Xemtailieu Tải về Khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzyme protease của các chủng vi nấm phân lập ở vùng ven biển khánh hòa
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƢỜNG ĐINH THỊ ÚT KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENZYME PROTEASE CỦA CÁC CHỦNG VI NẤM PHÂN LẬP Ở VÙNG VEN BIỂN KHÁNH HÒA LUẬN VĂN THẠC SĨ KHÁNH HÒA - 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƢỜNG ĐINH THỊ ÚT KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENZYME PROTEASE CỦA CÁC CHỦNG VI NẤM PHÂN LẬP Ở VÙNG VEN BIỂN KHÁNH HÒA LUẬN VĂN THẠC SĨ Ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 8420201 Mã số học viên: 58DT13 Quyết định giao đề tài: 321/QĐ- ĐHNT ngày 27/3/2018 Quyết định thành lập hội đồng: 1585/QĐ-ĐHNT Ngày bảo vệ: 18/12/2019 Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS. Phạm Thu Thủy PGS.TS Nguyễn Văn Duy Chủ tịch Hội Đồng: PGS. TS. Vũ Ngọc Bội Phòng Đào tạo Sau Đại học: KHÁNH HÒA – 2019 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan mọi kết quả của đề tài: “Khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzyme protease của các chủng vi nấm phân lập ở vùng ven biển Khánh Hòa” là công trình nghiên cứu của cá nhân tôi, và chƣa từng đƣợc công bố trong bất cứ công trình khoa học nào khác cho tới thời điểm này. Kết quả này là một phần của đề tài “Nghiên cứu đa dạng sinh học nấm phù du ở vùng ven biển Khánh Hoà dựa trên cách tiếp cận phụ thuộc và độc lập nuôi cấy” (mã số 106-NN.02-2016.70) do TS. Phạm Thu Thuỷ là chủ nhiệm đề tài và Quỹ NAFOSTED tài trợ kinh phí. Tôi xin cam đoan mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện đề tài nghiên cứu và hoàn thành luận văn đều đã đƣợc cảm ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn đều chính xác và đƣợc chỉ rõ nguồn gốc. Khánh Hòa, ngày 10 tháng 10 năm 2019 Tác giả luận văn Đinh Thị Út iii LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm on các thầy cô trong Viện Công nghệ sinh học & Môi trƣờng, Truờng Đại học Nha Trang giảng dạy và tạo điểu kiện thuận lợi cho tôi viẹc thực hiẹn luạn van này. Tôi đạc biẹt cảm on TS. Phạm Thu Thủy và PGS.TS Nguyễn Văn Duy đã tạn tình huớng dẫn, chỉ bảo để tôi c thể hoàn thành luạn van cao học. Tôi xin cảm ơn Quý thầy cô và cán bộ viên chức trong Phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học, Viện Công nghệ sinh học và Môi trƣờng, Trƣờng Đại học Nha Trang đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành công việc nghiên cứu thực hiện đề tài. Xin chân thành cảm ơn các bạn học viên Cao học lớp CHSH16-1 Trƣờng Đại học Nha Trang và các thành viên của đề tài “Nghiên cứu đa dạng sinh học nấm phù du ở vùng ven biển Khánh Hòa dựa trên cách tiếp cận phụ thuộc và độc lập nuôi cấy” (mã số106-NN.02-2016.70) do TS. Phạm Thu Thủy là chủ nhiệm đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình tiến hành thực nghiệm. Đặc biệt cảm ơn em Trần Thị Châu Loan đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện nghiên cứu đề tài. Xin gửi lời cảm ơn đến Ban Giám hiệu và các đồng nghiệp Trƣờng THCS& THPT Đống Đa, Lâm Đồng nơi tôi đang công tác đã luôn tạo điều kiện và ủng hộ tôi vƣợt qua những kh khăn trong quá trình học tập và thực hiện luận văn. Cuối cùng xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè, anh chị, … đã luôn yêu thƣơng, động viên và ủng hộ tôi vƣợt qua những kh khăn trong quá trình học tập và thực hiện luận văn. Khánh Hòa, ngày 18 tháng 10 năm 2019 Tác giả luận văn Đinh Thị Út iv MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .......................................................................................................... iii LỜI CẢM ƠN .................................................................................................................iv MỤC LỤC .......................................................................................................................v DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT .......................................................................... viii DANH MỤC BẢNG ......................................................................................................ix