quả tim củamáy khối phổ, có nhiệm vụ tách các ion có số khối m/z khác nhau thành từng phần riêng biệtnhờ tác dụng của từ trường, điện trường trước khi đến đến bộ phận phát hiện và xử lý số liệu.Có thể phân bộ phân tích khối thành 4 loại: Bộ phân tích từ; bộ phân tích tứ cực; bộphân tích thời gian bay; bộ phân tích cộng hưởng ion cyclotron.1. Bộ phân tích từ: Bao gồm thiết bị khối phổ hội tụ đơn (Single Focusing MagneticDeflection hay Sector mass analyser) và thiết bị khối phổ hội tụ kép (Double focusingmagnetic sector mass spectrometer hay double focusing sector field mass spectrometer).Các ion tr ớc khi ra khỏi buồng ion hóa đã được tăng tốc nhờ một điện trường có thế U,đi qua nam châm hình ống có từ trường H. Các ion sẽ chuyển động theo hình vòng cung bánkính r trong từ tr ờng này. Với r:2mUr=HzÆm H 2 .r 2=z2UVậy với giá trị U và H nhất định thì số khối m/z tỷ lệ với bán kính r. Từ biểu thức trênnhận thấy các ion có m/z khác nhau sẽ được tách ra khỏi nhau do giá trị r của vòng cungchuyển động của chúng khác nhau. Một máy hội tụ đơn thường có độ phân giải thấp (1000 –5000) trong khi đó thiết bị khối phổ hội tụ thường có độ phân giải rất cao (10.000 – 100.000)do bộ tách ion được thiết kế thêm 1 điện tr ờng bên cạnh từ tr ờng của nam châm. Các iontr ớc khi qua từ tr ờng hình quạt, sẽ đi qua 1 điện tr ờng tĩnh điện để tách biệt nhau một lầnnữa do vậy thiết bị khối phổ hội tụ kép có độ phân giải cao hơn so với thiết bị khối phổ hội tụđơn.Sơ đồ cấu tạo và nguyên lý phân tách các ion của thiết bị phân tích khối hội tụ đơn.Sơ đồ cấu tạo thiết bị phân tích khối hội tụ kép.2. Bộ phân tích tứ cực: Bao gồm bộ phân tích tứ cực đơn, bộ phân tích tứ cực chập bavà bẫy ion kiểu tứ cực.*Bộ tứ cực (quadrupole): Gồm có 4 cực bằng kim loại đặt song song và sát nhau. Có mộtkhoảng không giữa 4 cực để các ion bay qua. Dòng điện một chiều (DC) và điện thế xoaychiều cao tần được đặt vào từng cặp đối diện của tứ cực. Cả 2 trường đều không làm tăng tốcdòng ion từ nguồn đi ra nhưng làm chúng dao động quanh trục trung tâm khi chuyển động vàchỉ các ion có số khối nhất định mới đến bộ phận phát hiện. Các ion đi vào trường tứ cực theohướng trục z đồng thời dao động theo hướng trục x, y dưới ảnh hưởng của một trường điệntần số cao. Chỉ các dao động của các ion có m/z đặc biệt không tăng lên theo biên độ daođộng và có thể đi qua tâm tứ cực dọc theo trục. Các ion khác có biên độ dao động tăng sẽ vađập vào thành các điện cực trước khi có thể vượt qua các điện cực đi vào detector. Phươngtrình tổng quát của phổ tứ cực như sau:mV=K 2 2zr fTrong đó K: hằng số, V: điện áp tần số cao, r: khoảng cách 2 điện cực đối nhau, f: tần số daođộng ion. Bằng cách thay đổi tần số và thế của các cực, các ion có tỷ số m/z khác nhau có thểvượt qua khoảng không để đến detector với khoảng thời gian khác nhau (các ion được táchtheo số khối của chúng).Sơ đồ nguyên tắc phân tích khối của phổ kế tứ cực.