Khảo Sát Hoạt Tính Enzyme Protease Trích Ly Từ Aspergillus ... - 123doc

Tải bản đầy đủ (.docx) (62 trang)

1. Trang chủ
>>
2. Luận Văn - Báo Cáo
>>
3. Công nghệ - Môi trường

Khảo sát hoạt tính enzyme protease trích ly từ aspergillus oryzae trên môi trường rắn

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.12 MB, 62 trang )

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠKHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNGDỤNGLUẬN VĂN TÓT NGHIỆPChuyên ngành: CÔNG NGHỆ THựCPHẨMKHẢO SÁT HOẠT TÍNH ENZYME PROTEASE TRÍCH LYT ừ ASPERGILLUSORYZAE TRÊN MÔI TRƯỜNG RẮNSinh viên thưc hiênGiáo viên hướngHuỳnh Thị PhươngThảo MSSV:LT10039 Lớp: CNTPdân TS. NguyễnNĂMLuận văn tốt nghiệp Đại học năm 2012Trường Đại học cần ThơLuận văn đính kèm theo đây, với đề tựa “KHẢO SÁT HOẠT TÍNHENZYMEPROTEASE TRÍCH LY TỪ ASPERGILLUS ORYZAE TRÊN MÔI TRƯỜNGRẮN”, do “HUỲNH THỊ PHƯƠNG THẢO” thực hiện và báo cáo, đã đượchội đồng chấm luận văn thông qua.Giáo viên hướng dẫnGiáo viên phản biện 1TS. NGUYỄN CÔNG HÀGiáo viên phản biện 2Cần Tho, ngày .... tháng .... năm ....Chủ tịch hội đồngLuận văn tốt nghiệp Đại học năm 2012Trường Đại học cần ThơLỜI CẢM ƠNQua ba học kì học tập tại trường Đại học cần Thơ em đã được quý thầycô trường Đại học cần Thơ, đặc biệt là thầy cô trong bộ môn Công nghệ Thựcphẩm - Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng tạo điều kiện thuận lợi vàtruyền thụ những kiến thức quỷ báu, tạo cơ sở khoa học vững chắc cho emtrong suốt thời gian học tập.Sau khi hoàn thành chương trình học tại trường, em đã được thầyNguyễn Công Hà tận tình hướng dẫn và tạo điều kiện thuận lợi cho em trongquá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp.Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học trường Đại học cầnThơ đã cung cấp nguồn nấm mốc cho em thực hiện đề tài. Đặc biệt cảm ơnthầy Nguyễn Văn Thành đã nhiệt tình giúp đỡ em.Em xin chân thành cảm ơn!Cần Thơ, ngày 15 tháng 5 năm 2012Sinh viện thực hiệnHUỲNH THỊ PHƯƠNG THẢOLuận văn tốt nghiệp Đại học năm 2012Trường Đại học cần ThơTÓM TẮTProtease là enzyme được sử dụng nhiều nhất hiện nay trong một sốngành sản xuất như chế biến thực phâm, sản xuất chất tây rửa, thuộc da, y tế,nông nghiệp ...nhưng giả thành chế pham enzyme thương mại hiện nay cònrất cao. Vì vậy đề tài này được thực hiện với mục đích dùng nấm mốc đê làmdồi dào nguồn enzyme và giảm giá thành chế pham enzyme thương mại. Quảtrình nghiên cứu cũng tiến hành xác định động học của enzyme này nhằmphục vụ cho nhũng nghiên cứu ứng dụng vào sản xuất thực phâm. Sau đó dựavào nguồn enzyme này ứng dụng vào việc thuỷphân da cá tra đê sản xuấtcollagen.Kêt quả nghiên cứu của đề tài cho thấy có thê tiến hành thu enzyme cóhoạt tính cao ở thành phần môi trường thích họp đê tạo enzyme protease thuỷphân trong môi tmòng acid là 70% cám : 25% trấu : 5% gelatin và pH môitrường là 5.Đong thời có sự tương tác giữa pH và nhiệt độ xử lý lên hoạt tính củahệ enzyme protease trong dịch chiết. Enzyme này thê hiện hoạt tính toi ưu ởnhiệt độ 45°c và pH = 5,5.Động học của enzyme protease có Vmax = 1,2548pmol/phút và Km =0,3932%Khả năng thuỷ phân của enzyme protease trong dịch acid protein ứngvới thời gian thuỷ phân là 50 phút với thê tích dung dịch enzyme là lml,pH dung dịch là 3,2 và nhiệt độ thuỷphân là 45°c.Luận văn tốt nghiệp Đại học năm 2012MỤC LỤCTrường Đại học cần ThơLuận văn tôt nghiệp Đại học năm 2012Trường Đại học cần ThơDANH SÁCH BẢNGDANH SÁCH HÌNHCHƯƠNG 1 ĐẶT VÁN ĐÈ1.1 ĐẶT VẤN ĐÊNgày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của Công nghệ Sinh học,các chế phẩm enzyme Luậnđược vănsản tốtxuấtngày Đạicànghọcnhiềuđược sử dụngTrườnghầu Đại học cần Thơnghiệpnămvà2012hết trong các lĩnh vực như: chế biến thực phấm, nông nghiệp, chăn nuôi, ytế... Đặc biệt trong ngành thực phấm, những ứng dụng của kỳ thuật sinh họcđã