Xemtailieu Tải về Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và ph đến khả năng thủy phân protein của hệ enzyme protease trong dịch chiết đầu tôm thẻ chân trắng
i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành được đề tài này, em đã nhận được sự giúp đỡ từ nhiều phía. Trước hết, em xin ghi công ơn của cha mẹ em và người thân đã luôn luôn bên cạnh em, giúp đỡ em vượt qua khó khăn trong suốt thời gian học đại học. Em sẽ mãi ghi nhớ công lao của thầy cô trong trường Đại học Nha Trang, đặc biệt các thầy cô trong khoa chế biến đã giúp em những kiến thức chuyen ngành cơ bản nhưng rất cần thiết sau khi ra trường. Em xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đối với thầy T.S Nguyễn Minh Trí, Th.S Ngô Hoài Dương người đã trực tiếp hướng dẫn, thôi thúc và tận tình chỉ bảo, cho em những lời khuyên hữu ích trong suốt thời gian em thực hiện đề tài. Em cũng xin gửi lời cảm ơn tới các Thầy Cô quản lí phòng thí nghiệm cũng như viện công nghệ sinh học đã nhiệt tình, tạo điều kiện thuận lợi cho cho em trong suốt thời gian thực tập. Cuối cùng em xin cảm ơn các bạn bè của em, những người không những động viên mà còn cùng sát cánh với em trong quá trình thực hiện đề tài cho đến khi chỉnh sửa bài cuối cùng. Sinh viên Nguyễn Hoàng Bảo Trung. ii MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN ..................................................................................................... i DANH MỤC BẢNG ......................................................................................... iv DANH MỤC HÌNH ........................................................................................... v Chương I. ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................... 1 Chương II. TỔNG QUAN .................................................................................. 3 2.1. TỔNG QUAN VỀ TÔM THẺ CHÂN TRẮNG: [35]................................ 3 2.1.1. Cấu tạo chung của tôm: ...................................................................... 3 2.1.2. Thành phần hóa học của tôm .............................................................. 4 2.1.2.1. Protein........................................................................................ 4 2.1.2.2. Nước .......................................................................................... 5 2.1.2.3. Vitamin và các chất khoáng........................................................ 5 2.1.2.4. Các sắc tố................................................................................... 5 2.1.2.5. Các chất ngấm ra........................................................................ 6 2.2. TÌNH HÌNH KHAI THÁC, NUÔI TRỒNG, CHẾ BIẾN TÔM................. 6 2.3. TỔNG QAN VỀ ENZYME PROTEASE ................................................. 7 2.3.1. Giới thiệu chung [3] ........................................................................... 7 2.3.2. Phân loại protease .............................................................................. 9 2.3.3. Nguồn thu nhận protease [32]........................................................... 11 2.3.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ phản ứng của enzyme [3] ............. 11 2.4. CÁC NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC: .............................. 14 2.5. ỨNG DỤNG PROTEASE...................................................................... 16 Chương ΙII. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................... 19 3.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ................................................................ 19 3.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU........................................................... 19 3.2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát: .................................................... 