Độ phân giải phổ kế tứ cực thông th ờng đạt từ 500 – 1000, muốn nâng cao Rs, thường phảinối 2 – 3 bộ tứ cực với nhau (Rs có thể đạt tới 20.000). Phổ khối tứ cực kiểu chập ba, gồm 3bộ tứ cực nối tiếp nhau Q1, Q2 và Q3. Q1 sẽ tách các ion và lựa chọn một số ion ban đầu (ionmẹ) đưa vào tứ cực Q2. Trong buồng Q2 với áp suất cao, ion mẹ bị phân mảnh do va chạmvới các khí trơ có mặt trong buồng như nitơ, agon, heli. Nhờ va chạm này năng lượng độnghọc của các ion chuyển thành nội năng nên chúng phân mảnh tiếp tạo ra các ion nhỏ hơn (ioncon). Các ion con mới hình thành được dẫn đến Q3 phân tích khối tách riêng và đến detectorSơ đồ cấu tạo thiết bị phổ kế tứ cực kiểu chập ba.*Bẫy ion tứ cực (ion trap): Hoạt động theo nguyên lý của bộ phân tích khối tứ cực, chỉ có mộtđiểm khác là các ion được lưu giữ và đưa dần ra khỏi bẫy. Các ion sau khi đi vào bẫy ion theomột đường cong ổn định được bẫy lại cho đến khi một điện áp RF được đặt trên điện cựcvòng. Các ion trở nên không ổn định, dao động có hướng đi về phía detector. Do điện áp RFkhác nhau trong hệ thống này mà thu được một phổ khối lượng đầy đủ. Các ion tồn tại trongbẫy có thể được chọn riêng và phân tích theo sự khác nhau về m/z, đồng thời có thể chọnriêng và thực hiện quá trình bắn phá để thu đượccác mảnh ion con, từ đó thực hiện phân tíchtheo m/z của ion con (khối phổ 2 lần).Về nguyên tắc các ion có thể tồn tại trong bẫy thời gianđủ lâu có thể thực hiện đến MSn lần, tuy nhiên trong thực tế thường chỉ có khả năng thực hiệnđến khối phổ 3 lần.Sơ đồ cấu tạo và phân tích khối của phổ kế bẫy ion.3. Bộ phân tích thời gian bay (Time of flight): Các ion ra khỏi buồng ion hóa được giatốc nhờ thế 10-20 kV bay qua 1 ống phân tích (không có trường điện từ) có chiều dài đến 2mcủa bộ phận phân tích khối. Phân tích thời gian bay dựa trên cơ sở gia tốc các ion tới detectorvới cùng một năng lượng. Do các ion có cùng năng lượng nhưng lại khác nhau về khối lượngnên thời gian đi tới detector sẽ khác nhau. Các ion nhỏ hơn sẽ đi tới detector nhanh hơn do cóvận tốc lớn hơn còn các ion lớn hơn sẽ đi chậm hơn, do vậy, thiết bị này được gọi là thiết bịphân tích thời gian bay do tỉ số m/z được xác định bởi thời gian bay của các ion. Thời gianbay của một ion tới detector phụ thuộc vào khối lượng, điện tích và năng lượng động học củacác ion. Độ phân giải của bộ phân tích thời gian bay thấp nhưng nó có ưu điểm là khối lượngion có thể phân tích không bị hạn chế. Để tăng độ phân giải của thiết bị có thể kéo dài thờigian bay của ion (thiết bị W-TOF) hoặc ghép nối TOF với TripleQuad hoặc iontrap.Sơ đồ nguyên tắc phân tích khối của phổ kế TOF.Phổ kế TOF đơn và TOF kép (W-TOF, TOF độ phân giải cao).4. Bộ phân tích cộng hưởng ion (Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance massspectrometry): Các ion được giữ trong một buồng cộng hưởng dưới một từ trường mạnh ởbên và một điện trường theo hướng trục. Giống như cộng hưởng từ hạt nhân, tất cả các iontrong buồng được kích thích bởi một xung tần số radio băng rộng. Các ion sẽ hấp thu nănglượng phù hợp để cộng hưởng. Các ion cùng loại khi hấp thu năng lượng (cộng hưởng)chuyển động đồng nhất tạo ra một tần số nhất định phụ thuộc vào m/z. Tất cả các tần số củacác ion tạo ra sẽ được ghi nhận dưới dạng các dao động cảm ứng tự do tắt dần theo thời