DANH MỤC HÌNH ........................................................................................................x TRÍCH YẾU LUẬN VĂN ........................................................................................... xii MỞ ĐẦU .........................................................................................................................1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .........................................................................3 1.1. Tổng quan về vi nấm biển ........................................................................................3 1.2. Protease .....................................................................................................................6 1.2.1. Khái niệm protease ................................................................................................ 6 1.2.2. Phân loại protease ..................................................................................................6 1.2.3. Phƣơng pháp xác định hoạt độ protease ................................................................ 7 1.2.4.1. Nguồn động vật ................................................................................................ 10 1.2.4.2. Nguồn từ thực vật ............................................................................................. 10 1.2.4.3. Nguồn từ vi sinh vật ......................................................................................... 10 1.2.5. Ứng dụng của protease ........................................................................................ 11 1.2.5.1. Công nghiệp thực phẩm....................................................................................11 1.2.5.2. Công nghiệp nhẹ ............................................................................................... 12 1.2.5.3. Nông nghiệp .....................................................................................................13 1.2.5.4. Y học.................................................................................................................13 1.3. Protease từ vi nấm ..................................................................................................13 1.3.1 Protease từ vi nấm ................................................................................................ 13 1.3.2. Cơ chế sinh enzyme protease ..............................................................................14 1.4. Các yếu tố ảnh hƣởng đến sinh tổng hợp enzyme protease của vi nấm .................15 1.4.1. Nhiệt độ ...............................................................................................................15 1.4.2. pH ........................................................................................................................ 15 1.4.3. Nguồn dinh dƣỡng ............................................................................................... 16 1.4.4. Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy ......................................................................17 1.5. Tình hình nghiên cứu enzyme protease từ vi nấm biển trên thế giới và Việt Nam .......17 v CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................ 21 2.1. Đối tƣợng, phạm vi, thời gian và địa điểm nghiên cứu ..........................................21 2.1.1. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu .......................................................................21 2.1.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu .......................................................................21 2.2. Vật liệu nghiên cứu.................................................................................................21 2.2.1. Chủng vi nấm biển............................................................................................... 21 2.2.2. H a chất ...............................................................................................................21 2.2.2.1. Oligonucleotide ................................................................................................ 