19 3.2.1.1. Xử lí đầu tôm: .......................................................................... 21 iii 3.2.1.2. Thủy phân dịch chiết từ đầu tôm: ............................................. 22 3.2.2. Bố trí thí nghiệm: ............................................................................. 24 Chương IV: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BIỆN LUẬN................................ 28 4.1.Ảnh hưởng của pH môi trường, thời gian ủ đến hoạt độ của enzyme protease trong dịch chiết từ đầu tôm thẻ chân trắng ở các nhiệt độ khác nhau......... 28 4.1.1.Ảnh hưởng của pH môi trường, thời gian ủ đến hoạt độ của enzyme protease trong dịch chiết từ đầu tôm thẻ chân trắng ở 40°C........................ 28 4.1.2 Ảnh hưởng của pH môi trường, thời gian ủ đến hoạt độ của enzyme protease trong dịch chiết từ đầu tôm thẻ chân trắng ở 50°C........................ 29 4.1.3 Ảnh hưởng của pH môi trường, thời gian ủ đến hoạt độ của enzyme protease trong dịch chiết từ đầu tôm thẻ chân trắng ở 60°C........................ 30 4.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian ủ đến hoạt độ của enzyme protease trong dịch chiết từ đầu tôm thẻ chân trắng ở các pH khác nhau ..................... 32 4.2.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian ủ đến hoạt độ của hệ enzyme protease trong dịch chiết từ đầu tôm thẻ chân trắng ở pH=3....................... 33 4.2.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian ủ đến hoạt độ của hệ enzyme protease trong dịch chiết từ đầu tôm thẻ chân trắng ở pH=6 ...................... 34 4.2.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian ủ đến hoạt độ của hệ enzyme protease trong dịch chiết từ đầu tôm thẻ chân trắng ở pH=8 ...................... 35 4.3 Đánh giá mức ảnh hưởng của yếu tố nhiệt độ và pH đến khả năng thủy phân của hệ protease có trong dịch chiết đầu tôm thẻ chân trắng bằng kiểm định thống kê ANOVA .................................................................................. 37 KẾT LUẬN VÀ Ý KIẾN ĐỀ XUẤT................................................................ 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................ 40 PHỤ LỤC iv DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 2.1: Thành phần khối lượng của tôm thẻ (%).................................................. 3 Bảng 2.2: Thành phần hóa học cơ bản của đầu tôm [23] .......................................... 4 Bảng 2.3: Thành phần khoáng trong thịt tôm (mg %) .............................................. 5 Bảng 3.1: Khảo sát khả năng thủy phân của hệ enzyme protease ở 400C ............... 26 Bảng 3.2: Khảo sát khả năng thủy phân của hệ enzyme protease ở 500C ............... 26 Bảng 3.3: Khảo sát khả năng thủy phân của hệ enzyme protease ở 600C ............... 27 Bảng 3.4: Khảo sát khả năng thủy phân của hệ enzyme protease ở 700C ............... 27 v DANH MỤC HÌNH Trang Hình 3.1: Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát .......................................................20 Hình 3.2: Sơ đồ quy trình xử lí đầu tôm.............................................................21 Hình 3.3: Sơ đồ quy trình thủy phân dịch chiết đầu tôm. ...................................23 Hình 3.4: Bố trí thí nghiệm xác định khả năng thủy phân của hệ protease trong dịch chiết đầu tôm thẻ chân trắng. ............................................................25 Hình 4.1: Ảnh hưởng của pH môi trường, thời gian ủ đến hoạt độ của enzyme protease trong dịch chiết từ đầu tôm thẻ chân trắng ở 40°C ...............................28 Hình 4.2 : Ảnh hưởng của pH môi trường, thời gian ủ đến hoạt độ của enzyme protease trong dịch chiết từ đầu tôm thẻ chân trắng ở 50°C ..................30 Hình 4.3: Ảnh hưởng của pH môi trường, thời gian ủ đến hoạt độ của enzyme protease trong dịch chiết từ đầu tôm thẻ chân trắng ở 60°C ..................31 