gianvà sau đó được biến đổi Fourier để trở thành dạng phổ khối truyền thống.Thiết bị khối phổ FT-ICR và nguyên tắc phân tích khối.2.4. Bộ phận phát hiện (detector):Sau khi đi ra khỏi bộ phận phân tích khối lượng, các ion được đưa tới phần cuối củathiết bị khối phổ là bộ phận phát hiện ion. Bộ phận phát hiện cho phép khối phổ tạo ra một tínhiệu của các ion tương ứng từ các electron thứ cấp đã được khuếch đại hoặc tạo ra một dòngdo điện tích di chuyển. Có hai loại bộ phận phát hiện phổ biến: bộ phận phát hiện nhânelectron (electron multiplier) và bộ phận phát hiện nhân quang (photomultiplier). Bộ phậnphát hiện nhân electron là một trong những detector phổ biến nhất, có độ nhạy cao. Các ionđập vào bề mặt dinot làm bật ra các electron. Các electron thứ cấp sau đó được dẫn tới cácdinot tiếp theo và sẽ tạo ra electron thứ cấp nhiều hơn nữa, tạo thành dòng các electron. Bộphận phát hiện nhân quang cũng giống như thiết bị nhân electron, các ion ban đầu đập vàomột dinot tạo ra dòng các electron. Khác với detector nhân electron, các electron sau đó sẽ vađập vào một màn chắn phospho và giải phóng ra các photon. Các photon này được phát hiệnbởi một bộ nhân quang hoạt động như thiết bị nhân electron. Ưu điểm của phương pháp nàylà các ống nhân quang được đặt trong chân không nên loại bỏ được các khả năng nhiễm bẩn.Sơ đồ hoạt động của detector electron multiplier (trái) và photomultiplier (phải)3. Một số thông số đặc trưng của phổ khối lượng và ý nghĩa.3.1. Phổ đồ:Cách biểu diễn phổ khối lượng thông thường nhất là dùng các vạch thẳng đứng có độcao tỉ lệ với cường độ và có vị trí trên trục nằm ngang (trục hoành) tương ứng với tỉ số m/zcủa mỗi ion. Cường độ chỉ ra trên trục thẳng đứng (trục tung) là cường độ tương đối. Thôngthường người ta chọn pic mạnh nhất làm pic cơ bản và quy cho nó có cường độ là 100/100.Cường độ các pic khác được tính ra % so với pic cơ bản. Các pic được sắp xếp theo giá trịm/z từ thấp đến cao, trên một số pic có thể ghi rõ giá trị m/z.Phổ khối của ethyl benzen (MW = 106)3.2. Độ phân giải của phổ khối:Độ phân giải là khả năng tách 2 số khối liền nhau M và M + ΔM.Độ phân giải R của MS được tínhtheo công thức:MΔMNếu R càng lớn thì M và M + ΔMcàng gần nhau, nghĩa là nếu máycó R càng lớn thì có thể phân biệtcác hạt có khối lượng càng gầnnhauVí dụ : Với M = 28 có thể có bốn chất ứng với khối lượng M ≈ 28 là CO, C2H4 , N2 ,CH2N.R=Giá trị chính xác của bốn hợp chất cho ở bảng dưới.Công thứcKhối lượngCH2N28.031300C2H428.081724N228.006148CO27.994915ΔM0.0125760.0125760.0112330.0238090.0251520.036385Để phân biệt được hai tín hiệu của CH2N và CO thiết bị phải có độ phân giải:R=28M== 770ΔM 0.036385Nhưng để phân biệt được hai tín hiệu của N2 và CO thiết bị cần phải có độ phân giải:R=M28== 2493ΔM 0.011233Các thiết bị có R< 1000 là các thiết bị có độ phân giải thấp. Thiết bị có R > 10000 là các thiếtbị có độ phân giải cao. Tuỳ theo từng hãng, SOP thẩm định lắp đặt thiết bị với giá trị độ phângiải thường được tiến hành trên một chất chuẩn có M nhất định và thường xác định độ phângiải ở vị trí ½ chiều cao của pícTrường hợp chỉ có 1 ion, R