21 2.2.2.2. Môi trƣờng nuôi vi nấm....................................................................................22 2.2.2.3. Thiết bị chuyên dụng ........................................................................................ 24 2.3. Sơ đồ nghiên cứu tổng quát và bố trí thí nghiệm ...................................................24 2.3.1. Bố trí thí nghiệm sàng lọc sơ bộ khả năng sinh enzyme ngoại bào bằng phƣơng pháp đo đƣờng kính phân giải protease .........................................................................24 2.3.2. Bố trí thí nghiệm xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp để sinh tổng hợp protease của chủng DW15M ......................................................................................... 27 2.3.2.1. Bố trí thí nghiệm xác định ảnh hƣởng của nhiệt độ .........................................27 2.3.2.2. Bố trí thí nghiệm xác định ảnh hƣởng của pH .................................................27 2.3.2.3. Bố trí thí nghiệm xác định ảnh hƣởng của nguồn cacbon ................................ 28 2.3.2.4. Bố trí thí nghiệm xác định ảnh hƣởng của nguồn ni tơ hữu cơ ........................ 29 2.3.2.5. Bố trí thí nghiệm xác định ảnh hƣởng của nồng độ casein .............................. 29 2.3.2.6. Bố trí thí nghiệm xác định ảnh hƣởng của nguồn nitơ vô cơ ........................... 30 2.3.2.7. Bố trí thí nghiệm xác định ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy ......................... 31 2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu ........................................................................................ 31 2.4.1. Nuôi cấy các chủng vi nấm .................................................................................31 2.4.2. Bảo quản chủng vi nấm ........................................................................................ 32 2.4.3. Xác định hoạt tính sinh enzyme protease bằng cách đo đƣờng kính vòng phân giải cơ chất protein ........................................................................................................33 2.4.4. Xác định hoạt độ enzyme protease theo phƣơng pháp Anson cải tiến................34 2.4.5. Nhuộm đơn tế bào nấm mốc................................................................................36 2.4.6. Tách chiết DNA từ vi nấm biển. .........................................................................37 2.4.7. Khuếch đại đoạn gen ITS1- 5,8S- ITS2 bằng kỹ thuật PCR ............................... 38 2.4.8. Kỹ thuật điện di DNA trên gel agarose ............................................................... 39 vi 2.4.9. Giải và phân tích trình tự gen ..............................................................................39 2.4.10. Phƣơng pháp xử lí số liệu ..................................................................................39 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................ 40 3.1. Tuyển chọn sơ bộ các chủng vi nấm biển phân lập ở vùng ven biển Khánh Hòa.........40 3.2. Tuyển chọn các chủng vi nấm c hoạt độ protease cao nhất .................................42 3.3. Định danh chủng nấm DW15M dựa trên trình tự gen ITS và đặc điểm hình thái ........43 3.3.1. Đặc điểm hình thái của chủng DW15M .............................................................. 43 3.3.2. Kết quả PCR khuếch đại đoạn gen ITS1 – 5,8S – ITS2 ......................................45 3.3.3. Trình tự đoạn gen ITS của chủng DW15M ......................................................... 45 3.4. Điều kiện thích hợp sinh tổng hợp protease ngoại bào của chủng nấm mốc Simplicillium obclavatum DW15M ...............................................................................47 3.4.1. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến khả năng sinh tổng hợp protease ngoại bào ..........47 3.4.2. Ảnh hƣởng của pH đến khả năng sinh tổng hợp protease ngoại bào ..................48 3.4.3. Ảnh hƣởng của nguồn cacbon đến khả năng sinh tổng hợp protease ngoại bào .....50 3.4.4. Ảnh hƣởng của nguồn nitơ hữu cơ đến khả năng sinh tổng hợp protease ngoại bào .................................................................................................................................51 3.4.5. Ảnh hƣởng của nồng độ casein đến khả năng sinh tổng hợp protease ngoại bào ......53 3.4.6. Ảnh hƣởng của nguồn nitơ vô cơ đến khả năng sinh tổng hợp protease ngoại bào.... 54 3.4.7. Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp protease ngoại bào .................................................................................................................................55 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .......................................................................................57 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 58 PHỤ LỤC vii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT STT Chữ viết tắt 1 PDA 2 YPD 2 MT 1 Viết đầy đủ Ghi chú Potato Dextrose Agar Hoạt h a nấm mốc Yeast Extract Peptone Hoạt h a nấm mem Dextrose Môi trƣờng 1 Môi trƣờng Potato Dextrose Agar Môi trƣờng Yeast 4 MT 2 Môi trƣờng 2 Extract Peptone Dextrose Môi trƣờng khảo sát 5 MT 3 Môi trƣờng 3 sơ bộ khả năng sinh enzyme protease Môi trƣờng thích hợp 6 MT 4 Môi trƣờng 4 cảm ứng sinh enzyme protease 7 w/v Weight/volume 8 U/ml Units/mililiter 9 TCA Tricloacetic acid viii Trọng lƣợng/thể tích Đơn vị hoạt độ enzyme protease Axít Tricloacetic DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Thông tin cặp mồi ITS1F KYO2/ITS4 ........................................................ 22 Bảng 2.2. Tỷ lệ thành phần phản ứng để dựng đƣờng chuẩn tyrosine .......................... 34 Bảng 2.3. Tỷ lệ thành phần các dung dịch để xác định hoạt độ enzyme protease ........35 Bảng 2.4. Thành phần phản ứng PCR ...........................................................................38 Bảng 3.1. Kích thƣớc vòng phân giải protein của 10 chủng nấm mốc c hoạt tính protease mạnh nhất ........................................................................................................40 Bảng 3.2. Hoạt độ protease của 4 chủng .......................................................................43 Bảng 3.3. So sánh trình tự đoạn gen ITS của chủng DW15M với các trình tự tƣơng đồng nhất trên Genbank.................................................................................................46 ix DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Tỉ lệ phần trăm vi nấm biển thể hiện khả năng sản xuất enzyme (Smitha et al., 2014) .......................................................................................................................... 5 Hình 1.2. Sơ đồ biểu diễn phản ứng thủy phân protein của protease. ............................. 6 Hình 2.1. Sơ đồ tổng quát các nội dung nghiên cứu .....................................................25 Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm sàng lọc các chủng vi nấm c khả năng sinh protease ngoại bào........................................................................................................................ 26 Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tuyển chọn chủng vi nấm c khả năng sinh protease ngoại bào........................................................................................................................ 26 Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hƣởng của nhiệt độ đến khả năng sinh enzyme protease của các chủng nấm mốc nghiên cứu ..................................................27 Hình 2.5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hƣởng của pH đến khả năng sinh enzyme protease của chủng nấm mốc nghiên cứu ........................................................ 28 Hình 2.6. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hƣởng của nguồn cacbon đến khả năng sinh enzyme protease của chủng nấm mốc nghiên cứu.................................................28 Hình 2.7. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hƣởng của nguồn nitơ hữu cơ đến khả năng sinh enzyme protease của chủng nấm mốc nghiên cứu ........................................29 Hình 2.8. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hƣởng của nồng độ casein đến khả năng enzyme protease của các chủng nấm mốc nghiên cứu .........................................30 Hình 2.9. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hƣởng của nguồn nitơ vô cơ đến khả năng enzyme protease của chủng nấm mốc nghiên cứu ...............................................30 Hình 2.10. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng enzyme protease của chủng nấm mốc nghiên cứu ...............................................31 Hình 3.1. Vòng phân giải protein của 10 chủng nấm mốc c hoạt tính protease mạnh nhất ................................................................................................................................ 41 Hình 3.2. Hình thái khuẩn lạc của chủng nấm mốc DW15M (1,3) so với loài Simplicillium obclavatum (2,4) .....................................................................................44 Hình 3.3. Hình thái tế bào của chủng nấm mốc DW15M so với loài Simplicillium obclavatum.....................................................................................................................44 x Hình 3.4. Sản phẩm PCR khuyếch đại đoạn gen ITS1-5,8S-ITS2 của chủng DW15M ......45 Hình 3.5. Giải trình tự đoạn gen ITS1-5.8S-ITS2 của chủng DW15M ........................ 45 Hình 3.6. Khảo sát nhiệt độ nuôi cấy thích hợp của chủng Simplicillium obclavatum DW15M. ........................................................................................................................ 47 Hình 3.7. Khảo sát pH nuôi cấy thích hợp của chủng Simplicillium obclavatum DW15M ......................................................................................................................... 48 Hình 3.8. Khảo sát nguồn cacbon nuôi cấy thích hợp của chủng Simplicillium obclavatum DW15M. ....................................................................................................50 Hình 3.9. Khảo sát nguồn nitơ hữu cơ nuôi cấy thích hợp của chủng Simplicillium obclavatum DW15M. ....................................................................................................52 Hình 3.10. Khảo sát nồng độ casein nuôi cấy thích hợp của chủng Simplicillium obclavatum DW15M. ....................................................................................................53 Hình 3.11. Khảo sát nguồn nitơ vô cơ nuôi cấy thích hợp của chủng Simplicillium obclavatum DW15M. ....................................................................................................54 Hình 3.12. Khảo sát thời gian nuôi cấy thích hợp của chủng Simplicillium obclavatum DW15M. ........................................................................................................................ 55 xi TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Protease là các enzyme đa chức năng chiếm gần 60% toàn bộ thị trƣờng enzyme thƣơng mại và thƣờng đƣợc sử dụng trong công nghiệp sản xuất chất tẩy rửa, da, dƣợc phẩm, thực phẩm, công nghệ sinh học và các ngành công nghiệp (Ramakrishna et al., 2010; Yin et al., 2013). Chúng c thể đƣợc thu nhận từ thực vật, động vật và vi sinh vật. Trong đ các vi sinh vật là nguồn sản xuất protease do sự đa dạng lớn về đặc điểm sinh h a lớn của chúng và khả năng cải biến di truyền dễ dàng. Đặc biệt, nhiều loài nấm sợi đã đƣợc khai thác ở quy mô công nghiệp để sản xuất các chất chuyển h a và các enzyme công nghiệp trong đ c protease. Nghiên cứu sinh tổng hợp protease từ vi sinh vật biển ở Việt Nam vẫn đang đƣợc tiến hành hơn thập niên qua, tuy nhiên những kết quả đạt đƣợc trong lĩnh vực này vẫn chƣa đáp ứng đƣợc việc mở rộng quy mô sản xuất và ứng dụng của nh m enzyme này trong đời sống. Vì vậy, việc tuyển chọn đƣợc chủng vi nấm biển c khả năng tổng hợp enzyme protease mạnh đ ng vai trò rất quan trọng, là cơ sở bƣớc đầu cho việc xác định tính chất và nghiên cứu khả năng ứng dụng của protease vào thực tế. Từ đ , chúng tôi tiến hành đề tài “Khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzyme protease của các chủng vi nấm ở vùng ven biển Khánh Hòa”. Mục tiêu của đề tài nhằm sàng lọc các chủng vi nấm biển c khả năng sinh tổng hợp protease ngoại