Hình 4.4: Ảnh hưởng của pH môi trường, thời gian ủ đến hoạt độ của enzyme protease trong dịch chiết từ đầu tôm thẻ chân trắng ở 70°C ..................31 Hình 4.5: Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian ủ đến hoạt độ của hệ enzyme protease trong dịch chiết từ đầu tôm thẻ chân trắng ở pH=3 .................33 Hình 4.6: Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian ủ đến hoạt độ của hệ enzyme protease trong dịch chiết từ đầu tôm thẻ chân trắng ở pH=6 .................34 Hình 4.7: Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian ủ đến hoạt độ của hệ enzyme protease trong dịch chiết từ đầu tôm thẻ chân trắng ở pH=8 ..............................35 1 Chương I. ĐẶT VẤN ĐỀ Trong những năm gần đây, chế biến thủy sản được coi là hướng phát triển mũi nhọn của nền kinh tế biển. Trong đó, tôm là một mặt hàng có giá trị dinh dưỡng cũng như giá trị kinh tế cao. Kim ngạch xuất khẩu từ các mặt hàng tôm ngày càng tăng. Do đó, đây là mặt hàng đã, đang và sẽ mang lại lợi ích vô cùng lớn cho nền kinh tế quốc dân. Sản lượng tôm xuất khẩu của năm 2010 đạt 241.000 tấn, tăng 13,4% so với năm 2009 và mang về hơn 2 tỷ USD [35]. Chúng ta tăng sản lượng sản phẩm chế biến từ tôm cũng đồng nghĩa với việc một lượng lớn phế liệu tôm được thải ra môi trường bên ngoài. Nếu không có hướng giải quyết thích hợp thì đây sẽ là một thảm họa nghiêm trọng đối với môi trường, đồng thời chính các doanh nghiệp cũng phải bỏ ra chi phí không nhỏ cho việc xử lí thải bỏ, thậm chí còn dẫn đến việc đóng cửa do không đủ năng lực giải quyết vấn đề ô nhiểm, gây ra nhiều hệ lụy về mặt kinh tế, xã hội tiếp sau đó. Đứng trước tình hình bức thiết của các doanh nghiệp chế biến tôm, hiện nay đã có nhiều nghiên cứu tận dụng nguồn phế liệu tôm đã được ứng dụng trong thực tế sản xuất: sản xuất chitin, chitosan, glucosamin, sản xuất xác chất khoáng, tận thu protein… Hàm lượng proteine chứa trong phế liệu tôm rất lớn gần 50% [23], tuy nhiên người ta chỉ mới thực hiện việc tận thu proteine đơn thuần (xay, nghiền phế liệu rồi phơi khô hay ép láy dịch rồi đi sấy khô làm thức ăn cho gia súc) hay thực hiện tận thu kết hợp với quy trình sản xuất khác… chính những điều này làm cho chất lượng proteine thu được không cao, chúng thường bị mất các đặc tính sinh học. Nhằm hướng đến việc tận thu nguồn các chất có giá trị sinh học từ đầu tôm: - Protein, các peptone, peptid có hoạt tính sinh học có lợi. - Tận thu dịch đạm acid amin. 2 - Ứng dụng sản xuất chitin, chitosan theo phương pháp hóa sinh, nhằm nâng cao chất lượng sản phẩm thu hồi. - Nghiên cứu hiệu quả tương tác với các enzyme bổ sung từ bên ngoài vào trong các quá trình tận thu. Trên cơ sở hướng nghiên cứu nêu trên, trong giới hạn của đề tài, em tiến hành nghiên cứu ‘Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến khả năng thủy phân protein của hệ enzyme protease trong dịch chiết đầu tôm thẻ chân trắng’ 3 Chương II. TỔNG QUAN 2.1. TỔNG QUAN VỀ TÔM THẺ CHÂN TRẮNG: [35] Tôm thẻ chân trắng (Tên tiếng Anh: White Leg shrimp) được phân loại như sau: Ngành: Arthropoda Lớp: Crustacea Bộ: Decapoda Họ chung: Penaeidea Họ: Penaeus Fabricius Giống: Penaeus Loài: Penaeus vannamei. 2.1.1. Cấu tạo chung của tôm: Tôm gồm hai phần, phần trước là đầu và ngực, phần sau là thân. Đầu tôm có cấu tạo nguyên thủy, mắt có cuống, chân có đốt, có hai đôi râu xúc giác, phần ngực được bao bọc bằng giáp đầu ngực, ba đôi chân đầu tiên được biến hóa thành chân hàm dung để đón thức ăn, năm đôi chân ngực còn lại dung để làm chân bò. Phần thân gồm có bảy đốt, có bảy đôi chân phân thành hai nhánh. Đốt cuối cùng hợp với chân bơi tạo thành đuôi để tạo nên bánh lái trong quá trình di chuyển. Bảng 2.1: Thành phần khối lượng của tôm thẻ (%) Thành phần khối lượng (%) Tôm thẻ Thịt tôm Đầu Vỏ 60.00 31.00 9.00 4 2.1.2. Thành phần hóa học của tôm Thành phần hóa học của tôm bao gồm