được xác định tại½ chiều cao pic (FHHM) hoặc tại 5% chiềucao.Xác định độ phân giải khi có xen phủ píc.3.3. Độ chính xác phổ khối (mass accuracy):Độ chính xác phổ khối là đại lượng đo mức độ chênh lệch giữa số khối thực nghiệm của phântử và khối lượng thực:Δm = mreal − mmeasuredĐộ chính xác của phổ khối thường được biểu thị bằng giá trị ppm:ppm = 10 6 × Δm / mmeasuredVí dụ: Khối lượng lý thuyết (theoretical mass) = 1000; khối lượng đo được (measured mass)= 999.9 thì độ chính xác phổ khối hoặc độ sai lệch phổ khối (mass error) = 100ppmGiá trị độ chính xác phổ khối có mối quan hệ với giá trị độ phân giải. Một thiết bị có độ phângiải thấp thì không thể có độ chính xác phổ khối cao được.Phổ khối của cùng một mẫu thử đo với thiết bị có độ phân giải thấp (trái) và độ phân giải cao (phải)3.4. Phổ khối của các ion nguyên tử đồng vị:Đa số các nguyên tố trong thiên nhiên gồm hỗn hợp nhiều đồng vị. Do đó các ion phân tửngoài tín hiệu của ion M+ còn có các ion phân tử có khối lượng [M-1]+, [M+1]+ , [M+2]+…làm cho khối phổ có nhiều tín hiệu lân cận M+. Các nguyên tử đồng vị của một nguyên tố cócùng số điện tích hạt nhân, chỉ khác nhau về số nơtron trong nhân do đó khác nhau về khốilượng nguyên tử. Vì tính chất của các đồng vị tuyệt đối giống nhau, nên hàm lượng tương đốicác đồng vị của một nguyên tố trong các hợp chất hóa học cũng giống như bản thân nguyên tốđó. Do vậy các nguyên tố tinh khiết như 19F, 31P, 127I trên phổ đồ chỉ có 1 vạch, nguyên tố C(12C và 13C) trên phổ đồ có 1 vạch chính (tương ứng với 12C) sẽ có 1 vạch bên cạnh (m/z+1,tương ứng với 13C), các nguyên tố Cl (35Cl và 17Cl), Br (79Br và 81Br) trên phổ đồ sẽ tồn tại 2vạch cạnh nhau (m/z và m/z+2).Phổ đồ của Benzen (vạch đồng vị Carbon) Phổ đồ của Benzyl chloride (vạch đồng vị Cl)3.5. Phổ khối của các ion đa điện tích:Thiết bị khối phổ hoạt động dựa trên đo tỷ số khối lượng chia điện tích (m/z). Phổ khốithường được gán bởi mảnh đơn/1 điện tích. Tuy nhiên đối với một số hợp chất (các peptid,protein…) và một số kỹ thuật ion hoá như ESI, laser… thì ion phân tử có thể mang nhiều điệntích khi đó: mảnh khối ứng với điện tích đơn là M/z, mảnh khối ứng với điện tích đôi là[M+1]/(z+1), với điện tích 3 là [M+2]/(z+2)…Phổ đồ myoglobin tim ngựaXác định số khối tương ứng với các ion đa điện tích dựa vào: tính chất của chất cần phân tích(nếu biết); đặc điểm của thiết bị khối phổ và kỹ thuật ion hoá; dựa vào các vạch phổ chínhtrên phổ đồ và các vạch phổ đồng vị. Ví dụ, với trường hợp đơn điện tích thì vạch đồng vị củaC hơn kém nhau 1,0 amu, đối với trường hợp điện tích đôi vạch đồng vị của C sẽ hơn kémnhau 0,5 amu.4. Một số kỹ thuật ghi phổPhổ khối 1 lần (MS) và phổ khối nhiều lần (2 lần – MS/MS): Trong phân tích khổ phối,việc xác định chính xác 1 ion (M+ hay các chất phân mảnh) rất quan trọng cho việc xác địnhđược hợp chất cần phân tích. Một hợp chất xác định trong những điều kiện nhất định sẽ cho 1ion có số khối xác định trên phổ đồ. Tuy nhiên, một ion có số khối xác định trên phổ đồ lại cóthể xuất phát từ nhiều hợp chất khác nhau. Trong phân tích một hỗn hợp bằng phương phápsắc ký – khối