tạo nên những tiến bộ đáng kinh ngạc trong việc sản xuất các sản phấmmới cũng như gia tăng hiệu suất của các sản phẩm truyền thống. Hàng nămlượng enzyme được sản xuất trên thế giới đạt trên 300.000 tấn với giá trị hơn500 triệu USD được phân phối trong các lĩnh vực khác nhau.Công nghệ sản xuất enzyme đã đem lại những lợi nhuận to lớn cho ViệtNam. ứng dụng enzyme đế hỗ trợ cho quá trình sản xuất trong chế biến thựcphâm đã trở nên phổ biến và quen thuộc. Bản chất của enzyme là những chatprotein. Chúng được tạo ra bởi tế bào sống (thực vật, động vật và vi sinh vật)là chất xúc tác cho các phản ứng sinh học. Chức năng chính của enzyme tronghoạt động sống là xúc tác sự hình thành và cắt đứt các liên kết hóa học.Do có ưu thế về nhiều mặt nên vi sinh vật đã trở thành nguồn thuenzyme chủ đạo. Tùy theo mục đích sử dụng mà người ta sản xuất nhiều dạngchế phâm enzyme khác nhau như enzyme thô, enzyme bán tinh khiết vàenzyme tinh khiết. Sản xuất enzyme từ vi sinh vật so với từ thực vật và độngvật có rất nhiều ưu điếm như:-Tốc độ sản sinh của vi sinh vật rất mạnh.-Enzyme thu nhận từ vi sinh vật có hoạt tính rất cao.-Vi sinh vật là rất thích hợp cho sản xuất theo quy mô côngnghiệp.-Nguồn nguyên liệu dùng sản xuất enzyme rẻ tiền và dễ kiếm.- Vi sinh vật có thể sinh tổng hợp cùng một lúc nhiều loại enzymekhác nhau.Protease là enzyme được sử dụng nhiều nhất hiện nay trong một sốngành sản xuất như: chế biến thực phẩm (đông tụ sữa làm phomat, làm mềmthịt...), sản xuất chất tây rửa, công nghiệp thuộc da, y tế, nông nghiệp...Việc gia tăng sử dụng vi sinh vật như nguồn cung cap protease đã cảithiện đáng kể hiệu quả sản xuất và sản phẩm được tạo ra nhiều hơn. Tuy nhiêngiá thành chế phẩm enzyme còn khá cao, do đó cũng hạn chế việc sử dụngrộng rãi enzyme trong công nghiệp và đời sống.Với những thuận lợi và sự cần thiết của enzyme, đề tài thực hiện khảosát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzyme protease từAspergillus oryzcte trên môi trường rắn. Bởi những ứng dụng ngày càng rộngrãi của protease thì việc sản xuất ra enzyme sẽ góp phần đưa công nghệenzyme ngày càng phát triển, góp phần hạ giá thành chế phẩm enzyme tạoLuậnenzymevăn tốt trongnghiệpthựcĐạitế,học2012điều kiện mở rộng sản xuấtcảinămthiệnđược quy trìnhTrườngsản Đại học cần Thơxuất, cải thiện điều kiện lao động và nâng cao chất lượng sản phẩm.1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN cứuĐe tài nghiên cứu nhằm khảo sát hoạt tính enzyme protease trích ly từAspergillus oryzcie trên môi trường rắn với các mục tiêu sau:-Ánh hưởng của thành phần môi trường và pH môi trường khác nhau đến quátrình sinh tổng họp enzyme protease.-Ánh hưởng của nhiệt độ và pH lên hoạt tính xúc tác phản ứng thuỷ phân củaenzyme protease.Ánh hưởng của nồng độ cơ chất lên hoạt tính xúc tác phản ứng thuỷ phân củaenzyme protease.--protein.Khảo sát khả năng thuỷ phân của enzyme protease trên dung dịchacidCHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆUEnzyme protease phân bố ở thực vật, động vật, vi sinh vật. Tuy nhiênnguồn enzyme ở vi sinh vật là phong phú nhất, có ở hầu hết các vi sinh vật nhưvi khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn... Có thể nói vi sinh vật là nguồn nguyên liệuthích hợp nhất đế sản xuất enzyme ở quy mô lớn dùng trong công nghiệp và đờisống.2.1 Sơ LƯỢC VỀ ENZYME PROTEASE2.1.1Giói thiệuProtease là enzyme thuộc nhóm hydrolase xúc tác cho quá trình thủyphân liên kết peptid (-CO-NH-) của phân tử protein, polypeptid đến sản phẩmcuối cùng là các acid amin. Ngoài ra, nhiều protease cũng có khả năng thủyphân liên kết este và vận chuyên acid amin.ProteasesH VN — CH U-Ỉ2 CO- NH- ÇH- co...