protein, lipid, tro, nước, vitamin, enzyme, muối vô cơ, glucid. Nhũng thành phần tương đối nhiều là nước, protein và một số muối vô cơ. Thành phần hóa học khác nhau tùy theo giống loài, trong những hoàn cảnh sinh sống khác nhau thì thành phần cũng khác nhau, ngoài ra chúng còn tùy thuộc vào trạng thái sinh lí, đực cái, mùa vụ, thời tiết… Sự khác nhau về thành phần hóa học của tôm và sự biến đổi của chúng làm ảnh hưởng đến mùi vị, đến giá trị dinh dưỡng của sản phẩm, đến việc bảo quản tươi nguyên liệu trong quá trình chế biến. Bảng 2.2: Thành phần hóa học cơ bản của đầu tôm [23] Thành phần hóa học cơ bản của đầu tôm (%) Đầu tôm thẻ Protein Khoáng Lipid 47,4±1,8 24,6±0,8 4,7±0,3 2.1.2.1. Protein Protein là thành phần chủ yếu trong thịt tôm, nó chiếm khoảng 70-80% tỉ lệ thịt theo chất khô. Proten trong tôm còn liên quan đến các chất hữu cơ, vô cơ khác tạo thành các chất có đặc tính sinh học đặc trưng khác nhau. Tùy theo loại tôm, mùa vụ, trạng thái sinh lí mà hàm lượng protein thay đổi trong khoảng 18-23%. Protein trong tôm có thể chia thành hai nhóm sau: - Chất cơ hòa tan (tương cơ): Bao gồm các chất sau: Actin, myozyn, troponyozyn, actonyozyn, chúng chiếm 70-80% hàm lượng protein và chúng có thể tan trong các dung dịch muối trung tính và nồng độ ion khá cao. 5 Ngoài ra còn có myoabumin, globumin và các enzyme, chúng chiếm từ 20-25% hàm lượng protein, chúng hòa tan trong dung dịch muối trung tính có nồng độ ion thấp. - Chất cơ bản: Colagen và elastin: chiếm khoảng hơn 3% hàm lượng protein liên kết, trong đó có khoảng 2,5% không hoàn thiện. 2.1.2.2. Nước Trong tôm hàm lượng nước chiếm tương đối cao từ 70-85%. Vì vậy thân tôm trở nên bóng và mềm mại tăng tính cảm quan, tuy nhiên cũng chính vì thế mà tôm dễ bị dập nát trong quá trình vận chuyển cũng như là môi trường thuận lợi cho enzyme và vi sinh vật phát triển. 2.1.2.3. Vitamin và các chất khoáng Lượng vitamin và các chất khoáng của tôm đặc trưng theo loại và sự biến đổi của mùa vụ, nhưng nhìn chung thì giàu vitamin A, B… Về mặt chất khoáng thì tôm được xem là nguồn quí về calcium, phospho, đồng và sắt. Bảng 2.3: Thành phần khoáng trong thịt tôm (mg %) Thành phần khoáng (mg %). Ca Phosphor Fe Ne K 29-50 53-67,6 1,2-5.1 11-127 127-565 Mg Cu 0,0412 332 2.1.2.4. Các sắc tố Tôm chứa nhiều sắc tố khác nhau nhưng chủ yếu là astaxanthin, là dẫn xuất của canden. Trong thành phần vỏ tôm, astaxanthin tham gia vào thành phần của lipoprotein gọi là cianin. Ngoài ra trong tôm người ta còn phân li được sắc tố tím và đen là tiền astaxanthin và tetraxanthin. 6 2.1.2.5. Các chất ngấm ra Các chất ngấm ra chủ yếu là các chất chứa nitơ, là các chất tan được trong nước, phân tử lượng thấp, chứa nitơ với bản chất phi protein. Hàm lượng chất ngấm ra chiếm khoảng 2-3% thịt tôm tươi. Lượng chất ngấm ra đứng về mặt dinh dưỡng không lớn lắm nhưng đứng về mặt sinh lí, tạo mùi, nó đóng vai trò rất quan trọng bởi vì nó quyết định đến mùi vị đặc trưng cho sản phẩm. Chất ngấm ra dễ bị vi sinh vật tác dụng gây thối rửa làm giảm khả năng bảo quản nguyên liệu. Tốc độ phân hủy các nguyên liệu nhanh hay chậm cũng do tính chất và số lượng chất ngấm ra trong nguyên liệu quy định. Nhóm phiprotein chứa khá nhiều các acid amin tự do như albumin, luciene, acid alphatic, arinine, tyrosine. 2.2. TÌNH HÌNH KHAI THÁC, NUÔI TRỒNG, CHẾ BIẾN TÔM Bờ biển Việt Nam dài 3.444 km với vùng đặc quyền kinh tế 1.000.000 km2 rất thuận lợi để phát triển nuôi trồng và đánh bắt thủy sản. Theo thống kê, tổng diện tích nuôi tôm trên cả nước đã tăng từ 327.194 ha năm 2005 đến 381.728 ha năm 2008 [19]. Và trong tương lai diện tích này có xu hướng tăng do nhu cầu của ngành ngày càng cao. Đặc biệt là khu vực Đồng Bằng Sông Cửu Long, trong đó lớn nhất là các tỉnh Cà Mau (với 93.920 ha), Bạc Liêu (với 63.984 ha), Sóc Trăng (với 54.250 ha) [19]. Theo như báo cáo, phương pháp nuôi tôm phổ biến hiện nay là theo phương pháp quảng canh, và nhiều địa phương đang tiến hành công tác tập huấn nuôi tôm theo phương pháp quảng canh cải tiến nhằm nâng cao năng suất. Hiện nay, đối tượng nuôi trồng và khai thác chủ yếu là tôm thẻ chân trắng và tôm sú nhằm phục vụ chủ yếu cho xuất khẩu, các thị trường xuất khẩu phổ biến như: thị trường Nhật Bản (58.333 tấn chiếm 31%), thị trường Mĩ (46.629 tấn chiếm 24%), thị trường EU (32.727 tấn chiếm 17%) [19]. 