phổ, nếu điều kiện sắc ký chưa đảm bảo việc phân tách thì việc nhận định cácion thông qua số khối trên phổ đồ có thể bị ảnh hưởng. Đối với những trường hợp này, MSmột lần có thể cho kết quả không chính xác so với kỹ thuật khối phổ nhiều lần do có tính chọnlọc khối cao hơn.Giản đồ so sánh khối phổ 1 lần (MS) và khối phổ 2 lần (MS/MS)Hình vẽ dưới là ví dụ cho thấy cần chất phân tích và tạp chất có cùng số khối (m/z = 325)song có cơ chế phân mảnh khác nhau. Nếu phân tích bằng sắc ký – khối phổ 1 lần với điềukiện sắc ký mà hai chất đồng rửa giải thì sẽ không xác định được phân biệt trên khối phổ 1 lần(MS) chỉ có thể phân biệt được trên khối phổ 2 lần (MS/MS).4.1. Quét toàn phổ (Full Scan)Khi thao tác với chế độ scan, MS sẽ nhận được tất cả các mảnh ion để cho phổ đồ toànion đối với tất cả các chất trong suốt quá trình phân tích. Thường dùng để nhận danh hay phântích khi chất phân tích có nồng độ đủ lớn. Đối với MS tứ cực chập ba, chế độ Full scan MSthường được lựa chọn để khảo sát ion mẹ, chế độ Full scan MS/MS quét tất cả các ion con tạothành thường được sử dụng để xác định ion con cho tín hiệu ổn định và bền nhất.Cơ chế ghi phổ full scan MS của phổ kế tứ cựcCơ chế ghi phổ full scan MS/MS của phổ kế tứ cực chập ba.4.2. Selected Ion Monitoring (SIM)Trong chế độ SIM, MS chỉ ghi nhận tín hiệu một số mảnh ion đặc trưng cho chất cần xácđịnh. Phổ đồ SIM chỉ cho tín hiệu của các ion đã được lựa chọn trước đó, do vậy không thểdùng để nhận danh hay so sánh với các thư viện có sẵn. Đối với MS tứ cực chập ba, chế độSIM thường được lựa chọn để khảo sát năng lượng phân mảnh khi đã biết ion mẹ.Cơ chế ghi phổ SIM của phổ kế tứ cực.4.3. SRM (Selected Reaction Monitoring) và MRM (Multiple Reaction Monitoring)Đối với MS tứ cực chập ba, là máy đo khối phổ hai lần liên tiếp (MS/MS), 2 kỹ thuật ghi phổMS/MS có độ nhạy cao thường được sử dụng là SRM và MRM.+ SRM: cô lập ion cần chọn, sau đó phân mảnh ion cô lập đó, trong các mảnh ion sinhra, cô lập 1 mảnh ion con cần quan tâm và đưa vào đầu dò để phát hiện.+ MRM: trên thực tế, do yêu cầu về mặt kỹ thuật đối với phân tích vi lượng nên cácion con cần quan tâm thường từ 2 trở lên, do vậy kỹ thuật ghi phổ MRM thông dụng hơnSRM. Đầu tiên, cô lập ion cần chọn (ion mẹ) ở tứ cực thứ nhất, phân mảnh ion cô lập đó tại tứcực thứ 2 (thực chất là buồng va chạm) thu được các ion con, cô lập 2 (hoặc nhiều) ion concần quan tâm ở tứ cực thứ 3 và đưa vào đầu dò để phát hiện.Cơ chế ghi phổ SRM của phổ kế tứ cực chập ba.5. Một số ứng dụng cơ bản của phương pháp khối phổ5.1. Xác định khối lượng nguyên tử và khối lượng phân tử* Xác định nguyên tử các đồng vị: Phổ khối lượng ban đầu được dùng để xác định khối lượngnguyên tử của các đồng vị. Dùng máy phổ khối lượng người ta xác định được không nhữngkhối lượng mà cả hàm lượng % của các đồng vị. Đại đa số các đồng vị đã được tìm ra và đượcxác định bằng phương pháp phổ khối lượng. Ví dụ: Khi khảo sát khí xenon bằng phương phápphổ khối lượng ta tìm được 9 đồng vị với hàm lượng tự nhiên giảm dần theo trật tự sau: 123Xe,129Xe, 131Xe, 134Xe, 136Xe, 130Xe, 128Xe, 124Xe, 126Xe.