- NH- CHCOOH° I Ienzyme protease thủyIAminoHình1: Mô hìnhphân phân tử proteinPolypeptRiR2RX AcidProtease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ mứcđộ tếHVNbào, cơCHquanCOOHđến cơ thenênđược phân bố rất rộng rãi trên nhiều đối+H2 N- CH- CO ... NHCHCOOHI‘ Ị I đến thực vật (đu đủ,tượng từ vi sinh vật (vi khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn)R|R->Rxdứa...) và động vật (gan, dạ dày bê...). So với protease động vật và thực vật,protease vi sinh vật có những đặc điểm khác biệt. Trước hết hệ protease vi sinhvật là một hệ thống rất phức tạp bao gồm nhiều enzyme rất giống nhau về cấutrúc, khối lượng và hình dạng phân tử nên rất khó tách ra dưới dạng tinh thếđồng nhất.Hầu hết protease phân cat protein ở các liên kết đặc hiệu, vì thế có thế sửdụng các enzyme này theo chiều phản ứng tổng hợp để tống hợp các liên kếtpeptid định trước. Yeu tố tăng cường quá trình tổng hợp bao gồm pH, các nhómcarboxyl hoặc nhóm amin được lựa chọn đế bảo vệ khả năng kết tủa sản phấm...ProteinTrong cơ the protein thực phẩm được phân giải ở bộ máy tiêu hóa bởi cácenzyme phân giải protein, đầu tiên là pepsin trong dịch dạ dày và sau đó là cácprotease được tiết ra ở tuyến tụy và từ các tế bào ở màng nhầy thành ruột. Cácacidamin tự do, các peptid ngắn được hấp thụ và đi qua các tế bào hình lông ởthành ruột. Phần lớn các peptid được hấp thụ bị thủy phân ở các tế bào thànhruột. Các acid amin được hấp thụ sẽ đi vào gan và sau đó tham gia vào quá trìnhchuyển hóa.Quá trình thủy phân protein đóng vai trò quan trọng trong sản xuất nhiềuloại thực phấm. Quá trình này có thế được thực hiện nhờ chính protease củathực phấm đó hoặc do các protease vi sinh vật được đưa vào trong quá trình chếbiến thực phâm.Trong nhiều trường họp các tính chat protein của thực phâm được cảithiện khi thủy phân hạn chế hoặc sâu sắc nhờ các enzyme protease. Sự thủyphân hạn chế có tác dụng tăng khả năng nhũ hóa và tạo bọt của protein (do tăngtính hòa tan và khả năng khuếch tán đến bề mặt phân chia).Hình 2: cấu trúc không gian enzyme protease2.1.2Phân loại enzyme protease vi sinh vậtProtease (peptidase) thuộc phân lóp 4 của lớp thứ 3 (E.c.3.4) trong hệthống phân loại các nhóm enzyme.Protease được phân chia thành hai loại: endopeptidase và exopeptidase.2.1.2.1Dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptid, exopeptidase được phânchia thành hai loại:- Aminopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptid ở đầu nitơ tụ' do của chuỗipolypeptid để giải phóng ra một amino acid, một dipeptid hoặc một tripeptid.- Carboxypeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptid ở đầu cacbon của chuồipolypeptid và giải phóng ra một amino acid hoặc một dipeptid.2.1.2.2Dựa vào động học của cơ chế xúc tác, endopeptidase được chia thànhbốn nhóm:- Sehne protease: là những protease chứa nhóm -OH của gốc serine trong trungtâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác củaenzyme. Nhóm này bao gồm hai nhóm nhỏ: Chymotrypsin và subtilisin. NhómChymotrypsin bao gồm các enzyme động vật như Chymotrypsin, trypsin,elastase. Nhóm subtilisin bao gồm hai loại enzyme vi khuẩn như SuhtilisinCarlsberg, Subtilisin BPN. Các serine protease thường hoạt động mạnh ở vùngkiềm tính và thế hiện tính đặc hiệu cơ chất tương đối rộng.- Cysteine protease: các protease chứa nhóm -SH trong trung tâm hoạt động.Cysteine protease bao gồmthựcnhưpapayin,một Đại học cần ThơLuậncácvănproteasetốt nghiệpĐạivậthọcnăm2012 bromalin,Trườngvài protease động vật và protease ký sinh trùng. Các cysteine protease thườnghoạt động ở vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất rộng.- Aspartic protease: hầu hết các aspartic protease thuộc nhóm pepsin. Nhómpepsin bao gồm các enzyme tiêu hóa như: pepsin, chymosin, cathepsin, rennin.Các aspartic protease có chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt động vàthường hoạt động mạnh ở pH trung tính.