7 Trong lĩnh vực chế biến các sản phảm tôm bỏ đầu, bỏ vỏ thì tỉ lệ thịt tôm chỉ chiếm khoảng 55-65%, phần nguyên liệu còn lại chiếm đến 35-45% (định mức sản xuất trong nhà máy chế biến tôm đông lạnh). Như vậy, giả sử trong nhà máy chế biến, một ngày chế biến khoảng 10 tấn tôm thì lượng phế liệu thật đáng kể. Đây là nguồn thưc ăn của nhiều vi sinh vật gây thối, hơn thế đặc thù của ngành thủy sản lại gắn với việc sử dụng một lượng nước rất lớn. Vì vậy mà ngành chế biến thủy sản nói chung, ngành chế biến tôm nói riêng trở thành ngành công nghiệp gây ô nhiễm nặng nề nếu phế liệu không được lí xử tốt. 2.3. TỔNG QUAN VỀ ENZYME PROTEASE 2.3.1. Giới thiệu chung [3] Nhóm enzyme protease (peptit-hidrolase 3,4 ) xúc tác trong quá trình thủy phân liên kết peptid (-CO-NH-)n trong phân tử proteine, polypeeptide đến các sản phẩm cuối cùng là các acid amin. Ngoài ra, nhiều protease cũng có khả năng thủy phân liên kết este và vận chuyển acid amin. Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng, từ mức độ tế bào, cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rộng rải trên nhiều đối tượng như vi sinh vật (vi khuẩn, nấm móc, virus…) đến thực vật (đu đủ, dứa…) và động vật (gan, dạ dày bê, đầu tôm…). Bản chất, cấu trúc và cơ chế tác dụng của enzyme Bản chất của enzyme Enzyme đa phần là những protein có hoạt tính sinh học, do vậy nó có đủ tính chất như một protein thông thường Enzyme có khối lượng phân tử lớn hơn 12000 Dalton. Giống như các protein khác, enzyme có thể hóa tan trong nước, trong dung dịch muối loãng nhưng không tan trong dung môi phân cực...Enzyme dễ dàng bị kết tủa bởi các yếu tố vật lý và hóa học vốn làm kết tủa protein. 8 Enzyme không bị mất hoạt tính ở nhiệt độ thấp ngược lại dưới tác dụng của yếu tố gây biến tính protein như nhiệt độ cao, acid hay kiềm đặc, muối kim loại nặng ở nhiệt độ cao,enzyme thường bị mất hoạt tính xúc tác. Cấu trúc của enzyme Enzyme của nấm mốc cũng như các enzyme khác được chia thành hai loại sau : o Enzyme một cấu tử (enzyme đơn giản) : trong thành phần phân tử chỉ có protein, những enzyme này thường xúc tác cho các phản ứng thủy phân. o Enzyme hai cấu tử (enzyme phức tạp) : trong thành phần cấu tạo của nó gồm hai thành phần là protein (apenzyme) và phi protein (coenzyme) những enzyme này thường xúc tác cho các phản ứng oxy hóa-khử, các quá trình vận chuyển. Trung tâm hoạt động cua phân tử enzyme chỉ chiếm một tỷ lệ khá nhỏ so với phân tử enzyme và nó bao gồm nhiều nhóm chức khác nhau. Ở enzyme một cấu tử thì trung tâm hoạt động là một số nhóm chức nhất định của các acid amin như (-SH, -OH,-COOH...) Trung tâm hoạt động của enzyme hai cấu tử là do phần polypeptide kết hợp đặc biệt tham gia vào việc tạo thành trung tâm hoạt động và các nhóm chức của coenzyme, ngoài ra các trung tâm này còn có sự tham gia của các ion kim loại. Hoạt tính của enzyme phụ thuộc vào tổng hợp các nhóm tham gia vào cấu trúc trung tâm hoạt động, nếu vì một lí do nào đó mà trung tâm hoạt động này bị phá vỡ thì hoạt tính xúc tác của enzyme mất đi. Cơ chế tác dụng của enzyme Enzyme (E) là chất xúc tác sinh học, khi tác dụng với cơ chất (S) để ra sản phẩm (P) trải qua các giai đoạn theo cơ chế sau : E+S ES P+E o Trong giai đoạn thứ nhất : enzyme kết hợp với cơ chất bằng liên kết yếu tạo thành phức enzyme cơ chất (ES) không bền, phản ứng này xảy ra nhanh và đòi hỏi năng lượng hoạt hóa thấp. 9 o Trong giai đoạn thứ hai : xảy ra sự