* Xác định khối lượng phân tử: Nếu ion phân tử tạo ra mà đủ bền thì khối lượng phân tử đượcxác định trực tiếp từ các pic có giá trị m/z cao nhất và có cường độ không phụ thuộc vào ápsuất. Có những trường hợp mà khối lượng phân tử không thể xác định được bằng các phươngpháp thông thường (do đặc điểm của chất, hoặc do lượng chất quá ít...) thì phương pháp phổkhối lượng là giải pháp tối ưu. Ví dụ nhờ có pic ion phân tử trong phổ khối lượng người ta đãxác định được Fe(CO)4(CF2CF2CF2CF2) không ở dạng polime mà là monome với M=368u.Đối với trường hợp hợp chất không đủ bền, bằng cách sử dụng các kỹ thuật ion hoá khácnhau, ion hoá mềm, giảm năng lượng ion hoá và phân rã người ta cũng có thể xác định đượckhối lượng phân tử trong một số trường hợp.5.2. Xét đoán cấu trúc phân tửPhân tích khối phổ có thể cho rất chính xác khối lượng các ion phân tử M+ và khốilượng các mảnh ion. Bên cạnh cũng xác định được đó xem xét thêm các pic đồng vị [M+1]+,[M+2]+ và tỷ số cường độ của chúng cùng so với M. Đồng thời thông qua phân tích phổ cũngxác định được hiệu số khối lượng của ion phân tử và các mảnh ion cũng như thế hiệu xuấthiện các mảnh ion. Từ các thông tin này có thể xác định được công thức nguyên của chấtphân tích. Sau khi phân tích định tính công thức nguyên của chất phân tích cần phải tiếp tụcnghiên cứu kỹ hơn phổ khối và kết hợp với phổ cộng hưởng từ hạt nhân và phổ IR,… để xácđịnh công thức cấu tạo của chất phân tích.Một số ví dụ, nguyên tắc xét đoán công thức nguyên dựa vào phổ khối lượng:-Nếu gặp pic [M+1]+ có cường độ bằng 3,3% cường độ của M+ thì ta có thể suy đoántrong phân tử có 3 nguyên tử C, ion [M+1]+ do sự đóng góp của 13C, vì hàm lượng của13C trong tự nhiên là 1,1% và cường độ của pic [M+1]+ gần bằng n.1,1% (nếu số Ctrong hợp chất là n).-Nếu trên phổ đồ có các pic m/z = 94 và m/z = 96 có cường độ gần bằng nhau, ta có thểnghĩ các pic này tương ứng với phân tử CH3Br vì 79Br (50,54%), 81Br(49,96%).Ví dụ: Quá trình xét đoán công thức nguyên của chất cần phân tích dựa trên khối phổ5.3. Ứng dụng của phương pháp khối phổ trong kiểm nghiệm thuốcĐặc tính nổi bật của khối phổ là tính chọn lọc và độ nhạy cao. Vì vậy mà khối phổthường được sử dụng để xác định lượng siêu vết trong mẫu có thành phần phức tạp như địnhtính, định lượng thuốc và các chất chuyển hoá trong dịch sinh học, độc chất học; định lượngdư lượng thuốc trừ sâu, chất bảo quản, chất cấm trong các mẫu thực phẩm, mỹ phẩm, dượcliệu, thuỷ hải sản và môi trường…-Định tính: Tiến hành so sánh phổ của chất cần phân tích so với phổ chuẩn trong thưviện phổ hoặc so với phổ của chất chuẩn.-Định lượng: Dựa vào tương quan đáp ứng của mẫu thử so với đáp ứng của mẫu chuẩnđã biết nồng độ.Ngoài ra, phương pháp khối phổ còn có thể được sử dụng để xác định mức độ tinhkhiết của chất chuẩn hoặc mẫu chất cần phân tích.5.4. Ứng dụng của phương pháp khối phổ trong công nghệ sinh học* Peptid Mass Fingerprinting (PMF):Cả ba protein 1, 2, 3 đều có cùng số khối (m/z = 4842.5) nhưng có trật tự sắp xếp các acidamin khác nhau. Do vậy khi sử dụng các emzym cắt phù hợp hoặc sử dụng năng lượng phânmảnh phù hợp các protein này sẽ phân mảnh thành các ion con có số khối khác nhau đặctrưng cho mỗi chất, do vậy thông qua phổ khối có thể nhận dạng và định danh được từngprotein.