- Metallo protease: là nhóm protease được tìm thấy ớ vi khuẩn, nấm mốc cũngnhư các vi sinh vật bậc cao hơn. Các metallo protease thường hoạt động vùngpH trung tính và hoạt độ giảm mạnh dưới tác dụng của EDTA.2.1.2.3Dựa veto khả năng hoạt động ở các giá trị pH khctc nhauChia làm 03 loại protease acid, protease trung tính và protease kiềm.- Protease acid: loại protease này được thu nhận từ nấm mốc màu đen như:Aspergillus niger, Aspergillus axvamori, Aspergillus saitoi. pH hoạt động củaprotease nấm mốc này là 2,5 -T 3,0.- Protease trung tính: loại này có ở rất nhiều loại nấm mốc khác nhau, chủ yếu làớ các loại nấm mốc có màu vàng như: Aspergillus oryzae, Aspergillus flcivus,Aspergillus fumigatus, Aspergillus tericole. Ngoài nấm môc ra, protease trungtính còn tìm thây ở vi khuân Bacillus mesentericus.- Protease kiềm: tìm thấy nhiều ở nấm men. Tuy nhiên việc tạo ra protease acid,trung tính và kiềm còn phụ thuộc rất nhiều vào thành phần môi trường hoặc cơchất mà chúng tác dụng. Đã có nhiều trường hợp thí nghiệm cho thấy thànhphần môi trường làm thay đổi hẳn đặc tính của protease.2.1.3Động học của enzyme2.1.3.1Ý nghĩa của việc nghiên cứu động học enzymeNghiên cứu động học của enzyme là nghiên cứu ảnh hưởng của các yếutố: nồng độ cơ chat, enzyme, pH môi trường, nhiệt độ, các chất kìm hãm... đếntốc độ phản ứng do enzyme xúc tác. Việc nghiên cứu động học enzyme sẽ chota biết được các vấn đề sau đây:- Có thế biết được cơ chế phân từ của sự tác động của enzyme.- Cho phép ta hiểu biết được mối quan hệ về mặt năng lượng của quá trìnhenzyme.- Thấy được vai trò quan trọng cả về mặt lý luận lẫn thực tiễn: khi lựa chọn cácđơn vị hoạt động enzyme người ta cần phải biết những điều kiện tốt nhất đối vớihoạt động của enzyme, cũng như cần phải biết được các yếu tố ảnh hưởng đếnhoạt động của chúng.Là điều kiện cần thiết đế thực hiện tốt các bước tinh chế enzyme, vì người tacần phải kiếm tra về mặt năng lượng bằng cách xác định có hệ thống hoạt độngcủa chế phẩm enzyme trongtinhchế.LuậncácvăngiaitốtđoạnnghiệpĐạihọc năm 2012Trường Đại học cần Thơ2.1.3.1Anh hưởng của nong độ cơ chấta. Phưong trình động học Michalelis - MentenNăm 1913 hai nhà khoa học Leonom Michalelis và Maud Menten đưa ramô hình động học đế giải thích phản ứng xúc tác bởi enzyme và lập phươngtrình phản ánh mối quan hệ giữa vận tốc phản ứng, nồng độ cơ chất và enzyme.Mô hình chuyển hoá của phản ứng enzyme với một cơ chất như sau:-E + S^==±ESP + ETrong đó: ki, k.Ị, kcat: là những hằng số của các phảnứng E: là enzyme S: là cơ chấtES: phức hợp enzyme - cơchất Etot: nồng độ enzyme banđầuGiả sử nồng độ enzyme ban đầu cũng là nồng độ cơ chất ớ trạng thái cânbằng của phản ứng, nếu bỏ qua phản ứng ngược p + E -» ESTốc độ phản ứng tại thời điểm bắt đầu phản ứng: V = dP /dt = k. ' [ES]Phản ứng xấp xỉ trạng thái ốn định (Steady - State): [ES] là hang soTốc độ xuôi chiều = tốc độ ngược chiềuK[S][E] = K [s](£„„ -[ES]) = (*_, H J[ES]«•M ]£»=(*-,+*«+MS])[ES]5o[ES] = [S]£„/(if„+[S])VớiKhi nồng độ cơ chất đủ lớn sao cho tất cả enzyme đều tham gia phản ứngtạo phức hệ ES ta có: [ES] = Etat, khi phản ứng này đạt tốc độ cực đại Vmax =kcatEtoty = L, [ES] = k„ [S}E n l l(K, +[s])v = [5]/(AT. + [$])(*)Phương trình (*) là phương trình Michaelis - Men ten. Phương trình nàyphản ánh tương quan định lượng giữa tốc độ ban đầu của phản ứng V, tốc độcực đại của phản ứng vmax, nồng độ cơ chất ban đầu [S] và hằng số Km.VLuận văn tốt nghiệp Đại học năm 2012Trường Đại học cần ThơHình 3: Đồ thị biểu diễn phương trình Michaelis - Menten(Nguồn: Nguyen Đức Lượng, 2004)Những trường họp giới hạn của phương trình Michaelis Menten V = kcat[S]Etot/(Km+[S]) = Vmax[S]/(Km+[S])Trong trường họp:[S] » Km: phản ứng có dạng s —> pV ~ V......