biến đổi cơ chất dưới tác dụng của enzyme dẫn đến sự kéo căng và phá vỡ các liên kết đồng hóa trị tham gia phản ứng này. Kết quả làm cho cơ chất được hoạt hóa dễ dàng tham gia phản ứng hơn. o Trong giai đoạn thứ ba : sản phẩm tạo thành, còn enzyme được giải phóng dưới dạng tự do để tiếp tục tham gia tác dụng với cơ chất khác. 2.3.2. Phân loại protease Protease (peptidase) thuộc phân lớp 4 của lớp thứ 3 (E.C.3.4) [32]. Peptidase (protease) (E.C.3.4) Exopeptidase Endopeptidase (E.C.3.4.11-17) (E.C.3.4.21-99) Aminopeptidase Carboxypeptidase Serine Aspartic Metallo proteinase proteinase proteinase Cystine proteinase Exopeptidase: peptidase thủy phân các phân tử peptid có phân tử nhỏ (pepton, polypeptid) thành các acid aminr tự do. Những enzyme này đòi hỏi phải các nhóm –COOH và nhóm -NH2 tự do tận cùng ở gần kề liên kết peptid. Peptidase có tính đặc hiệu tương đối hẹp, chủ yếu phân cách các liên kết ở hai đầu phân tử proteine. Dựa vào vị trí tác động lên mạch polypeptid, exopeptidase được phân chia thành hai loại: + Amino peptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptid ở đầu N tự do của chuỗi polypeptid để giải phóng ra một acid amin, dipeptid, hay tripepetid. + Carboxypeptidase: xúc tác thuỷ phân liên kết peptid ở đầu C của mỗi polypeptid và giải phóng ra một acid amin, một dipeptid. 10 Endopeptidase: protease thủy phân phân tử proteine thành polypeptid, pepton. Chúng có tính đặc hiệu tương đối rộng, là những enzyme hoạt động mà không đòi hỏi phải có nhóm carboxyl hay nhóm amin tận cùng ở gần liên kết peptid. Chúng tác dụng vào những liên kết peptid ở bên trong phân tử protein. Dựa vào động học của cơ chế xúc tác, endopeptidase được chia thành bốn nhóm: + Serine proteinase: là những proteinase chứa nhóm –OH của gốc serine trong trung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối hoạt động xúc tác của enzyme. Nhóm này bao gồm hai nhóm nhỏ: - Chymotrypsine: bao gồm các enzyme động vật như chymotrypsine, trypsine, elastine. - Nhóm subtilisine: gồm hai loại enzyme vi khuẩn như Subtilisine Carlsberg, Subtilisine BPN. Các serine proteinase thường hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính, và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất tương đối rộng. + Cystine proteinase: các nhóm proteinase chứa nhóm –SH trong trung tâm hoạt động. Cystine protease bao gồm các protease thực vật như papain, bromelin, một vài protease động vật và protease kí sinh trùng. Chúng thường hoạt động ở vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất rộng rãi. + Aspartic proteinase: hầu hết các aspartic proteinase đều thuộc nhóm pepsin. Nhóm pepsin bao gồm các enzyme tiêu hóa như pepsin, chymosin, cathepsin, renin. Các aspartic proteinase có chứa nhóm carboxyl ở trung tâm hoạt động và thường hoạt động mạnh ở môi trường pH trung tính. + Metallo proteinase: là nhóm protease được tìm thấy ở vi khuẩn, nấm mốc cũng như các vi sinh vật bậc cao hơn. Các metallo proteinase thường hoạt động ở vùng pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh dưới tác dụng của EDTA. Ngoài ra, protease còn được phân loại một cách đơn giản hơn thành ba nhóm sau: 11 + Protease acid: pH 2-4 + Protease trung tính: pH 7-8 + Protease kiềm: pH 9-11 2.3.3. Nguồn thu nhận protease [32] + Nguồn vi sinh vật: Enzyme protease phân bố chủ yếu ở vi khuẩn, nấm móc, xạ khuẩn… gồm nhiều loại thuộc PergillAsus, Bacillus, Penicillium, Streptomyces, và một số loại nấm men. + Nguồn thực vật: Có ba loại protease thực vật phổ biến là bromelin (thu từ quả, chồi, vỏ dứa), papin (thu từ nhựa, lá, thân, quả đu đủ), prein (thu từ nhựa cây cọ). + Nguồn động vật: - Dạ dày bê: trong ngăn thứ tư của dạ dày bê có tồn tại enzyme thuộc nhóm protease tên là renin. - Tụy tạng: đây là nguồn enzyme lớn nhất (chứa nhiều enzyme nhất) được phát hiện sớm nhất và lâu đời nhất. 2.3.