bào, đã phân lập từ nƣớc biển ven bờ thuộc tỉnh Khánh Hòa và xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp protease của các chủng này, nhằm định hƣớng ứng dụng trong công nghiệp. Các phƣơng pháp nghiên cứu chính đã thực hiện bao gồm: Sàng lọc các chủng vi nấm biển c khả năng sinh enzyme protease ngoại bào sử dụng môi trƣờng CzapeckDox cải tiến c bổ sung cơ chất sữa gầy (Skim milk) 1%. Tuyển chọn đƣợc 10 chủng vi nấm c đƣờng kính phân giải cơ chất protein mạnh. Sau đ , xác định hoạt độ enzyme protease của các chủng này sử dụng phƣơng pháp Anson cải tiến để tuyển chọn ra một chủng vi nấm biển c hoạt tính protease cao nhất trong các chủng nghiên cứu. Định danh chủng vi nấm biển bằng phƣơng pháp quan sát hình thái, khuẩn lạc tế bào và giải trình tự đoạn gen ITS- 5,8S- ITS2. Khảo sát các điều kiện nuôi cấy tối ƣu về nhiệt độ, pH, nguồn cacbon, nguồn nitơ, thời gian nuôi cấy để chủng vi nấm biển cho hoạt tính protease cao nhất. Các khảo sát dựa trên tính kế thừa các điều kiện nuôi xii cấy thích hợp nhất của thí nghiệm trƣớc đ . Tất cả các thí nghiệm đều đƣợc lặp lại 3 lần, sau đ tính toán giá trị trung bình. Các số liệu thí nghiệm đƣợc xử lý và giá trị trung bình đƣợc so sánh dựa vào phân tích ANOVA và kiểm định Duncan (Duncan’s Multiple - Comparison Test) trên phần mềm SPSS 16 (SPSS Inc., Chicago, IL). Khác biệt c ý nghĩa tại giá trị p < 0,05. Kết quả bƣớc đầu cho thấy, sau khi sàng lọc hoạt tính protease của 160 chủng vi nấm biển từ bộ sƣu tập vi nấm biển của Nh m Nghiên cứu Vi sinh thuộc Viện Công nghệ Sinh học và Môi trƣờng, Trƣờng Đại học Nha Trang, chúng tôi đã chọn đƣợc 24 chủng nấm mốc c hoạt tính phân giải cơ chất protein trên tổng số 38 chủng nấm mốc, chiếm tỉ lệ 63,16%. Các chủng nấm men hầu nhƣ không c khả năng sinh hoạt tính protease. Trong 24 chủng nấm mốc chọn ra 10 chủng c hoạt tính protease cao nhất (c đƣờng kính >13 mm) để nghiên cứu tiếp theo. Từ 10 chủng nấm mốc xác định hoạt độ protease bằng phƣơng pháp Anson cải tiến, chúng tôi đã tuyển chọn ra đƣợc một chủng nấm mốc DW15M c khả năng sinh enzyme protease mạnh và ổn định nhất. Hoạt độ protease của chủng DW15M đạt 0,275 U/ml. Chủng DW15M c trình tự gen ITS1-5.8S-ITS2 tƣơng đồng từ 98,5- 99,5% với các chủng gần nhất của loài Simplicillium obclavatum và c các đặc điểm hình thái khuẩn lạc và hệ sợi nấm phù hợp với loài Simplicillium obclavatum, nên c thể thuộc về loài này. Điều kiện nuôi cấy thích hợp cho sinh tổng hợp enzyme protease cao nhất của chủng nấm mốc Simplicillium obclavatum DW15M trên môi trƣờng nuôi cấy lỏng là nhiệt độ 30C, pH 7,5, nguồn cacbon là 1% glucose và nguồn nitơ là 0,3% KNO3 + 0,3% casein. Trong điều kiện này hoạt độ protease đạt là 1,472 U/ml, gấp gần 6 lần so với hoạt độ ban đầu. Việc khảo sát khả năng sinh enzyme protease ngoại bào của các chủng vi nấm phân lập đƣợc g p phần phát triển bộ sƣu tập các chủng vi nấm biển c hoạt tính protease. Từ đ , cung cấp dữ liệu khoa học về các điều kiện nuôi cấy thích hợp cho sinh tổng hợp protease của vi nấm biển ở Việt Nam, đặc biệt là loài Simplicillium obclavatum. Đồng thời g p phần nhằm định hƣớng ứng dụng trong công nghiệp. Từ khóa luận văn: protein, protease, vi nấm biển, Vịnh Nha Trang, Vịnh Vân Phong xiii MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Protease là enzyme xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết peptide (-CO- NH-) của chuỗi polypeptide. Protease chiếm khoảng 60% thị trƣờng enzyme công nghiệp (Rao et al., 1998), trong đ , protease từ vi sinh vật chiếm khoảng 40% tổng số enzyme đƣợc bán trên toàn thế giới. Các chủng vi nấm biển đƣợc biết đến với khả năng sinh tổng hợp nhiều loại enzyme ngoại bào nhƣ amylase, lipase, protease và phytase…, trong đ enzyme protease đã đƣợc chứng minh c nhiều ứng dụng trong các chất tẩy rửa, chế biến da, thu hồi bạc, các mục đích y tế, chế biến thực phẩm, thức ăn, công nghiệp h a chất cũng nhƣ xử lý chất thải…Các chủng vi nấm biển c khả năng chịu đƣợc điều kiện môi trƣờng mặn tốt hơn so với các chủng vi nấm trên cạn và chúng đa dạng hơn, phong phú hơn. Nghiên cứu tổng hợp protease từ vi sinh vật ở Việt Nam vẫn đang đƣợc tiến hành hơn thập niên qua, tuy nhiên những kết quả đạt đƣợc trong lĩnh vực này vẫn chƣa đáp ứng đƣợc việc mở rộng quy mô sản xuất và ứng dụng của nh m enzyme này trong đời sống. Vì vậy, việc tuyển chọn đƣợc chủng vi nấm biển c khả năng tổng hợp enzyme protease đ ng vai trò rất quan trọng, là cơ sở bƣớc đầu cho việc xác định tính chất và nghiên cứu khả năng ứng dụng của protease vào thực tế. Do đ , chúng tôi tiến hành đề tài “Khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzyme protease của các chủng vi nấm ở vùng ven biển Khánh Hòa”. 