= k Rv v max — J'-catMot[S] « Km: phản ứng có dạng E + S —> P + EV ~ (kcat/Km)[S][E]kcat/Km ~ 109/ (Msee)[S] = KmV ~ (l/2)Vmax = (l/2)kcatEtot b. Ý nghĩa của hằng sốMichaelis - MentenÝ nghĩa thực tiễn của hằng số Michaelis, chính là giá trị của nồng độ cơchất khi tốc độ phản ứng bằng Vi tốc độ cực đại. Km có đơn vị là Molar, khi [S]= Km thì V = Vmax/2 và ngược lại.Hang so Michaelis là một hằng số rất quan trọng. Nó xác định ái lực củaenzyme với cơ chất. Km càng nhỏ thì ái lực càng lớn, tốc độ phản ứng càng caovì thế tốc độ cực đại vmax đạt ở nồng độ cơ chất thấp.(kcat/Km) là hằng số tốc độ phản ứng hai phân tử hiệu quả tại nồng độcơ chất thấp. Khi (kcat/Km) ~ 109 chỉ ra rằng sự xúc tác gần như hoànchỉnh: mỗi khi cơ chất gặp enzyme hầu như đều chuyển thành sảnphẩm.c. Phương trình Line WeaverV = Vmax[S]/(Km + [S])Nghịch đảo 2 vế phương trình:Luận văn tôt nghiệp Đại học năm 2012Trường Đại học cần Thơl/v = (l/vmax) + (Km/Vmax)*(l/[S])Đây là phương trình được Line Weaver và Burk đưa ra vào năm 1943 códạng y = ax + b là phương trình đường thẳng.Nếu vẽ đồ thị đường thẳng sẽ cắt trục tung ở 1/Vmax và cắt trục hoành ở- 1/Km và độ nghiêng bằng Km/Vmax. Từ phương trình trên ta dễ dàng xác địnhKm và Vmax trong các thí nghiệm.(Nguồn: Nguvễn Đức Lượng, 2004)Hình 4: Đồ thị biểu diễn2.2 GIỚIphươngTHIỆUVÈLineCơ CHẤTtrìnhWeaver2.2.1Giói thiệu về CO’ chất gelatineCơ chất cảm ứng được xem như yếu tố rất quan trọng dùng đế điều khiểnquá trình sinh tông họp enzyme.Gelatine có sẵn trong tự nhiên nhưng nó được tìm thấy từ proteincollagen gốc bằng quá trình phá hủy cấu trúc bậc hai hoặc cao hơn ở các nhiệtđộ khác nhau của quá trình thủy phân polypeptide có trong xương và da.Gelatine là các polypeptide cao phân tử dẫn xuất từ collagen, là thànhphần protein chính trong các tế bào liên kết của nhiều loại động vật. cấu tạo làmột chuỗi acid amin gồm 3 acid amin chủ yếu là glycine, proline vàhydroproline.Trong phân tử gelatine, các acid amin liên kết với nhau tạo chuỗixoắn ốc có khả năng giữ nước. Báng 1: Thành phầiyacid amin cỏ trong gelatỉneAcid aminGlycine27%Các acid amin khác10%(Nguồn: http://baisians. violet. vn/present/saine/entiy id/3232177)2.2.2Giói thiệu về CO’ chất caseinLuận văn tôt nghiệp Đại học năm 2012Trường Đại học cần ThơCasein là protein chủ yếu trong sữa, chiếm khoảng 80% protein của sữa.Chúng tồn tại dưới dạng micelle. Casein là những protein có tính acid vì trongphân tử của chúng rất giàu các acid glutamic và acid aspartic. Tất cả các caseinđều được phosphoryl hoá với những mức độ khác nhau trên gốc serin vàthreonine. Casein có điểm đẳng điện pl = 4,6. Casein trong sữa có nguồn gốctừ những chủng bò khác nhau nên có cấu trúc bậc 1 khác nhau. Casein trongsừa có 4 dạng chính: casein as] và casein aS2, casein p, casein K.- Casein as]: phân tử lượng khoảng 23.000Da, có 199 gốc acid amine. Do sựphân bố các phần tích điện và các phần ưa béo không đồng đều nên các phântử loại này có tính chất lưỡng cực, 1 đầu ưa nước, 1 đầu kỵ nước.- Casein as2: phân tử lượng 25.000Da, có 207 gốc acid amine, có tính ưa nướccao nhất trong các loại casein do phân tử của nó chứa nhiều nhóm phosphorylvà gốc cation nhất.- Casein P: phân tử lượng khoảng 24.000Da, có 209 gốc acid amine, có tính ưabéo cao nhất. Phân tử casein p gồm 10% cấu trúc xoắn a, 13% cấu trúc lá xếpp và 77% cấu trúc không trật tự.- Casein K: phân tử lượng khoảng 19.000Da, có 169 gốc acid amine. Loại này chỉchứa một gốc phosphoryl và cũng có tính lưỡng cực. Đầu amino của phân tửprotein thì ưa béo còn đầu carboxyl thì ưa nước. Casein K gồm 23% vùngxoắn a, 31 % vùng lá xếp p và 24% vùng vòng cung p.Báng 2: Thành phần các acid amin trong casein_________________________Acid aminTỷ lệ (%)Glutamic acid20,2%Proline10,2%Leucine8,3%Lycine7,4%Valine6,5%Aspartic acidSerine6,4%5,7%TyrosineTsoleucinePhenylalanineThreonine5,7%5,5%4,5%4,4%Arginine3,7%Histidine2,8%Alanine2,7%Methionine2,5%Glycine2,4%Tryptophane11%Cystine0,3%(Nguồn: />2.2.3 Giới thiệu về cơ chất Bovỉne Serium Albumin (BSA)Serum Albumin là một trong những protein được nghiên cứu rộng rãi vàlà protein phong phú nhất trong huyết tương với nồng độ là 5g/100ml. Nhiềunhà khoa học đã có nghiên cứu về cấu trúc và những tính chất của serumalbumin cũng như nhũngLuậnảnh vănhưởngcủa nó Đạiđến họcnhữngprotein khác Trườngđế từ Đại học cần Thơtôt nghiệpnămloại2012đó biết được ảnh hưởng của serum albumin đến chức năng của thực phấm lànhư thế nào.BSA là protein hình cầu lớn (óó.OOODa) với những acid amin cầnthiết. Nó có đầy đủ những đặc điếm và tính chất của protein đã được biết đến(Peter, 1975).Trong thành phần của nó chứa ít tryptophane và methionine nhưng hàmlượng cystein và acid amin phân cực cao. Hàm lượng glycine và isoleucinephân tử BSA thì thấp hơn mức trung bình trong protein (Peter, 1985). Thànhphần acid amin trong phân tử BSA được trình bày trong bảng 3.Báng 3: Thành phần các acid amin trong phân tử BSA____________________Loại acid aminsố lượngAlanine48PhenylalanineLysinePro lineCyste inGlycineValineAspartic acidHistidine306028343517MethionineArginineTryptophaneGlutamic acid4116526358Isoleucine15(Nguồn: Brown, 1975; Patterson and Getter, ¡977; McGillivrav et al., 1979;Reed et al., 1980; Hirayama et ah, 1990)2.3 NGUỒN TỐNG HỢP ENZYME PROTEASE TỪ VI SINH VẬT2.3.1Đặc điếm enzyme protease từ vi sinh vậtKhác với protease thực vật và động vật, protease của vi sinh vật là nhữngenzyme ngoại bào và có tính đặc hiệu rộng rãi.Có thể nói vi sinh vật là nguồn nguyên liệu thích hợp nhất để sản xuấtenzyme ở quy mô lớn dùng trong công nghiệp và đòi sống. Dùng nguồn vi sinhvật có những lợi ích chínhnhưvănsau:tôt nghiệp Đại học năm 2012LuậnTrường Đại học cần Thơ- Chủ động về nguyên liệu nuôi cấy vi sinh vật và giống vi sinh vật.- Chu kỳ sinh trưởng của vi sinh vật ngắn 16 -T 100 giờ nên có thê thu nhiều lầntrong năm.- Có thể điều khiển sinh tổng hợp enzyme dễ dàng theo hướng có lợi (định hướngsử dụng và tăng hiệu suất tổng thu hồi).- Giá thành tương đối thấp vì môi trường tương đối rẻ, đơn giản, dễ tố chức sảnxuất.Tuy nhiên trong mọi trường hợp cần lưu ý khả năng sinh độc tố (gây độc,gây bệnh) đế có biện pháp phòng ngừa và xử lý thích họp.Đe sản xuất chế phẩm enzyme, người ta có thế phân lập các giống vi sinhvật có trong tự' nhiên hoặc các giống đột biến có lựa chọn theo hướng có lợinhất, chỉ tổng hợp ưu thế một loại enzyme nhất định cần thiết nào đó.2.3.2Nguồn thu enzyme protease từ vi sinh vậtEnzyme protease phân bô chủ yêu ở vi khuân, nâm môc, xạ khuân và mộtsô loại nấm men.2.3.2.1Vi khuânLượng protease sản xuất từ vi khuẩn được ước tính vào khoảng 500 tấn,chiếm 59% lượng enzyme đã sử dụng.Protease của động vật hoặc thực vật chỉ chứa một trong hai loạiendopeplidase và exopeptadase, riêng vi khuân cỏ khả năng sinh ra cả hai loạitrên, do đó protease của vi khuẩn có tính đặc hiệu cơ chất cao. Chúng có khảnăng phân hủy tới 80% các liên kết peptid trong phân tử protein.Trong các chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp mạnh protease làBacilluscirculans, Bacillus subtỉlis, Bacillus mesentericus, Bacillusthermorpoteoliticus, Bacillus thermophyllus, Bacillus brevis và một sô giôngthuộc chi Clostridium. Trong đó Baciỉlus subtilis có khả năng tổng hợp proteasemạnh nhất. Các vi khuẩn thường tổng hợp protease hoạt động thích hợp ở vùngpH trung tính và kiềm yếu.Luậnnăm2012 pH hẹp (pHTrườngCác protease trungtínhvăncủatôtvinghiệpkhuấn Đạihoạthọcđộngở khoảng= Đại học cần Thơ5-7- 8) và có khả năng chịu nhiệt thấp. Các protease trung tính tạo ra dịch thủyphân protein thực phẩm ít đắng hơn so với protease động vật và tăng giá trị dinhdưỡng. Các protease trung tính có khả năng ái lực cao đối với các acid amin ưabéo và thơm. Chúng được sinh ra nhiều bởi Bacỉỉlus subtilis, Bacillusmesentericus, Bacillus thermorpoteoliticus và một số giống thuộc