* Proteomic và Peptid Sequencing:6. Xây dựng phương pháp LC/MS với thiết bị khối khổ kiểu tứ cực chập ba (TSQ)Để định tính, định lượng thuốc trong dịch sinh học, trong mẫu độc chất, cũng như xácđịnh dư lượng chất cấm trong các mẫu thuỷ hải sản, thực phẩm, dược liệu và môi trường, cácphòng thí nghiệm thường sử dụng thiết bị TSQ với nguồn ion hoá kiểu API (Ion hóa áp suấtthường năng lượng thấp - Atmospheric Pressure ionization - low energy) ghép nối với thiết bịHPLC hoặc UPLC do một số ưu điểm sau:GC-MS:•Hợp chất bay hơi;•Lưu lượng khí 1-5mL/min;•Phân cực thấp;•Nguồn ion háo năng lượng cao (va chạm điện tử Electron Impact ionization - EI, gâyphân mảnh tại nguồn ion).LC-MS:•Hợp chất không bay hơi không bền nhiệt;•Phân cực trung bình đến cao;•Tốc độ dòng 1mL/min (tương ứng lưu lượng khí 1.000mL/min);•Ion hóa áp suất thường năng lượng thấp (ion hoá mềm, không gây phân mảnh tạinguồn ion) thường sử dụng nguồn ESI hoặc APCI.Phạm vi ứng dụng của GC và LC và các nguồn ion hoá.Do đặc điểm của ghép nối LC và MS, dòng ra của LC không được kết nối trực tiếpvào MS mà thông qua bộ giao diện và nguồn ion hoá, do vậy việc sử dụng điều kiện sắc ký vànguồn ion hoá phụ hợp cho hiệu suất ion hoá cao, vừa có tác dụng loại bỏ tạp chất, không làmpha loãng mẫu cũng như chuyển lượng mẫu tối đa và MS sẽ quyết định rất nhiều đến độ đặchiệu đặc biệt là độ nhạy của thiết bị và phương pháp.-Khi kết nối LC - MS xây dựng các điều kiện HPLC cần lưu ý các điểm sau:o Dung môi pha động không chứa các thành phần đệm vô cơ; chỉ chứa các thànhphần đệm dễ bay hơi, có sức căng bề mặt thấp.o Tốc độ dòng pha động để ở mức tối ưu nhỏ nhất nếu có thể. Tốc độ dòng phađộng càng cao, thì tốc độ khí cung cấp cho nguồn ion hoá để bay hơi dung môicàng phải lớn Æ ảnh hưởng đến khả năng chuyển mẫu vào MS (quá trìnhchuyển mẫu vào MS đối với nguồn ion hoá phun sương chủ yếu thực hiện theonguyên tắc chênh lệch áp suất)o Tỉ lệ nước, các chất trong pha động càng cao, thì cần thiết phải cung cấp nhiệtcho nguồn ion hoá để hỗ trợ quá trình bay hơi dung môi.o Đối với các mẫu phức tạp có thể ra hiện tượng suy giảm hiệu suất ion hoá củanguồn ion (ion suppression – matrix effect) của các tạp chất đồng rửa giải. Dovậy, nên lựa chọn được các điều kiện sắc ký có thể phân tách chất đồng rửagiải gây ảnh hưởng nếu có.-Lựa chọn nguồn kiểu nguồn ion hoá cần căn cứ vào các đặc điểm như:o Khối lượng, mức độ phân cực khả năng ion hoá, khả năng solvat hoá, tạo cặpion, …của chất cần phân tích (phân tử lượng lớn, độ phân cực cao nên lựachọn nguồn ESI, phân tử lượng nhỏ, độ phân cực trung bình có thể lựa chọnnguồn APCI);o Đặc điểm của dung môi pha động: Lực ion, sức căng bề mặt, khả năng bay hơicủa pha động, pH, thành phần tỷ lệ của pha động, tỷ lệ của nước trong phađộng, tốc độ dòng pha động,…-Lựa chọn kiểu khối phổ MS hoặc MS-MS: Căn cứ vào đặc điểm của hoạt chất cầnphân tích, phương pháp xử lý mẫu và nền mẫu, yêu cầu định tính hay định lượng.