2. Mục tiêu nghiên cứu Mục tiêu của đề tài nhằm sàng lọc các chủng vi nấm biển đã đƣợc phân lập từ vùng nƣớc ven biển thuộc tỉnh Khánh Hòa c khả năng sinh tổng hợp protease ngoại bào mạnh và xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp cho các chủng này, nhằm định hƣớng ứng dụng trong công nghiệp. 3. Nội dung nghiên cứu đề tài - Nội dung 1: Sàng lọc các chủng vi nấm biển phân lập ở vùng ven biển Khánh Hòa c khả năng sinh enzyme protease ngoại bào. 1 - Nội dung 2: Tuyển chọn các chủng vi nấm biển c hoạt độ protease cao nhất trong các chủng nghiên cứu. - Nội dung 3: Định danh chủng vi nấm biển bằng phƣơng pháp quan sát hình thái, khuẩn lạc tế bào và giải trình tự đoạn gen ITS - 5,8S- ITS2. - Nội dung 4: Khảo sát các điều kiện nuôi cấy thích hợp về nhiệt độ, pH, nguồn cacbon, nguồn nitơ, thời gian nuôi cấy để chủng vi nấm biển cho hoạt tính protease cao nhất. 4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 4.1. Ý nghĩa khoa học Việc khảo sát khả năng sinh enzyme protease ngoại bào của các chủng vi nấm phân lập đƣợc g p phần phát triển bộ sƣu tập các chủng vi nấm biển c hoạt tính protease. Từ đ , cung cấp dữ liệu khoa học về các điều kiện nuôi cấy thích hợp cho sinh tổng hợp protease của vi nấm biển ở Việt Nam, đặc biệt là loài Simplicillium obclavatum. 4.2. Ý nghĩa thực tiễn Kết quả của đề tài g p phần tuyển chọn chủng vi nấm biển c khả năng sinh enzyme protease mạnh và nhằm định hƣớng ứng dụng trong công nghiệp. 2 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về vi nấm biển Vi nấm biển là những loài vi nấm c nguồn gốc từ biển, hay do quá trình trôi dạt từ đất liền, nƣớc ngọt, qua quá trình thích nghi trở thành vi nấm biển (Jones et al., 2015). Vi nấm biển hiện nay c khoảng 1112 loài, 472 chi. Uớc tính ngành Ascomycota c 805 loài, 352 chi; ngành Basidiomycota c 21 loài, 17 chi; ngành Chytridiomycota c 26 loài, 13 chi; ngành Zygomycota c 3 loài, 2 chi; ngành Blastocladiomycota c 1 loài, 1 chi; nấm sợi sinh sản vô tính c 43 loài, 26 chi. Riêng đối với nấm men biển, ngành Ascomycota c 138 loài, 35 chi; ngành Basidiomycota 75 loài, 26 chi (Jone et al., 2015). Theo Jone và cs (2011), hiện nay gần 100000 loài nấm đã đƣợc mô tả, dự báo số lƣợng nấm biển c thể tăng lên đến 11000 – 12500 loài, và ƣớc tính khoảng 1000 loài mới đƣợc miêu tả mỗi năm. Theo Andreakis (2015), Thƣ viện Tài nguyên Sinh học của Viện Khoa học Hàng hải Úc (AIMS Bieresources Library) tổ chức một bộ sƣu tập hơn 7000 vi sinh vật, bao gồm 1781 nấm biển c nguồn gốc từ các nguồn khác nhau nhƣ động vật không xƣơng sống, trầm tích và nƣớc biển. Một số các công trình nghiên cứu ở thời điểm hiện tại cho thấy, vi nấm biển xuất hiện ở khắp mọi nơi trong đại dƣơng, từ cộng sinh với thực vật biển, sống ký sinh trên hải quỳ, san hô, bọt biển đến các mẫu trầm tích lẫn sống trôi nổi trên biển (vi nấm biển phù du) (Gao et al., 2010; Kaul et al., 2013; Lili et al., 2014; Blunt et al., 2014). Vi nấm biển đƣợc chứng minh là c vai trò quan trọng trong các chu trình sinh địa h a ở đại dƣơng, g p phần quan trọng trong xử lý ô nhiễm nguồn nƣớc biển và cung cấp chất khoáng cho các sinh vật khác, đồng thời c khả năng sinh enzyme ngoại bào c khả năng phân giải tốt các nguồn cơ chất khác nhau nhƣ protein, cellulose, chitin…, và nhiều ứng dụng khác trong công nghiệp, nông nghiệp nhƣ sản xuất cồn, baking và các nhiên liệu sinh học khác (Pang and Mitchell 2005; Hill et al., 2006; Matsushika et al., 2008; Gutiérrez et al.,, 2010; Kaul et al., 2013; Lili et al., 2014). Vi nấm biển đƣợc biết đến nhiều nhất với vai trò phân hủy các chất hữu