chiClostridium.23.2.2Hình 5: BacillusNeun mốcNhiều loại nấm mốc có khả năng tống hợp một lượng lớn protease đượcứng dụng trong công nghiệp thực phẩm là các chủng Aspergillus oryzae,Aspergillus flavus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus soyae, Penicillumchysogenum, Mucor hiemalis.. .Các loại nấm mốc này có khả năng tống hợp cả03 loại protease: acid, trung tính và kiềm. Nấm mốc đen tổng hợp chủ yếu cácprotease acid, có khả năng thúy phân protein ở pH 2,5 -T 3,0.Một sô nâm môc như Aspergillus canditatus, Penicillum cameberti,Pénicillium roqueforti...cũng có khả năng tổng hợp protease đông tụ sữa sửdụng trong sản xuất phomat.Luận văn tôt nghiệp Đại học năm 2012Trường Đại học cần ThơHình 6: Nấm mốc2.3.23 Xạ khuẩnvề phương diện tổng hợp protease, xạ khuẩn được nghiên cứu ít hơn vikhuân và nấm mốc. Tuy nhiên, người ta cũng đã tìm được một số chủng có khảnăng tông hợp protease cao: Streptomyces gríeus, Streptomyces fradiae,Streptomyces trerimosus...Các chế pham protease từ xạ khuân được biết nhiều là protease đượcchiết tách từ Streptomyces grieus, enzyme này có tính đặc hiệu rộng, có khảnăng thủy phân tới 90% liên kết peptid của nhiều protein thành acid amin. ỚLiên Xô (cũ) người ta cũng tách được chê phâm tương tự từ Streptomycesgrieus có tên là protelin.Hình 7: Xạ khuẩn2.4 PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG xúc TÁC CỦA ENZYMENgười ta xác định khả năng xúc tác của enzyme thông qua việc xác địnhhoạt độ hoạt động của enzyme. Người ta cũng không thế định lượng enzymetrực tiếp mà phải xác định gián tiếp thông qua hoạt độ hoạt động của chúnghoặc thông qua khả năng làm giảm cơ chất sau một thời gian phản ứng.2.4.1Các nhóm phương pháp xác định khả năng xúc tác cùa enzymeHiện nay nhiều phòng thí nghiệm sử dụng một trong ba nhóm phươngpháp sau để xác định khả năng xúc tác của enzyme.-Tiến hành đo lượng cơ chất bị mất đi hay lượng sản phẩm được tạo thành saumột thời gian nhất định và lượng enzyme đã xác định trước. Phương pháp nàyđược áp dụng rộng rãi và đã được xác định là tương đối chính xác.-Tiến hành xác định thời gian cần thiết để thu nhận được một lượng biến đổi nhấtđịnh của lượng cơ chất Luậnhay lượngsảnnghiệpphẩmĐạitươngmột lượng enzymevăn tôthọcứngnămvới2012Trường Đại học cần Thơnhất định.Tiến hành chọn nồng độ enzyme cần thiết đê trong một thời gian nhấtđịnh sẽ thu được sự biến đối nhất định về cơ chất hay sản phâm.Luận văn tốt nghiệp Đại học năm 2012Trường Đại học cần Thơ2.4.2Đơn vị hoạt độ của enzymeKhả năng xúc tác của enzyme được xác định thông qua hoạt độ hoạtđộng của enzyme. Hoạt độ hoạt động của enzyme được xác định thông qua đơnvị hoạt độ. Người ta biểu diễn đơn vị hoạt độ qua những đơn vị sau.2.4.2.1Đơn vị hoạt độ quốc tế (UI)Đơn vị hoạt độ quốc tế là lượng enzyme có khả năng xúc tác làm chuyểnhóa được 1 ỊLimol cơ chất sau một phút ở điều kiện tiêu chuẩn.1UI = lpmol cơ chất (10"6mol)/phút2.4.2.2Katal (Kat)Đơn vị Kat là lượng enzyme có khả năng xúc tác làm chuyển hóa đượcmột moi cơ chất sau một giây ở điều kiện tiêu chuẩn.1 Kat = 1 moi cơ chất/giây2.4.2.31ƯĨ = ^-xlCr6Kat= 16,67nKat (nanoKatal)60Hoạt độ riêngHoạt độ riêng của một chế phấm enzyme là số đơn vị UI (hoặc một đơnvị Katal) ứng với lml dung dịch (nếu là dung dịch) hoặc lmg protein (nếu là bộtkhô) của chế phẩm enzyme. Khi biết được phân tử của enzyme ta hoàn toàn cóthế tính được hoạt độ riêng của phân tử.2.4.2.4Hoạt độ riêng của phân tửHoạt độ riêng của phân tử enzyme là số phân tử cơ chất được chuyển hóabởi một phân tử enzyme trong một đơn vị thời gian.2.5 SẢN XUẤT ENZYME PROTEASE TỪ NẤM MỐC ASPERGILLUSORYZAE2.5.1Sơ lược về nấm mốc Aspergillus oryzae2.5.1.1Phân loại Giới:Fungi Ngành:Ascomycota Ngành phụ:Pezizomycota Lớp:AscomycetesBộ: PlectascalesHọ: AspergillaceaeGiống: AspergillusLoài: Aspergillus oryzae2.5.1.2Đặc điểmxHình tháiLuận văn tốt nghiệp Đại học năm 2012Trường Đại học cần ThơChủng mốc Aspergillus oryzae có màu vàng hoa cau, sợi nấm phát triếnrất mạnh (chiều ngang 5 -ỉ- 7|Lim), có vách ngăn chia sợi nấm thành nhiều tếbào (nấm đa bào), phát triển thành từng đám gọi là hệ sợi nấm hay khuẩn ty.Hình 8: Nấm mốc Aspergillus oryzae sau khi ủ 4 ngàyHình 9: Nấm mốc Aspergillus oryzae qua kính hiổn vỉ x Điều kiện phát triểnĐộ ẩm môi trường tối ưu cho sự hình thành bào tử: 45%.