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ phản ứng của enzyme [3] Tốc độ phản ứng của enzyme phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau như bản chất và nồng độ các chất phản ứng, nộng độ enzyme, nhiệt độ, pH môi trường, nồng độ ion trong môi trường, nồng độ các chất kìm hãm, các chất hoạt hóa enzyme... Ảnh hưởng của nhiệt độ : giống như các phản ứng hóa học, các phản ứng cho enzyme xúc tác phụ thuộc rất nhiều vào nhiệt độ. Theo quy luật của phản ứng hóa học thì khi nhiệt độ tăng thì tốc độ phản ứng tăng, nhưng vì bản chất của enzyme là protein nên nhiệt độ chỉ tăng cao đến mức nhất định. Đa số 12 các enzyme sẽ bị mất hoạt tính ở nhiệt độ 60oC trở lên, trông nhiệt độ thích hợp nếu cứ tăng lên 10oC thì tốc độ phản ứng tăng lên 1,5-2 lần. Nhiệt độ thích hợp của enzyme phụ thuộc vào nhiều yếu tố : thời gian tác dụng dài thì nhiệt độ thích hợp của enzyme càng thấp. Ngoài ra còn phụ thuộc vào nồng độ enzyme, nồng độ cơ chất, dạng tồn tại của enzyme cũng sẽ làm biến đổi tác dung của nhiệt độ. Ảnh hưởng của pH : enzyme rất nhạy cảm với pH của môi trường. Mỗi enzyme chỉ thích hợp ở một pH xác định gọi là pH tối thích của enzyme Một số enzyme hoạt động ở pH thấp như pepsin pH=1,8-2,2 và hoạt động ở pH cao như tripsine pH=5-9, cùng một số loại enzyme thu được ở các nguồn khác nhau cũng có pH tối thích khác nhau. pH của môi trường ảnh hưởng tới tốc độ phản ứng có thể do: - pH làm thay đổi trạng thái ion hóa của các nhóm định chức ở trung tâm hoạt động của enzyme, làm thay đổi khả năng phản ứng của các nhóm này trong phản ứng xúc tác và có thể làm thay đổi cấu trúc trung tâm của enzyme. - pH cũng làm thay đổi trạng thái ion hóa cơ chất, tại pH tối thích, phân tử cơ chất được ion hóa tới trạng thái thích hợp nhất cho sự kết hợp với enzyme, nhờ đó phản ứng có vận tốc cao nhất. Ảnh hưởng của thời gian: trong quá trình thủy phân, thời gian tác dụng của enzyme lên cơ chất có ảnh hưởng tới hoạt động của nó và đến chất lượng của sản phẩm. Thời gian tác dụng càng dài thì sự tác dụng càng triệt để. Mặt khác nếu thời gian tác dụng quá ngắn thì sự phân giải protein chưa triệt để, như vậy hiệu suất thủy phân thấp gây khó khăn cho công đoạn tiếp theo, gây lãng phí nguyên vật liệu, không tận dụng hết nguyên liệu ban đầu. Ảnh hưởng của nồng độ muối: muối ăn có tác dụng kìm hãm hoạt động của vi sinh vật gây thối rữa và các vi sinh vật không chịu muối, có tác dụng bảo quản nguyên liệu trong quá trình thủy phân. Mặt khác, muối ăn còn điều vị mặn 13 tùy theo lượng muối bổ sung vào, ở nồng độ giới hạn cho phép thì thúc đẩy enzyme hoạt động mạnh, nếu vượt qua giới hạn cho phép thì sẽ kìm hãm sự hoạt động của enzyme. Ảnh hưởng của ion kim loại: một số enzyme không bị ảnh hưởng rõ rệt của sự có mặt hay không có mặt đối với ion kim loại, nhưng có nhiều enzyme khác chịu ảnh hưởng sâu sắc của nồng độ và bản chất của ion kim loại. Có những ion kim loại hầu như tuyệt đối cần thiết cho sự hoạt động của một số enzyme, nhưng một số ion kim loại lại ức chế hoạt động của enzyme này. Ảnh hưởng của chất kìm hãm: chất kìm hãm là chất làm yếu hoặc chấm dứt toàn bộ phản ứng của enzyme. Có hai loại chất kìm hãm : Kìm hãm cạnh tranh: là những chất kìm hãm thuận nghịch enzyme, có cấu trúc tương tự với cấu trúc cơ chất, do đó có khả năng kết hợp vào trung tâm hoạt động của enzyme, do vậy nó chiếm chổ kết hợp của cơ chất làm giảm vận tốc xúc tác. Kìm hãm không cạnh tranh: là chất kết hợp ở vị trí khác với trung tâm hoạt động làm thay đổi cấu trúc không gian của phân tử enzyme theo hướng không có lợi cho hoạt động xúc tác của enzyme, làm giảm vận tốc phản ứng xúc tác. Ảnh hưởng của chất hoạt hóa : chất hoạt hóa là những chất có khả năng làm tăng hoạt động xúc tác của enzyme hoặc làm cho enzyme ở dạng không hoạt động thành dạng hoạt động. Chất hoạt hóa có thể làm tăng hay phục hổi hoạt độ của enzyme một cách gián tiếp hay trực