* Các thông số cần tối ưu hoá đối với phương pháp LC-MS:-Nguồn ion hoá:+ Thế ion hoá;+ Tốc độ khí của nguồn ion hoá (khí mang, khí bổ trợ, khí làm sạch nguồn);+ Nhiệt độ của nguồn ion hoá.-Nhiệt độ mao quản chuyển ion hoá;-Thế của bộ phận hội tụ nguồn ion;-Ion ban đầu (mảnh mẹ);-Năng lượng để phân mảnh ion mẹ tạo thành ion con.-Ảnh hưởng của nền mẫu.B. Thực hànhXÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG AMLODIPIN TRONG DỊCH SINHHỌC BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC-MS/MS.1.Thực hành quy trình tối ưu hoá các điều kiện sắc ký - khối phổ cho hoạt chất Amlodipinvà nội chuẩn.2.Tiến hành phân tích các mẫu chuẩn amlodipin trong huyết tương người bằng phươngpháp HPLC-MS/MS (dựng đường tuyến tính, đánh giá độ đúng, độ chính xác trongngày).QUY TRÌNH PHÂN TÍCHĐiều kiện sắc ký:Thiết bị phân tích: Thermo, VKN/TĐSH/53.02Cột sắc ký: EC 50/2 nuclodur C18. Bảo vệ cột: Rp18, 4 x 3mmTốc độ dòng: 0,4 mL/pPha động: MeCN: MeOH: 2-propanol: CH3COONH4Thể tích tiêm: 10 µLDetector: TSQ quantum ultraNội chuẩn Felodipin gốc: Cân chính xác khoảng 25 mg Felodipine, hoà tan trong 100 mLMeOH (A).Hút 1 mL (A)/50 mL MeOH : H2O (1:1) (B). Hút 1 mL (B)/20 mL MeOH : H2O(1:1).Chuẩn Amlodipine gốc: Cân chính xác khoảng 35 mg Amlodipine besilat, hòa tan trong 100mL MeOH (A).Dung dịch chuẩn làm việc: Hút 1 mL (A)/ 50 mL MeOH : H2O (1:1) (B). Hút 2 mL (B)/100mL H2O (100ng/mL).Chuẩn bị các dung dịch chuẩn trong nướcMẫuBlankZeroS1S2S3S4S5S6S7S812510205075100(-)Nồngđộ(ng/mL)V HT trắng(mL)Vbình(mL)0011124101500100502020202020Chuẩn bị mẫu kiểm tra trong nướcChuẩn bị tương tự như mẫu chuẩn làm việc để có được dung dịch WSQC có nồng độAmlodipine khoảng 100 ng/mL H2O.MẫuLQCMQCHQCNồng độ (ng/mL)34080VWSQC (mL)3816Vbình (mL)1002020Chuẩn bị đường chuẩn và mẫu kiểm tra QC trong HT: Phối hợp dung dịch chuẩn và mẫuQC trong nước với HT theo tỷ lệ 1 : 9Xử lý mẫu:1mL HT + 100µL IS. Lắc xoáy 5s. Thêm 0,5mL NH3 0,1M. Lắc xoáy 15s. Thêm 6,5 mLdung môi diethylether: cloroform (7:3). Lắc cơ học 10 phút. Ly tâm 4000 vòng/phút x 5 phút.Hút 5mL dung môi cô N2. Hòa tan cắn trong 0,3 mL pha động rồi tiêm sắc ký.

Tài liệu liên quan

Tài liệu CHƯƠNG 13: PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN KHỐI LƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP ĐO ĐIỆN LƯỢNG ppt
- 51
- 1
- 6
Báo cáo " Nghiên cứu cấu trúc của fucoidan có hoạt tính gây độc tế bào tách từ rong nâu Sargassum swarzii bằng phương pháp phổ khối nhiều lần " ppt
- 8
- 694
- 9
Báo cáo " Nghiên cứu cấu trúc của hai thiosemicacbazon và phức chất Ni(II) của chúng bằng phương pháp phổ khối lượng và cộng hưởng từ hạt nhân " pptx
- 5
- 563
- 2
Sơ lược lịch sử phát triển của phương pháp phổ khối lượng
- 1
- 2
- 5
Phổ khối lượng mass spectrometry
- 47
- 658
- 0
phương pháp phổ khối lượng
- 116
- 1
- 11
Phương pháp phổ khối lượng (MS) trong phân tích cấu trúc hoá lý
- 51
- 3
- 20
Phương pháp phổ khối lượng potx
- 6
- 437
- 3
Nghiên cứu vận dụng phương pháp tính khối lượng khí thải gây ô nhiễm hàng năm vào môi trường không khí
- 105
- 408
- 0
phương pháp bóc khồi lượng công trình
- 6
- 600
- 3