Độ ấm môi trường tối ưu cho sự hình thành enzyme: 55 -7- 58%.Độ ẩm không khí: 85 95%.pH môi trường: 5,5 + 6,5Nhiệt độ nuôi cấy: 27 -ỉ30°c2.5.2Môi trường nuôicấy 2.5.2. ỉ Nguyên liệuMôi trường sử dụng nuôi cấy vi sinh vật để thu nhận enzyme thường làcám gạo hay cám mì, bã củ cải hoặc thóc nảy mầm. Trong các loại nguyên liệutrên thì cám gạo, cám mì thường được sử dụng nhiều hon cả. Hai loại cám nàycó đầy đủ chất dinh dưỡng cần thiết cho vi sinh vật phát triển. Mặt khác, khi tạomôi trường, chúng thường có tính chất vật lý rất thích hợp để đảm bảo khối kếtLuận văn tốt nghiệp Đại học năm 2012Trường Đại học cần Thơdính cần thiết, vừa đảm bảo lượng không khí lưu chuyển trong khối nguyênliệu. Nguồn dinh dưỡng bổ sung thường là các muối ammonium, phosphat...t"•1ro\ÓTrong nhiều trường họp, đế tạo khả năng thoáng khí tốt hơn, người tathường cho thêm trấu với lượng khoảng 20 -r 25%. Thực chất, việc cho trấu vàolà làm tăng độ xốp của môi trường, tạo nên những khoảng trống đế không khícó thế lưu thông trong lòng môi trường.Báng 4: Thành phần dinh dưõiĩg của cám (Nguyễn Dửc Lượng và ctv, 2004)---—----------, -.../Thành phần dinhHàmlưọngHàm lượngThành phần dinhdưõngdưõng350 -TNăng lượngTro6,0 -T 6,5 %426kcalNước12-T 14%Canxi30 -r 32mg%4,5 -T 4,6mgProtein thô10-r 12,2%Phospho%Lipid20 -r 22,7% Sắt10 -T 14mg%Glucid tổng số40,3 - 42%Vitamin B]0,96-ỉ- lmg%Cellulose2.5.2.2 Chuân bị môi trường nuôi cấyTrong quá trình chuẩn bị môi trường, điều quan trọng nhất là tạo đượcđộ ẩm thích hợp. Độ ẩm thích họp cho nhiều vi sinh vật khi nuôi cấy trong môitrường cám là 60%w. Độ ẩm vượt quá 60%w thường tạo điều kiện cho nhiều vikhuẩn phát triển, khi đó dễ xảy ra nhiễm vi sinh vật lạ. Neu độ ấm < 60%w(thường 45 -T 50%W) thường gây hiện tượng tạo nhiều bào tử nấm sợi và nhưvậy thì enzyme thu được sê giảm hoạt tính rất mạnh.Sau khi chuẩn bị xong môi trường, ta tiến hành thanh trùng môi trườngđể tiêu diệt các vi sinh vật lạ nhiễm vào môi trường mà có thế ức chế sự pháttriến của giống vi sinh vật mà ta sẽ nuôi cấy. Thông thường, môi trường sẽ đượcthanh trùng bằng hơi nước nóng ở 121°c trong thời gian 15 -T 30 phút.Môi trường nuôi cấy sẽ được cho vào bình tam giác và tiến hành trộngiống vi sinh vật vào khối môi trường sao cho thật đều. Thời gian nuôi cấy nấmsợi đê thu nhận enzyme vào khoảng 36 -r 60 giờ.Phưong pháp nuôi cấy bề mặtĐe nuôi cấy nấm mốc Aspergillus oryzae sản xuất enzyme protease talựa chọn phương pháp nuôi cấy bề mặt với môi trường rắn. Phương pháp nuôicấy bề mặt là phương pháp tạo điều kiện cho vi sinh vật phát triển trên bề mặtmôi trường hay trên bề mặt vật liệu rắn, xốp, ẩm. Thông thường, môi trườngdạng rắn vói nguyên liệu chính là bột cám mì, bã củ cải, bột bắp nghiền, hạtthóc nảy mầm, trấu và bổ sung một số chất dinh dưỡng khác (amon Sulfat,amon clorua, amon phosphat). Phương pháp này phát triển rất mạnh từ những2.5.4Luận văn tốt nghiệp Đại học năm 2012Trường Đại học cần Thơnăm 1970 đến nay. Những ưu điểm cơ bản của phương pháp nuôi cấy bề mặt:- Dề thực hiện, quy trình công nghệ đơn giản.- Lượng enzyme được tạo thành từ nuôi cấy bề mặt thường cao hơn rất nhiều sovới nuôi cấy chìm.- Sản phấm enzyme thô sau khi thu nhận rất dễ sấy khô và dễ bảoquản.- Khi bị nhiễm vi sinh vật lạ ta rất dễ dàng xử lý.2.5.4.1Quy trìnhNguyên liệuị'Trộn, làm ẩmịThanh trùng bằng nhiệtịLàm nguội, làm tơiịTrộn giống vsv