tiếp. Hoạt hóa không gián tiếp: làm tăng tốc độ phản ứng của enzyme bằng cách loại trừ chất kìm hãm ra khỏi hỗn hợp phản ứng hoặc tham gia trực tiếp phản ứng, nhưng không tác dụng trực tiếp với phân tử enzyme. Hoạt hóa gián tiếp: chất này có tác dụng trực tiếp vào trung tâm hoạt động của enzyme hoặc làm thay đổi cấu hình không gian của phân tử enzyme theo hướng có lợi cho hoạt động xúc tác. 14 ● Ảnh hưởng của nồng độ enzyme: Đối với các phản ứng enzyme, tốc độ phản ứng thủy phân tỉ lệ với nồng enzyme. Khi nồng độ enzyme quá cao nếu tiếp tục thêm enzyme, sự biến đổi của tốc độ thủy phân là không đáng kể. Vì vậy, tốt hơn là sử dụng nồng độ enzyme thích hợp để đạt hiệu quả thủy phân cực đại và giảm giá thành. ● Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất: Trong các phản ứng do enzyme và cơ chất, trước hết phải tạo thành phức trung gian giữa enzyme và cơ chất. Sau đó, phức này chuyển hóa tiếp tục tạo thành sản phẩm cuối cùng và enzyme tự do, enzyme lại kết hợp với phân tử của cơ chất khác. Nếu nồng độ cơ chất đầy đủ thích hợp với lượng enzyme sẽ làm quá trình thủy phân diễn ra đều đặn nhanh chóng. 2.4. CÁC NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC: Khác với các enzyme ở động vật trên cạn, enzyme ở động vật thủy sản có trọng lượng phân tử, thành phần acid amin, pH hoạt động tối ưu, nhiệt độ hoạt động tối ưu, sự ổn định khác nhau và đa dạng [27]. Các enzyme tiêu hóa, đặc biệt tiêu hóa proteine của giáp xác và nhất là tôm rất giống với enzyme có trong dạ dày cá. Chúng tồn tại chủ yếu ở dạng trypsin hoặc protease serin và có khả năng hoạt động rất cao. Ngoài ra còn có enzyme chymotrypsin, astacin, collagenase … Cũng như tất cả các loài động vật thủy sản khác, protease nội bào tập trung chủ yếu ở cơ quan tiêu hóa, sau đến cơ quan nội tạng và cơ thịt. Đối với tôm, do cơ quan tiêu hóa nội tạng nằm ở phần đầu nên hệ enzyme tập trung nhiều ở đầu sau đó đến các cơ quan khác [6]. Phan Thị Trân Châu và cộng sự nghiên cứu protease trên tôm biển miền Bắc Việt Nam cho thấy phạm vi hoạt động của chúng khá rộng từ pH 6 đến 9 và pH hoạt động tối ưu là 7, 5 và 8,5 [5]. 15 Nguyễn Văn Lệ (1996) nghiên cứu về protease đầu tôm bộp cho thấy khi tách protease đầu tôm qua cột lọc gel sephadex H-75 thu được hai protease có nhiệt độ thích hợp là 600C và 500C với pH tương ứng là 7,5 và 8,5. Tác giả còn cho thấy có thể sử dụng protease đầu tôm bộp để thủy phân thu bột đạm từ phế liệu đầu tôm và ứng dụng trong thủy phân cá [11]. Nguyễn Việt Dũng đã thực hiện việc tách chiết protease từ thịt tôm sú và xác định hoạt động của chúng ở các nhiệt độ, pH khác nhau, qua đó bước đầu nhận thấy protease trong loại tôm này hoạt động thích hợp nhất ở pH 6,6 và nhiệt độ 50˚C [7]. Nguyễn Thị Mỹ Trang (2004), công bố công trình nghiên cứu protease chiết xuất từ đầu tôm bạc nghệ (Metapenaeus bevicornis). Kết quả thu được protease có nhiệt độ thích hợp là 500C và pH thích hợp từ 8,5-9,5. Chế phẩm enzyme thu được dùng thủy phân cá mối thu bột đạm [21]. Nguyễn Văn Truyền (2006) đã nghiên cứu chiết xuất protease từ đầu tôm càng xanh và thu được enzyme protease có nhiệt độ tối thích là 550C, pH tối thích là 8 [24]. Các nghiên cứu trên còn cho thấy rằng hệ enzyme protease trong tôm không những bao gồm nhiều loại protease khác nhau, mà còn các đặc tính của hệ cũng thay đổi khi tách chiết từ các phần khác nhau trên tôm. Trên thế giới, các nhà nghiên cứu cũng dành sự quan tâm đến khía cạnh này. Doek S.N và các cộng sự cho biết protease của thịt tôm he Ấn Độ (P.inducus) là một protease kiềm, hoạt động cực đại ở pH 8,0 bền với nhiệt, hoạt động phụ thuộc vào ion kim loại [29]. Shann Tzong Jiang và cộng sự đã tách chiết được Cathepsin D từ một số loài tôm nuôi ở Đài loan, đồng thời cũng xác định được nhiệt độ, pH tối thích cho enzyme này hoạt động, cũng như các yếu tố hoạt hóa và ức chế [31,32]. Tải về bản full