cơ và đ ng vai trò quan trọng trong việc tái tạo chất dinh dƣỡng trong các hệ sinh thái. Các nấm sợi phù du c thể làm tăng đáng kể hàm lƣợng khoáng trong nƣớc bằng việc phân hủy các hợp chất hữu cơ (Tisdall and Oades, 1982; Damare and Raghukumar, 2008) và do đ đem lại lợi ích cho sự phát triển của các cộng đồng vi sinh vật phù du 3 (Kirowboe and Jackson, 2001; Gutiérrez et al., 2010). Theo Kaul và cs (2013), vi nấm biển c khả năng sản xuất các hợp chất c hoạt tính sinh học nhƣ terpenoid, steroid, quinon, phenol và coumarin c tiềm năng trong chống ung thƣ, chống oxy h a, các hợp chất kháng virus và côn trùng cho ngành công nghiệp dƣợc phẩm và hoá chất nông nghiệp. Một nghiên cứu khác của Lili và cs (2014), vi nấm biển cũng c khả năng sinh enzyme ngoại bào khác nhau nhƣ laccase, lipase, cellulaza và đ ng vai trò tích cực của chúng trong chu trình sinh thái của các hệ sinh thái ven biển. Hơn 60% trong số 456 sản phẩm tự nhiên mới của vi sinh vật biển đƣợc báo cáo trong 2012, đã đƣợc tìm thấy sản sinh bởi nấm (Blunt et al., 2014). Nấm cũng chiếm số lƣợng cao nhất trong số các hợp chất mới đƣợc báo cáo từ các vi sinh vật liên quan đến bọt biển trong những thập kỷ qua (Thomas et al., 2010; Blunt et al., 2014). Nấm biển phù du bao gồm nấm sợi, nấm men và các sinh vật đơn bào giống nấm, là một bộ phận quan trọng của sinh quyển (Wang and Johnson 2009; Gao et al., 2010) và c một hệ sinh thái riêng biệt với vi khuẩn (Kaul et al., 2013). Đại dƣơng đƣợc coi nhƣ một “hồ lớn” của đa dạng sinh học. Hệ vi sinh vật trong môi trƣờng biển c mối quan hệ chặt chẽ với nhau, đ ng vai trò quan trọng trong các chu kỳ tuần hoàn vật chất. Vi sinh vật phân hủy xác chết và phân hủy chất hữu cơ. Vi nấm biển c thể đƣợc coi là một nguồn enzyme c lợi cho công nghiệp và xử lý ô nhiễm môi trƣờng. Các chủng vi nấm phân lập từ các nguồn khác nhau, chẳng hạn nhƣ động vật không xƣơng sống, gỗ mục nát, nƣớc biển, trầm tích và rừng ngập mặn, là một tiềm năng lớn để sản xuất enzyme thủy phân và các hợp chất oxy h a. Các loại enzyme đƣợc tổng hợp từ vi nấm biển nhƣ alginate lyase, amylase, cellulase, chitinase, glucosidase, inulinase, keratinase, ligninase, lipase, nuclease, phytase, protease và xylanase ... Những enzyme này hoạt động trong điều kiện nhiệt độ từ 350C đến 700C và pH từ 3.0 đến 11.0. Enzyme từ vi nấm biển đƣợc sản xuất bằng cách lên men ở trạng thái nuôi lỏng. Trong quá trình sàng lọc đã thu đƣợc một số chủng vi nấm biển c khả năng sinh hoạt tính enzyme chịu kiềm và chịu lạnh và độ mặn. Khả năng sinh tổng hợp của vi nấm biến đƣợc coi là một chiến lƣợc tiềm năng trong lĩnh vực công nghệ sinh học biển (Rafaella, 2015). Smitha và cs (2013) đã thực hiện một công trình nhằm nghiên cứu tiềm năng của nấm biển nhƣ một nguồn enzyme và kháng sinh. Nấm biển (181 loài) đƣợc phân lập từ trầm tích lục địa của biển Ả Rập trong chuyến thám hiểm biển của FORV Sagar 4 Sampada đã đƣợc sử dụng cho nghiên cứu này đƣợc thể hiện trong hình 1.1. Trong 181 chủng này c 60,2% nấm cho thấy hoạt tính lipase, 67,22% cho thấy hoạt tính amylase, 61,11% thể hiện hoạt tính gelatinase, 40,22% cho thấy hoạt tính chitinase và 43,33% cho thấy hoạt tính cellulase. Trong số 181 chủng biểu hiện hoạt tính enzyme, 12,2% sản sinh tất cả 5 loại enzyme đƣợc khảo sát. Hầu hết nấm biển thể hiện hoạt tính các enzyme protease, amylase và lipase. Những chủng phân lập sản xuất lipase nhiều hơn cả là Penicillium (37%), Aspergillus (32,5%) và Scopulariopsis (14,5%). Sản sinh amylase nhiều hơn cả với Penicilium (39,8%), Aspergillus (22,6%) và Scopulariopsis (22,4%). Penicillium (30,4%) và Aspergillus (26%) chiếm ƣu thế trong sản xuất gelatinase. Hình 1.1 Tỉ lệ phần trăm vi nấm biển thể hiện khả năng sản xuất enzyme (Smitha et al., 2014) Theo thống kê c khoảng 90% nhiên liệu sinh học bắt nguồn từ vi sinh vật biển. Và vi nấm biển đƣợc xem nhƣ là nguồn sản xuất ra những sản phẩm mới tự nhiên nhƣ các sản phẩm từ sự lên men, sự lọc sinh học và hợp chất điều trị bệnh. Hơn 60% của 456 sản phẩm tự nhiên của vi sinh vật biển đƣợc ghi nhận vào năm 2012 thì đƣợc sản xuất bởi vi nấm (Nikos et al,, 2015). 5 Tải về bản full